Generazione e imaging di organoidi epiteliali di topo e umani da tessuto mammario normale e tumorale senza passaggio

Riepilogo

Questo protocollo discute un approccio per generare organoidi epiteliali dal tessuto mammario primario normale e tumorale attraverso la centrifugazione differenziale. Inoltre, sono incluse istruzioni per la coltura tridimensionale e l'imaging immunofluorescente di organoidi incorporati.

Abstract

Gli organoidi sono un metodo affidabile per modellare il tessuto degli organi grazie alle loro proprietà auto-organizzanti e alla conservazione della funzione e dell'architettura dopo la propagazione dal tessuto primario o dalle cellule staminali. Questo metodo di generazione di organoidi rinuncia alla differenziazione di singole cellule attraverso passaggi multipli e utilizza invece la centrifugazione differenziale per isolare organoidi epiteliali mammari da tessuti dissociati meccanicamente ed enzimaticamente. Questo protocollo fornisce una tecnica semplificata per produrre rapidamente organoidi epiteliali piccoli e grandi sia dal tessuto mammario di topo che da quello umano, oltre alle tecniche per l'incorporazione di organoidi nel collagene e nella matrice extracellulare basale. Inoltre, vengono fornite istruzioni per la fissazione in gel e la colorazione immunofluorescente allo scopo di visualizzare la morfologia e la densità degli organoidi. Queste metodologie sono adatte per una miriade di analisi a valle, come la co-coltura con cellule immunitarie e la modellazione di metastasi ex vivo tramite il saggio di invasione del collagene. Queste analisi servono a chiarire meglio il comportamento cellula-cellula e creare una comprensione più completa delle interazioni all'interno del microambiente tumorale.

Introduzione

La capacità di modellare le cellule epiteliali in vitro è stata il fondamento della moderna ricerca biomedica perché cattura caratteristiche cellulari che non sono accessibili in vivo. Ad esempio, la crescita di linee cellulari epiteliali in un piano bidimensionale può fornire una valutazione dei cambiamenti molecolari che si verificano in una cellula epiteliale durante la proliferazione¹. Inoltre, la misurazione della regolazione dinamica tra segnalazione ed espressione genica è limitata nei sistemi in vivo ². Nella ricerca sul cancro, la modellazione della linea cellulare epiteliale del cancro ha permesso l'identificazione dei driver molecolari della progressione della malattia e dei potenziali bersagli farmacologici³. Tuttavia, la crescita di linee cellulari epiteliali tumorali su un piano bidimensionale ha dei limiti, poiché la maggior parte sono geneticamente immortalate e modificate, spesso di natura clonale, selezionate per la loro capacità di crescere in condizioni non fisiologiche, limitate nella loro valutazione dell'architettura tridimensionale (3D) del tessuto tumorale e non modellano adeguatamente le interazioni del microambiente all'interno di un ambiente tissutale realistico⁴. Questi vincoli sono particolarmente evidenti nella modellazione delle metastasi, che in vivo include diverse fasi biologiche distinte, tra cui invasione, disseminazione, circolazione e colonizzazione nel sito dell'organo distante⁵.

Gli organoidi epiteliali del cancro sono stati sviluppati per ricapitolare meglio l'ambiente 3D e il comportamento dei tumori ^6,7,8. Gli organoidi sono stati inizialmente sviluppati da singole cellule della cripta intestinale LRG5+ e differenziati per rappresentare la struttura 3D delle unità crypt-villus che hanno mantenuto la struttura gerarchica dell'intestino tenue in vitro⁹. Questo approccio ha permesso la visualizzazione in tempo reale e la caratterizzazione dell'architettura tissutale auto-organizzante in condizioni omeostatiche e di stress. Come estensione naturale, gli organoidi epiteliali del cancro sono stati sviluppati per modellare molti diversi tipi di cancro, tra cui colorettale 10, pancreatico 11, seno¹², fegato 13, polmone 14, cervello 15 e tumori gastrici ¹⁶. Gli organoidi epiteliali del cancro sono stati sfruttati per caratterizzare l'evoluzione del cancro^17,18 e i comportamenti spazio-temporali metastatici ^19,20 e interrogare l'eterogeneità tumorale 21 e testare le chemioterapie ²². Gli organoidi epiteliali del cancro sono stati anche isolati e raccolti durante gli studi clinici in corso per prevedere la risposta del paziente agli agenti antitumorali e alla radioterapia ex vivo 8,23,24,25. Inoltre, i sistemi che incorporano organoidi epiteliali tumorali possono essere combinati con altre cellule non tumorali, come le cellule immunitarie, per formare un modello più completo del microambiente tumorale per visualizzare le interazioni in tempo reale, scoprire come le cellule epiteliali tumorali cambiano la natura fondamentale delle cellule immunitarie effettrici citotossiche come le cellule natural killer e testare potenziali immunoterapie e attività citotossica anticorpo-farmaco dipendente^{26, 27,28}. Questo articolo dimostra un metodo per generare organoidi epiteliali senza passare e incorporare nel collagene e nella matrice extracellulare basale (ECM). Inoltre, vengono condivise anche tecniche per l'imaging a valle di organoidi isolati.

Protocollo

Tutti i tessuti di topo utilizzati in questo manoscritto sono stati raccolti eticamente in conformità con i regolamenti e le linee guida dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Texas Southwestern Medical Center. Allo stesso modo, tutti i pazienti hanno acconsentito prima della donazione di tessuti sotto la supervisione di un Institutional Review Board (IRB) e i campioni sono stati deidentificati.

NOTA: Questo protocollo descrive la generazione di organoidi dal tessuto primario.

1. Preparazione notturna dei materiali

1. Per l'incorporazione nella matrice extracellulare basale (BECM), scongelare l'aliquota BECM lasciandola a 4 °C.

2. Preparazione della soluzione di rivestimento di collagenasi e albumina sierica bovina (BSA)

1. Preparare una soluzione di rivestimento BSA/PBS al 2,64% (soluzione BSA): filtro sterile 50 mL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e 4,10 ml di soluzione BSA al 30% utilizzando un matraccio filtrante da 50 ml/0,2 μm. Questa soluzione BSA può essere filtrata e riutilizzata.
2. Preparare la soluzione di collagenasi per il tessuto mammario del topo: filtro sterile 27 mL di terreno basocellulare, 1,5 mL di siero fetale bovino (FBS), 30 μL di 50 mg/mL di gentamicina, 15 μL di 10 mg/mL di insulina, 600 μL di 0,1 g/mL di collagenasi A e 600 μL di 0,1 g/mL di tripsina utilizzando un matraccio filtrante da 50 ml/0,2 μm. Allocare tra 10 ml e 30 ml di soluzione di collagenasi per topo, a seconda della massa tissutale.
3. Preparare la soluzione di collagenasi per il tessuto mammario umano: filtro sterile 18 mL di RPMI-1640, 200 μL di soluzione 100x di penicillina-streptomicina (penna/streptococco), 200 μL di 10 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES) tampone, 1 mL di FBS e 400 μL di 0,1 g/mL di collagenasi A utilizzando un matraccio filtrante da 50 ml/0,2 μm. Allocare tra 10 ml e 20 ml per campione di tessuto, a seconda della massa tissutale.

3. Preparazione dei supporti

1. Preparare i mezzi organoidi: mezzo filtrante a cellule basali sterili con penna/streptococco all'1% e insulina-transferrina-selenio (ITS) all'1% utilizzando un matraccio filtrante da 50 ml/0,2 μm. Per produrre un fattore di crescita organoide, aggiungere il fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF) a una concentrazione finale di 2,5 nM.
2. Preparare i mezzi epiteliali mammari: per produrre 100 ml di mezzi epiteliali mammari, filtro sterile mezzo basale comune ad alto contenuto di glucosio con 1 ml di integratore di glutammina 100x, 1 ml di penna/streptococco, 1 ml di tampone HEPES da 10 mM (7,3 pH), 250 μL di 30% di stock di BSA, 1 μL di 1 mg/mL di stock di tossine colerarie, 1 mL di 50 μg/mL di stock di idrocortisone in PBS, 50 μL di soluzione insulinica umana da 10 mg/ml, 10 μL di 50 μg/mL di fattore di crescita epidermico (EGF) e 1% FBS utilizzando un matraccio filtrante da 150 ml/0,2 μm. Conservare il supporto a 4 °C e utilizzarlo per un massimo di 2 settimane.
3. Preparare il lavaggio con amfotericina: filtro sterile PBS con penna/streptococco al 2% e amfotericina B al 2%. Conservare a 4 °C.

4. Raccolta e digestione dei tessuti

1. Tessuto mammario del topo
   1. Eutanasia del topo mettendo in una camera CO 2 per_2-5 minuti, e poi seguire con la lussazione cervicale. Con il lato ventrale rivolto verso l'alto, allargare gli arti del topo e utilizzare quattro aghi da 19 G per fissare il topo per le zampe a una tavola coperta da un cuscinetto assorbente. Spruzzare con etanolo al 70% per levigare il pelo e igienizzare la pelle. Pulire le feci con una garza o un fazzoletto.
   2. A partire appena sopra la regione anogenitale, tagliare verso l'alto dalla linea mediana usando le forbici chirurgiche, facendo attenzione a non perforare il peritoneo. Dopo aver raggiunto il mento, effettuare tagli laterali su entrambe le clavicole e le zampe posteriori e appuntare la pelle del topo tesa alla tavola per esporre i cuscinetti di grasso mammario.
   3. Localizzare i cuscinetti di grasso mammario inguinale su topi selvatici identificando il linfonodo inguinale situato vicino agli arti posteriori. Localizzare i cuscinetti di grasso mammario toracico su topi selvatici come il tessuto più spesso e vascolarizzato sotto gli arti anteriori.
   4. Utilizzare una pinza per elevare il cuscinetto di grasso mammario. Evitare di raccogliere il muscolo sottostante. Usando l'estremità smussata delle forbici affilate, crea una tasca sotto il cuscinetto di grasso mammario, lontano dalla pelle. Tagliare via il cuscinetto di grasso mammario in un unico pezzo.
   5. Una volta rimossi i cuscinetti di grasso mammario, sciacquare in PBS prima di metterli in un piatto di coltura di tessuto sterile. Trasferire rapidamente a una cappa di coltura tissutale.
      NOTA: Per i tumori mammari, utilizzare un batuffolo di cotone bagnato con PBS per far rotolare delicatamente il tumore lontano dalla pelle. Assicurati di evitare aree scure o morbide, poiché lo scolorimento scuro indica necrosi, che non produrrà organoidi sani.
   6. Tritare i tumori mammari con un bisturi # 10 o # 11 per allentare il tessuto fino a raggiungere una consistenza pastosa. Trasferire il tessuto tritato in un tubo conico contenente 10-30 ml di soluzione di collagenasi usando un bisturi. Per garantire che tutto il tessuto venga raccolto, pipettare 1 mL di soluzione di collagenasi sulla piastra di coltura tissutale e di nuovo nel tubo conico.
      NOTA: Per produrre organoidi più grandi, la digestione meccanica dovrebbe essere ridotta al minimo, lasciando intatti alcuni piccoli pezzi visibili di tessuto. In alternativa, il tessuto può essere conservato congelato per una successiva preparazione di organoidi con una perdita minima di vitalità. Per fare ciò, lavare il tessuto in una soluzione di PBS o media cellulare basale + 1% FBS, quindi tritare grossolanamente per aumentare la superficie (mantenendo il tessuto in uno o due pezzi solidi). Spostare il tessuto in una criofiala, coprire con mezzi di congelamento (90% FBS + 10% dimetil solfossido (DMSO)). Congelare i flaconcini in un contenitore di congelamento a velocità controllata per una notte prima di passare allo stoccaggio in azoto liquido.
   7. Posizionare il tubo conico in un'incubatrice da banco a 37 °C a 180 RPM fino a quando il tessuto diventa stopposo e la soluzione di collagenasi diventa torbida. Ad esempio, una grande massa tissutale (circa 500-800 mg) da un tumore richiede 30-60 minuti. Una massa tissutale più piccola (circa 100-300 mg) da cuscinetti di grasso mammario selvatico richiede circa 20-30 minuti. In caso di dubbi, controllare a intervalli di 5 minuti.
   8. Dopo l'incubazione, centrifugare il tubo conico per 10 minuti a 550 x g a temperatura ambiente (RT).
   9. Aspirare con attenzione il surnatante dal tubo conico.
      NOTA: Andando avanti, pre-rivestire tutte le punte delle pipette, i pipelli sierologici e i tubi conici con la soluzione BSA per evitare la perdita di organoidi dovuta all'adesione alla plastica.
   10. Aggiungere 8 mL di mezzo basocellulare e 80 μL di soluzione di DNasi [2 U/μL] al tubo. Capovolgere delicatamente per 1-3 minuti.
   11. Aggiungere 12 mL di media cellulare basale al tubo e mescolare accuratamente mediante pipettaggio o ruotare delicatamente il tubo 15 volte per miscelare.
   12. Centrifugare per 10 minuti a 550 x g a RT.
   13. Aspirare il surnatante e quindi risospendere il pellet in 12 ml di media basocellulare.
   14. Lascia che i frammenti di tessuto più pesanti si depositino sul fondo. Raccogliere il surnatante con un pipet sierologico e trasferirlo in un tubo conico da 15 ml. Questa sospensione contiene organoidi epiteliali e cellule stromali/immunitarie.
2. Tessuto mammario umano
   1. Elaborare i campioni di tessuto mammario umano per organoidi o conservarli entro 24 ore dalla raccolta. Conservare i campioni a 4 °C in terreni CO_{2-indipendenti} con antibiotico-antimicotico 100x all'1%.
   2. Trasferire il tessuto in una piastra di coltura tissutale. Inclinare la piastra e aspirare il supporto di conservazione in eccesso, quindi risciacquare il fazzoletto con 5 ml di lavaggio con amfotericina B. Rimuovere immediatamente il lavaggio dell'amfotericina B.
   3. Tritare il campione di tessuto con un bisturi #10 o #11 per allentare il tessuto fino a raggiungere una consistenza pastosa. Trasferire il tessuto tritato in un tubo conico contenente 10-30 ml di soluzione di collagenasi usando un bisturi. Per garantire che tutto il tessuto sia raccolto, pipettare 1 mL di soluzione di collagenasi sulla piastra di coltura tissutale e tornare al tubo conico.
      NOTA: Per produrre organoidi più grandi, la digestione meccanica dovrebbe essere ridotta al minimo, lasciando intatti alcuni piccoli pezzi visibili di tessuto. La massa tissutale iniziale per questo protocollo variava tra 100-250 mg. In alternativa, il tessuto può essere conservato congelato per la successiva preparazione di organoidi con una minima perdita di vitalità dopo la fase 4.2.2 in 90% FBS + 10% DMSO come sopra.
   4. Posizionare il tubo conico in un'incubatrice da banco a 37 °C a 180 giri/min fino a quando il tessuto diventa più piccolo e la collagenasi diventa torbida. Controllare il tessuto ad intervalli di 5 minuti. La dissociazione della collagenasi dei campioni umani richiede circa 5-20 minuti.
   5. Dopo l'incubazione, ruotare lungo il tubo conico per 10 minuti a 550 x g a RT.
   6. Aspirare con attenzione il surnatante dal tubo conico.
      NOTA: Andando avanti, pre-rivestire tutte le punte delle pipette, i pipì sierologici e i tubi conici con soluzione BSA per evitare la perdita di organoidi dovuta all'adesione alla plastica.
   7. Aggiungere 4 mL di mezzo basocellulare e 40 μL di soluzione di DNasi [2 U/μL] al tubo conico. Capovolgere delicatamente per 3 minuti.
   8. Aggiungere 6 mL di media a cellule basali al tubo e miscelare accuratamente mediante pipettaggio o ruotare delicatamente il tubo conico 15 volte per miscelare.
   9. Centrifugare per 10 minuti a 550 x g a RT.
   10. Aspirare il surnatante e quindi risospendere il pellet in 10 ml di mezzi basocellulari.
   11. Lascia che i frammenti di tessuto più pesanti si depositino sul fondo. Raccogliere il surnatante e trasferirlo in un tubo conico da 15 ml. Questa sospensione contiene organoidi epiteliali e cellule stromali/immunitarie.

5. Centrifugazione differenziale

1. Pulsare a 550 x g per 3-4 s a RT, aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di terreno basocellulare. Ripeti questo passaggio altre tre volte (per un totale di quattro giri).
2. Dopo ogni centrifugazione, assicurarsi che il pellet diventi sempre più opaco. Questo pellet rimanente sarà organoidi epiteliali.

6. Raccolta di piccoli organoidi

1. Pulsare a 80-100 x g per 3 s a RT. Raccogliere il surnatante in un tubo fresco rivestito di BSA, quindi pulsare a 550 x g per 3 s a RT per pellettare i piccoli organoidi.

7. Incorporazione di organoidi in BECM

1. Aliquot sospensione appropriata di organoidi in provette da microcentrifuga in base alla densità degli organoidi rispetto alla quantità di BECM per pozzetto (tabella 1). Ad esempio, utilizzare 50-100 organoidi per 20 μL di BECM in un pozzetto di una piastra da 96 pozzetti.
   NOTA: La densità degli organoidi può essere contata utilizzando la seguente formula: ((Numero medio di organoidi)/50 μL) x fattore di diluizione.
2. Esegui tutti i passaggi sul ghiaccio. Posizionare il BECM scongelato sul ghiaccio in una cappa di coltura di tessuti. Durante la preparazione della cappa, posizionare tutte le punte delle pipette sul ghiaccio per raffreddare.
3. Centrifugare le provette da microcentrifuga per 10 minuti a 300 x g a RT. Eliminare il surnatante dalle provette. Spostare i tubi con pellet organoidi sul ghiaccio e aggiungere il volume appropriato di BECM a ciascuna provetta di microcentrifuga (Tabella 1).
   NOTA: Poiché BECM è viscoso, aggiungere volumi aggiuntivi (circa il 10% -20% in più del volume della cupola) di BECM per tenere conto della perdita nella punta del pipet.
4. Pipettare delicatamente su e giù per risospendere gli organoidi in BECM, facendo attenzione a non produrre bollicine.
5. Pipettare lentamente e con attenzione gli organoidi sospesi BECM sulla superficie di placcatura. Durante il pipettaggio, sollevare lentamente la pipetta per creare una cupola. Riempi tutti i pozzi vuoti con PBS per mantenere l'umidità.
6. Porre la piastra in un incubatore a 37 °C per 1 ora per consentire al BECM di solidificarsi, quindi coprire con il volume appropriato di mezzo (Tabella 1).

8. Incorporazione di organoidi nel collagene

1. Esegui tutti i passaggi sul ghiaccio. Preparare la soluzione di collagene combinando, in ordine sequenziale, 375 μL di 10x DMEM, 100 μL di idrossido di sodio 1 N (NaOH) e 3 mL di soluzione di collagene I a coda di ratto in un tubo conico da 15 ml. Miscela di pipette, facendo attenzione a non fare bolle. Titolare la soluzione a un pH di 7,2-7,4 con piccole quantità (incrementi di 1-3 μL) di NaOH o 10x DMEM secondo necessità.
2. Rivestire il fondo dei pozzetti con la quantità minima di collagene necessaria per coprire completamente il fondo del pozzo. Un approccio è quello di posizionare una piccola quantità di collagene e scuotere il piatto da un lato all'altro per rivestire. Lasciare che i sottostrati di collagene si stabilizzino a 37 °C per 30 min-2 h.
3. Aliquot la sospensione appropriata di organoidi in provette da microcentrifuga in base alla densità degli organoidi rispetto alla quantità di collagene per pozzetto (Tabella 1). Collocare in un'incubatrice a 37 °C.
4. Conservare la soluzione di collagene a 4 °C e monitorare la polimerizzazione controllando la formazione di fibre al microscopio ogni 10 minuti. Il collagene raggiungerà una polimerizzazione appropriata tra 30 min-2 h.
   NOTA: La corretta polimerizzazione può essere determinata dalla presenza di fibre ramificate in tutta la matrice. Procedere immediatamente al punto 8.5 una volta osservate alcune fibre nel campo visivo.
5. Centrifugare le provette da microcentrifuga a 300 x g per 10 minuti a RT. Eliminare il surnatante dalle provette. Spostare i pellet organoidi sul ghiaccio e aggiungere il volume appropriato di collagene a ciascuna provetta di microcentrifuga (Tabella 1).
   NOTA: Poiché il collagene è viscoso, aggiungere ulteriori volumi (circa il 10% -20% in più del volume della cupola) di collagene per tenere conto della perdita nella punta del pipet.
6. Pipettare delicatamente su e giù per risospendere gli organoidi nel collagene, facendo attenzione a non produrre bolle.
7. Pipettare lentamente e con attenzione gli organoidi sospesi al collagene sulla superficie di placcatura. Durante il pipettaggio, sollevare lentamente la pipetta per creare una cupola. Riempi tutti i pozzi vuoti con PBS per mantenere l'umidità.
8. Posizionare la piastra in un incubatore a 37 °C per 1 ora per consentire al collagene di solidificarsi, quindi coprire con il volume appropriato di terreno (Tabella 1).
9. NOTA: Gli organoidi mantengono la vitalità nella matrice 3D per un massimo di 7 giorni. Se l'imaging viene utilizzato per l'analisi, procedere ai passaggi 9 e 10.

9. Fissaggio degli organoidi incorporati

1. Utilizzare una pipetta per rimuovere tutti i fluidi dai pozzetti senza entrare in contatto con le cupole ECM.
2. Fissare con una soluzione di paraformaldeide (PFA)/PBS al 4% per 5 minuti.
3. Lavare due o tre volte applicando PBS ai pozzetti dopo averli posizionati su uno shaker a movimento lento. Dopo i lavaggi, applicare PBS fresco sulle cupole e conservare la piastra a 4 °C.

10. Colorazione immunofluorescente di organoidi incorporati

1. Preparazione di soluzioni per la colorazione immunofluorescente
   1. Tampone di permeabilizzazione: preparare una soluzione PBS con Triton X-100 al 10%.
   2. Buffer di blocco: preparare una soluzione PBS con 10% FBS e 0,2% Triton X-100.
   3. Tampone anticorpale: preparare una soluzione PBS con 2% FBS e 0,2% Triton X-100.
2. Permeabilizzazione e blocco
   1. Pipetta sufficiente tampone di permeabilizzazione per coprire le cupole ECM. Incubare per 1 ora a RT su uno shaker che si muove lentamente.
   2. Rimuovere il tampone di permeabilizzazione con una pipetta e applicare lo stesso volume di tampone bloccante per 3 ore.
3. Incubazione di anticorpi primari
   1. Rimuovere il tampone bloccante con una pipetta e applicare il tampone anticorpale contenente l'anticorpo primario alle concentrazioni specificate dal produttore. Incubare il campione a 4 °C per 12-16 ore su un agitatore a movimento lento.
   2. Rimuovere la soluzione anticorpale primaria e lavare i campioni tre volte per 10 minuti con PBS a RT su uno shaker che si muove lentamente.
4. Incubazione di anticorpi secondari e colorazione nucleare
   1. Aspirare il lavaggio PBS rimanente e applicare il tampone anticorpale contenente anticorpi secondari alle concentrazioni specificate dal produttore. Inoltre, aggiungere DAPI o Hoechst (per etichettare i nuclei) o falloidina (per etichettare l'actina) al tampone con un rapporto 1:250. Incubare per 2-4 ore a RT su uno shaker che si muove lentamente.
   2. Rimuovere la soluzione anticorpale secondaria e lavare i campioni tre volte per 10 minuti in PBS a RT su uno shaker. Conservare i campioni in PBS a 4 °C fino all'imaging.

Risultati

Le immagini presenti nella Figura 1 forniscono un esempio di organoidi epiteliali mammari wild-type e tumorali provenienti da tessuti umani e murini. Un'illustrazione a colpo d'occhio del metodo per isolare gli organoidi epiteliali attraverso la centrifugazione differenziale è fornita nel flusso di lavoro del fumetto nella Figura 1A, che mostra che i tessuti primari di specie diverse possono essere trattati in modi quasi identici mentre producono tessuto epitel...

Discussione

Diversi metodi sono stati descritti in letteratura per generare organoidi tumorali. Questo protocollo evidenzia un metodo per generare organoidi tumorali direttamente dal tumore senza passare. Utilizzando questo metodo, gli organoidi tumorali sono producibili entro poche ore dall'inizio della procedura e generano quasi il 100% di organoidi vitali rispetto al 70% riportato in letteratura³¹. In confronto, altri metodi richiedono il passaggio seriale delle cellule in organoidi per diverse settimane. ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mM HEPES Buffer	Gibco	15630080
100x Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-096
100x Glutamax	Life Technologies	35050-061	Glutamine supplement
100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)	Life Technologies	51500-056
100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Sigma	P4333
10x DMEM	Sigma	D2429
50 mL/0.2 µm filter flask	Fisher	#564-0020
Amphotericin B	Life Technologies	15290-018
bFGF	Sigma	F0291
BSA Solution (32%)	Sigma	#A9576
Cholera Toxin	Sigma	C8052
CO2-Independent Medium	Gibco	18045-088
Collagenase A	Sigma	C2139
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase)	Sigma	D4263
DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture	Sigma	D6546	Common basal medium
D-MEM/F12	Life Technologies	#10565-018	Basal cell medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Sigma	#D8662	PBS
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	#F0926
Gentamicin	Life Technologies	#15750-060
Human epidermal growth factor (EGF)	Sigma	E9644
Hydrocortisone	Sigma	H0396
Insulin	Sigma	#I9278
Matrigel	Corning	#354230	Basement Extracellular Matrix (BECM)
NaOH (1 N)	Sigma	S2770
Rat Tail Collagen I	Corning	354236
RPMI-1640 media	Fisher	SH3002701
Trypsin	Life Technologies	27250-018