Erzeugung und Bildgebung von Epithelorganoiden von Mäusen und Menschen aus normalem und Tumor-Brustgewebe ohne Passaging

Zusammenfassung

In diesem Protokoll wird ein Ansatz zur Erzeugung von Epithelorganoiden aus primärem Normal- und Tumorbrustgewebe durch differentielle Zentrifugation erörtert. Darüber hinaus sind Anleitungen für die dreidimensionale Kultivierung sowie die Immunfluoreszenz-Bildgebung von eingebetteten Organoiden enthalten.

Zusammenfassung

Organoide sind aufgrund ihrer selbstorganisierenden Eigenschaften und der Beibehaltung von Funktion und Architektur nach der Vermehrung aus Primärgewebe oder Stammzellen eine zuverlässige Methode zur Modellierung von Organgewebe. Diese Methode der Organoiderzeugung verzichtet auf die Einzelzelldifferenzierung durch mehrere Passagen und verwendet stattdessen eine differentielle Zentrifugation, um Brustepithel-Organoide aus mechanisch und enzymatisch dissoziierten Geweben zu isolieren. Dieses Protokoll bietet eine optimierte Technik zur schnellen Herstellung kleiner und großer Epithelorganoide aus Maus- und menschlichem Brustgewebe sowie Techniken zur Einbettung von Organoiden in Kollagen und extrazelluläre Basalmatrix. Darüber hinaus werden Anweisungen zur In-Gel-Fixierung und Immunfluoreszenzfärbung bereitgestellt, um die Morphologie und Dichte der Organoide sichtbar zu machen. Diese Methoden eignen sich für unzählige nachgelagerte Analysen, wie z. B. die Kokultivierung mit Immunzellen und die Ex-vivo-Metastasenmodellierung mittels Kollageninvasionsassay. Diese Analysen dienen dazu, das Zell-Zell-Verhalten besser aufzuklären und ein vollständigeres Verständnis der Wechselwirkungen innerhalb der Tumormikroumgebung zu schaffen.

Einleitung

Die Fähigkeit, Epithelzellen in vitro zu modellieren, war die Grundlage der modernen biomedizinischen Forschung, da sie zelluläre Merkmale erfasst, die in vivo nicht zugänglich sind. Zum Beispiel kann das Züchten von Epithelzelllinien in einer zweidimensionalen Ebene eine Beurteilung der molekularen Veränderungen liefern, die in einer Epithelzelle während der Proliferation auftreten¹. Darüber hinaus ist die Messung der dynamischen Regulation zwischen Signalübertragung und Genexpression in In-vivo-Systemen ² begrenzt. In der Krebsforschung hat die Modellierung von Krebsepithelzelllinien die Identifizierung molekularer Treiber des Krankheitsverlaufs und potenzieller Wirkstoffziele ermöglicht³. Das Züchten von Krebsepithelzelllinien auf einer zweidimensionalen Ebene hat jedoch Grenzen, da die meisten genetisch immortalisiert und modifiziert sind, oft klonaler Natur, aufgrund ihrer Fähigkeit, unter nicht-physiologischen Bedingungen zu wachsen, ausgewählt wurden, in ihrer Beurteilung der dreidimensionalen (3D) Tumorgewebearchitektur begrenzt sind und Mikroumgebungsinteraktionen in einer realistischen Gewebeumgebung nicht angemessen modellieren⁴. Diese Einschränkungen zeigen sich besonders deutlich bei der Modellierung der Metastasierung, die in vivo mehrere verschiedene biologische Stadien umfasst, einschließlich Invasion, Verbreitung, Zirkulation und Kolonisierung an der entfernten Organstelle⁵.

Krebsepithel-Organoide wurden entwickelt, um die 3D-Umgebung und das Verhalten von Tumoren besser zu rekapitulieren ^6,7,8. Organoide wurden zunächst aus einzelnen LRG5+ intestinalen Kryptenzellen entwickelt und differenziert, um die 3D-Struktur von Krypten-Zotten-Einheiten darzustellen, die die hierarchische Struktur des Dünndarms in vitro beibehalten ⁹. Dieser Ansatz ermöglichte die Echtzeit-Visualisierung und Charakterisierung der selbstorganisierenden Gewebearchitektur unter homöostatischen und Stressbedingungen. Als natürliche Erweiterung wurden Krebsepithel-Organoide entwickelt, um viele verschiedene Krebsarten zu modellieren, darunter Darmkrebs¹⁰, Bauchspeicheldrüse^{11, Brust 12}, Leber 13, Lunge 14, Gehirn 15 und Magenkrebs ¹⁶. Krebsepithel-Organoide wurden genutzt, um die Krebsevolution^17,18 und metastasiertes raumzeitliches Verhalten ^19,20 zu charakterisieren und die Tumorheterogenität 21 zu untersuchen und Chemotherapien^{zu testen 22}. Krebsepithel-Organoide wurden auch isoliert und während laufender klinischer Studien gesammelt, um das Ansprechen von Patienten auf Krebsmedikamente und Strahlentherapie ex vivo vorherzusagen 8,23,24,25. Darüber hinaus können Systeme, die Krebsepithel-Organoide enthalten, mit anderen Nicht-Krebszellen, wie z. B. Immunzellen, kombiniert werden, um ein umfassenderes Modell der Tumormikroumgebung zu bilden, um Interaktionen in Echtzeit zu visualisieren, aufzudecken, wie Krebsepithelzellen die grundlegende Natur von zytotoxischen Effektor-Immunzellen wie natürlichen Killerzellen verändern, und potenzielle Immuntherapien und antikörper-wirkstoffabhängige zytotoxische Aktivität zu testen^{26, 27,28}. Dieser Artikel demonstriert eine Methode zur Erzeugung von Epithelorganoiden ohne Passage und Einbettung in Kollagen und basale extrazelluläre Matrix (ECM). Darüber hinaus werden auch Techniken für die nachgeschaltete Bildgebung von isolierten Organoiden geteilt.

Protokoll

Das gesamte Mausgewebe, das in diesem Manuskript verwendet wird, wurde in Übereinstimmung mit den Vorschriften und Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Southwestern Medical Center der University of Texas ethisch gesammelt. Ebenso stimmten alle Patienten vor der Gewebespende unter der Aufsicht eines Institutional Review Board (IRB) zu, und die Proben wurden anonymisiert.

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von Organoiden aus Primärgewebe.

1. Vorbereitung der Materialien über Nacht

1. Für die Einbettung in die extrazelluläre Matrix im Grundgebirge (BECM) tauen Sie das BECM-Aliquot auf, indem Sie es bei 4 °C belassen.

2. Herstellung von Kollagenase und Rinderserumalbumin (BSA)-Beschichtungslösung

1. Herstellung einer 2,64%igen BSA/PBS-Beschichtungslösung (BSA-Lösung): Sterilfilter aus 50 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und 4,10 ml 30%iger BSA-Lösung unter Verwendung eines 50 ml/0,2 μm-Filterkolbens. Diese BSA-Lösung kann gefiltert und wieder verwendet werden.
2. Bereiten Sie eine Kollagenaselösung für das Brustgewebe der Maus vor: Sterilfilter 27 ml Basalzellmedium, 1,5 ml fötales Rinderserum (FBS), 30 μl 50 mg/ml Gentamicin, 15 μl 10 mg/ml Insulin, 600 μl 0,1 g/ml Kollagenase A und 600 μl 0,1 g/ml Trypsin unter Verwendung eines 50 ml/0,2 μm Filterkolbens. Verteilen Sie je nach Gewebemasse zwischen 10 ml und 30 ml Kollagenaselösung pro Maus.
3. Bereiten Sie eine Kollagenaselösung für menschliches Brustgewebe vor: Sterilfilter 18 ml RPMI-1640, 200 μl 100-fache Penicillin-Streptomycin-Lösung (pen/Streptokokken), 200 μl 10 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsäure (HEPES)-Puffer, 1 ml FBS und 400 μl 0,1 g/ml Kollagenase A unter Verwendung eines 50 ml/0,2 μm-Filterkolbens. Weisen Sie je nach Gewebemasse zwischen 10 ml und 20 ml pro Gewebeprobe zu.

3. Medien vorbereiten

1. Bereiten Sie organoide Medien vor: Steriles Filter-Basalzellmedium mit 1 % Pen/Streptokokken und 1 % Insulin-Transferrin-Selen (ITS) unter Verwendung eines 50 ml/0,2 μm Filterkolbens. Um organoide Wachstumsfaktormedien herzustellen, fügen Sie basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) zu einer Endkonzentration von 2,5 nM hinzu.
2. Bereiten Sie das Brustepithelmedium vor: Um 100 ml Brustepithelmedien herzustellen, filtern Sie das gemeinsame Basalmedium mit hohem Glukosegehalt steril mit 1 ml 100-fachem Glutaminpräparat, 1 ml Pen/Streptokokken, 1 ml 10 mM HEPES-Puffer (pH 7,3), 250 μl 30% BSA-Vorrat, 1 μl 1 mg/ml Choleratoxin-Vorrat, 1 ml 50 μg/ml Hydrocortison-Vorrat in PBS, 50 μl 10 mg/ml Humaninsulinlösung, 10 μl 50 μg/ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und 1 % FBS unter Verwendung eines 150 ml/0,2 μm Filterkolbens. Lagern Sie das Medium bei 4 °C und verwenden Sie es bis zu 2 Wochen.
3. Amphotericin-Waschung vorbereiten: Sterilfilter PBS mit 2 % Pen/Streptokokken und 2 % Amphotericin B. Bei 4 °C lagern.

4. Sammeln und Verdauen von Gewebe

1. Brustgewebe der Maus
   1. Euthanasieren Sie die Maus, indem Sie sie für 2-5 Minuten in eine CO₂ -Kammer legen, und folgen Sie dann mit einer Zervixluxation. Spreizen Sie die Gliedmaßen der Maus mit der Bauchseite nach oben und befestigen Sie die Maus mit vier 19-G-Nadeln an den Pfoten an einem Brett, das mit einem saugfähigen Pad bedeckt ist. Sprühen Sie mit 70% Ethanol ein, um das Fell zu glätten und die Haut zu desinfizieren. Wischen Sie den Kot mit einem Mulltuch oder Taschentuch ab.
   2. Beginnen Sie direkt über der anogenitalen Region und schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere von der Mittellinie nach oben, wobei Sie darauf achten, das Peritoneum nicht zu durchbohren. Wenn Sie das Kinn erreichen, machen Sie seitliche Schnitte an beiden Schlüsselbeinen und an den Hinterbeinen und stecken Sie die Haut der Maus straff an das Brett, um Brustfettpolster freizulegen.
   3. Lokalisieren Sie die inguinalen Brustfettpolster von Wildtyp-Mäusen, indem Sie den inguinalen Lymphknoten in der Nähe der Hinterbeine identifizieren. Lokalisieren Sie die Brustfettpolster bei Wildtyp-Mäusen als dickeres, vaskularisiertes Gewebe unter den vorderen Gliedmaßen.
   4. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Brustfettpolster anzuheben. Vermeiden Sie es, darunter liegende Muskeln zu sammeln. Erstellen Sie mit dem stumpfen Ende einer scharf-stumpfen Schere eine Tasche unter dem Brustfettpolster, weg von der Haut. Schneiden Sie das Brustfettpolster in einem Stück weg.
   5. Sobald die Brustfettpolster entfernt wurden, spülen Sie sie in PBS aus, bevor Sie sie in eine sterile Gewebekulturschale geben. Schnell auf eine Gewebekulturhaube übertragen.
      HINWEIS: Verwenden Sie bei Brusttumoren ein mit PBS benetztes Wattestäbchen, um den Tumor sanft von der Haut wegzurollen. Achten Sie darauf, dunkle oder weiche Bereiche zu vermeiden, da dunkle Verfärbungen auf eine Nekrose hinweisen, die keine gesunden Organoide hervorbringt.
   6. Zerkleinern Sie die Brusttumoren mit einem Skalpell #10 oder #11, um das Gewebe zu lockern, bis es eine pastöse Konsistenz erreicht. Übertragen Sie das zerkleinerte Gewebe mit einem Skalpell in ein konisches Röhrchen mit 10-30 ml Kollagenaselösung. Um sicherzustellen, dass das gesamte Gewebe gesammelt wird, pipettieren Sie 1 ml Kollagenaselösung auf die Gewebekulturplatte und zurück in das konische Röhrchen.
      HINWEIS: Um größere Organoide herzustellen, sollte die mechanische Verdauung minimiert werden, wobei einige kleine sichtbare Gewebestücke intakt bleiben. Alternativ kann das Gewebe für die spätere organoide Präparation mit minimalem Verlust an Lebensfähigkeit gefroren gelagert werden. Waschen Sie dazu das Gewebe in einer Lösung aus PBS oder Basalzellmedien + 1% FBS und zerkleinern Sie es dann grob, um die Oberfläche zu vergrößern (wobei das Gewebe in ein oder zwei festen Stücken gehalten wird). Bewegen Sie das Gewebe in ein Kryo-Fläschchen, das mit Gefriermedien (90% FBS + 10% Dimethylsulfoxid (DMSO)) bedeckt ist. Frieren Sie die Durchstechflaschen über Nacht in einem Gefrierbehälter mit kontrollierter Geschwindigkeit ein, bevor Sie in flüssigem Stickstoff gelagert werden.
   7. Legen Sie das konische Röhrchen bei 180 U/min in einen 37 °C heißen Tisch-Schüttelinkubator, bis das Gewebe fadenförmig und die Kollagenaselösung trüb wird. Zum Beispiel dauert eine große Gewebemasse (ca. 500-800 mg) von einem Tumor 30-60 Minuten. Eine kleinere Gewebemasse (ca. 100-300 mg) aus Wildtyp-Brustfettpölsterchen dauert etwa 20-30 min. Wenn Sie sich nicht sicher sind, überprüfen Sie dies in Abständen von 5 Minuten.
   8. Nach der Inkubation wird das konische Röhrchen 10 min bei 550 x g bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert.
   9. Saugen Sie den Überstand vorsichtig aus dem konischen Rohr ab.
      HINWEIS: Beschichten Sie alle Pipettenspitzen, serologischen Pipetten und konischen Röhrchen mit BSA-Lösung vor, um den Verlust von Organoiden durch Anhaftung an Kunststoff zu vermeiden.
   10. Geben Sie 8 ml Basalzellmedien und 80 μl DNase-Lösung [2 U/μl] in das Röhrchen. Sanft für 1-3 Minuten umdrehen.
   11. Geben Sie 12 ml Basalzellmedien in das Röhrchen und mischen Sie es vorsichtig durch Pipettieren oder drehen Sie das Röhrchen vorsichtig 15 Mal, um es zu mischen.
   12. 10 min bei 550 x g RT zentrifugieren.
   13. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie dann das Pellet in 12 ml Basalzellmedien.
   14. Lassen Sie die schwersten Gewebefragmente am Boden absetzen. Der Überstand wird mit einer serologischen Pipette aufgefangen und in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführt. Diese Suspension enthält epitheliale Organoide und Stroma-/Immunzellen.
2. Menschliches Brustgewebe
   1. Verarbeiten Sie die menschlichen Brustgewebeproben für Organoide oder lagern Sie sie innerhalb von 24 Stunden nach der Entnahme. Lagern Sie die Proben bei 4 °C in CO₂ -unabhängigen Medien mit 1% 100x Antibiotika-Antimykotikum.
   2. Übertragen Sie das Gewebe in eine Gewebekulturplatte. Kippen Sie die Platte, saugen Sie das überschüssige Speichermedium ab und spülen Sie das Gewebe dann mit 5 ml der Amphotericin B-Wäsche aus. Entfernen Sie die Amphotericin B-Wäsche sofort.
   3. Zerkleinern Sie die Gewebeprobe mit einem Skalpell #10 oder #11, um das Gewebe zu lockern, bis es eine pastöse Konsistenz erreicht. Übertragen Sie das zerkleinerte Gewebe mit einem Skalpell in ein konisches Röhrchen mit 10-30 ml Kollagenaselösung. Um sicherzustellen, dass das gesamte Gewebe gesammelt wird, pipettieren Sie 1 ml Kollagenaselösung auf die Gewebekulturplatte und kehren Sie in das konische Röhrchen zurück.
      HINWEIS: Um größere Organoide herzustellen, sollte die mechanische Verdauung minimiert werden, wobei einige kleine sichtbare Gewebestücke intakt bleiben. Die anfängliche Gewebemasse für dieses Protokoll lag zwischen 100 und 250 mg. Alternativ kann das Gewebe für die spätere organoide Präparation mit minimalem Verlust der Lebensfähigkeit nach Schritt 4.2.2 in 90% FBS + 10% DMSO wie oben eingefroren gelagert werden.
   4. Legen Sie das konische Röhrchen mit 180 U/min in einen 37 °C heißen Tisch-Schüttelinkubator, bis das Gewebe kleiner und die Kollagenase trüb wird. Überprüfen Sie das Gewebe in Abständen von 5 Minuten. Die Kollagenase-Dissoziation menschlicher Proben dauert etwa 5-20 Minuten.
   5. Nach der Inkubation wird das konische Röhrchen 10 Minuten lang bei 550 x g RT nach unten geschleudert.
   6. Saugen Sie den Überstand vorsichtig aus dem konischen Rohr ab.
      HINWEIS: Beschichten Sie alle Pipettenspitzen, serologischen Pipetten und konischen Röhrchen mit BSA-Lösung vor, um den Verlust von Organoiden durch Anhaftung an Kunststoff zu vermeiden.
   7. 4 ml Basalzellmedien und 40 μl DNase-Lösung [2 U/μl] in das konische Röhrchen geben. 3 Minuten lang sanft umdrehen.
   8. Geben Sie 6 ml Basalzellmedien in das Röhrchen und mischen Sie es vorsichtig durch Pipettieren oder drehen Sie das konische Röhrchen vorsichtig 15 Mal, um es zu mischen.
   9. 10 min bei 550 x g RT zentrifugieren.
   10. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie dann das Pellet in 10 ml Basalzellmedien.
   11. Lassen Sie die schwersten Gewebefragmente am Boden absetzen. Sammeln Sie den Überstand und geben Sie ihn in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Diese Suspension enthält epitheliale Organoide und Stroma-/Immunzellen.

5. Differentielle Zentrifugation

1. Pulsieren Sie auf 550 x g für 3-4 s bei RT, saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml Basalzellmedien. Wiederholen Sie diesen Schritt noch dreimal (insgesamt vier Drehungen).
2. Stellen Sie nach jeder Zentrifugation sicher, dass das Pellet zunehmend undurchsichtig wird. Bei den verbleibenden Pellets handelt es sich um Epithelorganoide.

6. Sammeln kleiner Organoide

1. Puls auf 80-100 x g für 3 s bei RT. Sammeln Sie den Überstand in einem frischen BSA-beschichteten Röhrchen und pulsieren Sie dann auf 550 x g für 3 s bei RT, um die kleinen Organoide zu pelletieren.

7. Einbettung von Organoiden in BECM

1. Aliquot geeignete Suspension von Organoiden in Mikrozentrifugenröhrchen entsprechend der Organoiddichte im Verhältnis zur Menge an BECM pro Vertiefung (Tabelle 1). Verwenden Sie beispielsweise 50-100 Organoide für 20 μl BECM in einer Vertiefung einer 96-Well-Platte.
   ANMERKUNG: Die Organoiddichte kann nach folgender Formel gezählt werden: ((Durchschnittliche Anzahl der Organoide)/50 μl) x Verdünnungsfaktor.
2. Führen Sie alle Schritte auf Eis aus. Legen Sie das aufgetaute BECM auf Eis in eine Gewebekulturhaube. Während Sie die Haube vorbereiten, legen Sie alle Pipettenspitzen zum Abkühlen auf Eis.
3. Zentrifugieren Sie die Mikrozentrifugenröhrchen für 10 min bei 300 x g bei RT. Entsorgen Sie den Überstand aus den Röhrchen. Bewegen Sie die Röhrchen mit Organoidkügelchen auf Eis und geben Sie das entsprechende Volumen BECM in jedes Mikrozentrifugenröhrchen (Tabelle 1).
   HINWEIS: Da BECM viskos ist, fügen Sie zusätzliche Volumina (ca. 10%-20% mehr Kuppelvolumen) BECM hinzu, um den Verlust in der Pipettenspitze auszugleichen.
4. Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Organoide in BECM zu resuspendieren, wobei darauf zu achten ist, dass keine Blasen entstehen.
5. Pipettieren Sie die BECM-suspendierten Organoide langsam und vorsichtig auf die Beschichtungsoberfläche. Heben Sie die Pipette während des Pipettierens langsam an, um eine Kuppel zu bilden. Füllen Sie alle leeren Vertiefungen mit PBS, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.
6. Legen Sie die Platte für 1 h in einen 37 °C heißen Inkubator, damit sich das BECM verfestigen kann, und bedecken Sie sie dann mit dem entsprechenden Medienvolumen (Tabelle 1).

8. Einbettung von Organoiden in Kollagen

1. Führen Sie alle Schritte auf Eis aus. Bereiten Sie die Kollagenlösung vor, indem Sie in sequentieller Reihenfolge 375 μl 10x DMEM, 100 μl 1 N Natriumhydroxid (NaOH) und 3 ml Rattenschwanz-Kollagen-I-Lösung in einem konischen 15-ml-Röhrchen kombinieren. Pipettenmischung und darauf achten, dass keine Blasen entstehen. Titrieren Sie die Lösung auf einen pH-Wert von 7,2-7,4 mit kleinen Mengen (Schritten von 1-3 μl) NaOH oder 10x DMEM nach Bedarf.
2. Beschichten Sie den Boden der Vertiefungen mit der minimalen Menge an Kollagen, die erforderlich ist, um den Boden des Vertiefungss vollständig zu bedecken. Ein Ansatz besteht darin, eine kleine Menge Kollagen zu platzieren und die Platte von einer Seite zur anderen zu schaukeln, um sie zu beschichten. Lassen Sie die Kollagenunterlagen 30 min-2 h bei 37 °C aushärten.
3. Aliquot die geeignete Suspension von Organoiden in Mikrozentrifugenröhrchen entsprechend der Organoiddichte im Verhältnis zur Menge an Kollagen pro Vertiefung (Tabelle 1). In einen 37 °C warmen Inkubator geben.
4. Lagern Sie die Kollagenlösung bei 4 °C und überwachen Sie die Polymerisation, indem Sie alle 10 Minuten unter dem Mikroskop auf Faserbildung prüfen. Kollagen erreicht eine angemessene Polymerisation zwischen 30 min-2 h.
   HINWEIS: Die richtige Polymerisation kann durch das Vorhandensein von Fasern bestimmt werden, die sich in der gesamten Matrix verzweigen. Fahren Sie sofort mit Schritt 8.5 fort, sobald einige Fasern im Sichtfeld beobachtet werden.
5. Zentrifugieren Sie die Mikrozentrifugenröhrchen bei 300 x g für 10 min bei RT. Entsorgen Sie den Überstand aus den Röhrchen. Bewegen Sie die organoiden Pellets auf Eis und geben Sie das entsprechende Volumen Kollagen in jedes Mikrozentrifugenröhrchen (Tabelle 1).
   HINWEIS: Da Kollagen viskos ist, fügen Sie zusätzliche Volumina (ca. 10%-20% des Kuppelvolumens) Kollagen hinzu, um den Verlust in der Pipettenspitze auszugleichen.
6. Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um Organoide in Kollagen zu resuspendieren, und achten Sie darauf, keine Blasen zu bilden.
7. Pipettieren Sie die kollagensuspendierten Organoide langsam und vorsichtig auf die Beschichtungsoberfläche. Heben Sie die Pipette während des Pipettierens langsam an, um eine Kuppel zu bilden. Füllen Sie alle leeren Vertiefungen mit PBS, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.
8. Legen Sie die Platte für 1 Stunde in einen 37 °C warmen Inkubator, damit sich das Kollagen verfestigen kann, und bedecken Sie sie dann mit dem entsprechenden Medienvolumen (Tabelle 1).
9. HINWEIS: Organoide behalten ihre Lebensfähigkeit in der 3D-Matrix bis zu 7 Tage lang bei. Wenn die Bildgebung für die Analyse verwendet wird, fahren Sie mit den Schritten 9 und 10 fort.

9. Fixieren von eingebetteten Organoiden

1. Verwenden Sie eine Pipette, um alle Medien aus den Vertiefungen zu entfernen, ohne sie mit ECM-Kuppeln zu berühren.
2. Mit 4% Paraformaldehyd (PFA)/PBS-Lösung 5 min fixieren.
3. Waschen Sie zwei- bis dreimal, indem Sie PBS auf die Vertiefungen auftragen, nachdem Sie sie auf einen sich langsam bewegenden Shaker gelegt haben. Tragen Sie nach dem Waschen frisches PBS auf die Kuppeln auf und lagern Sie die Platte bei 4 °C.

10. Immunfluoreszenzfärbung von eingebetteten Organoiden

1. Herstellung von Lösungen für die Immunfluoreszenzfärbung
   1. Permeabilisierungspuffer: Bereiten Sie eine PBS-Lösung mit 10% Triton X-100 vor.
   2. Blockierungspuffer: Bereiten Sie eine PBS-Lösung mit 10 % FBS und 0,2 % Triton X-100 vor.
   3. Antikörper-Verdünnungspuffer: Bereiten Sie eine PBS-Lösung mit 2% FBS und 0,2% Triton X-100 vor.
2. Permeabilisierung und Blockierung
   1. Pipettieren Sie genügend Permeabilisierungspuffer, um die ECM-Kuppeln abzudecken. 1 h bei RT auf einem sich langsam bewegenden Shaker inkubieren.
   2. Entfernen Sie den Permeabilisierungspuffer mit einer Pipette und tragen Sie das gleiche Volumen des Blockierungspuffers für 3 h auf.
3. Inkubation von primären Antikörpern
   1. Entfernen Sie den Blockpuffer mit einer Pipette und tragen Sie den Antikörper-Verdünnungspuffer, der den primären Antikörper enthält, in vom Hersteller angegebenen Konzentrationen auf. Die Probe wird bei 4 °C für 12-16 h auf einem sich langsam bewegenden Schüttler inkubiert.
   2. Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie die Proben dreimal für 10 Minuten mit PBS bei RT auf einem sich langsam bewegenden Schüttler.
4. Sekundäre Antikörperinkubation und Kernfärbung
   1. Saugen Sie die verbleibende PBS-Wäsche ab und tragen Sie den Antikörper-Verdünnungspuffer mit sekundärem Antikörper in vom Hersteller angegebenen Konzentrationen auf. Fügen Sie dem Puffer zusätzlich DAPI oder Hoechst (zur Markierung von Kernen) oder Phalloidin (zur Markierung von Aktin) im Verhältnis 1:250 hinzu. Inkubieren Sie 2-4 Stunden bei RT auf einem sich langsam bewegenden Shaker.
   2. Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung und waschen Sie die Proben dreimal für 10 Minuten in PBS bei RT auf einem Schüttler. Lagern Sie die Proben in PBS bei 4 °C bis zur Bildgebung.

Ergebnisse

Die in Abbildung 1 gezeigten Bilder zeigen ein Beispiel für Wildtyp- und tumoröse Brustepithelorganoide aus menschlichem und Mausgewebe. Eine auf einen Blick gezeigte Illustration der Methode zur Isolierung von Epithelorganoiden durch differentielle Zentrifugation ist im Cartoon-Workflow in Abbildung 1A zu sehen, der zeigt, dass Primärgewebe verschiedener Spezies auf nahezu identische Weise verarbeitet werden können, während Epithelgewebe entsteht, wie in d...

Diskussion

In der Literatur wurden verschiedene Methoden zur Erzeugung von Tumororganoiden beschrieben. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Erzeugung von Tumororganoiden direkt aus dem Tumor ohne Passage vor. Mit dieser Methode sind Tumor-Organoide innerhalb von Stunden nach Beginn des Verfahrens herstellbar und erzeugen nahezu 100 % lebensfähige Organoide, verglichen mit 70 % in der Literatur³¹. Im Vergleich dazu erfordern andere Methoden eine serielle Passage von Zellen in Organoide über mehrere Woc...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mM HEPES Buffer	Gibco	15630080
100x Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-096
100x Glutamax	Life Technologies	35050-061	Glutamine supplement
100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)	Life Technologies	51500-056
100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Sigma	P4333
10x DMEM	Sigma	D2429
50 mL/0.2 µm filter flask	Fisher	#564-0020
Amphotericin B	Life Technologies	15290-018
bFGF	Sigma	F0291
BSA Solution (32%)	Sigma	#A9576
Cholera Toxin	Sigma	C8052
CO2-Independent Medium	Gibco	18045-088
Collagenase A	Sigma	C2139
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase)	Sigma	D4263
DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture	Sigma	D6546	Common basal medium
D-MEM/F12	Life Technologies	#10565-018	Basal cell medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Sigma	#D8662	PBS
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	#F0926
Gentamicin	Life Technologies	#15750-060
Human epidermal growth factor (EGF)	Sigma	E9644
Hydrocortisone	Sigma	H0396
Insulin	Sigma	#I9278
Matrigel	Corning	#354230	Basement Extracellular Matrix (BECM)
NaOH (1 N)	Sigma	S2770
Rat Tail Collagen I	Corning	354236
RPMI-1640 media	Fisher	SH3002701
Trypsin	Life Technologies	27250-018