Генерация и визуализация эпителиальных органоидов мыши и человека из нормальной и опухолевой ткани молочной железы без пассажа

Резюме

В этом протоколе обсуждается подход к получению эпителиальных органоидов из первичной нормальной и опухолевой ткани молочной железы посредством дифференциального центрифугирования. Кроме того, включены инструкции по трехмерному культивированию, а также иммунофлуоресцентной визуализации встроенных органоидов.

Аннотация

Органоиды являются надежным методом моделирования ткани органа благодаря своим самоорганизующимся свойствам и сохранению функции и архитектуры после размножения из первичной ткани или стволовых клеток. Этот метод генерации органоидов отказывается от дифференцировки одноклеточных клеток через несколько пассажей и вместо этого использует дифференциальное центрифугирование для выделения органоидов эпителия молочной железы из механически и ферментативно диссоциированных тканей. Этот протокол обеспечивает оптимизированную технику быстрого получения мелких и крупных эпителиальных органоидов как из ткани молочной железы мыши, так и из ткани молочной железы человека в дополнение к методам встраивания органоидов в коллаген и базис внеклеточного матрикса. Кроме того, приведены инструкции по фиксации в геле и иммунофлуоресцентному окрашиванию с целью визуализации морфологии и плотности органоидов. Эти методологии подходят для множества последующих анализов, таких как совместное культивирование с иммунными клетками и моделирование метастазов ex vivo с помощью анализа инвазии коллагена. Эти анализы служат для лучшего выяснения поведения клеток и создания более полного понимания взаимодействий в микроокружении опухоли.

Введение

Способность моделировать эпителиальные клетки in vitro была основой современных биомедицинских исследований, поскольку она фиксирует клеточные особенности, которые недоступны in vivo. Например, выращивание эпителиальных клеточных линий в двумерной плоскости может дать оценку молекулярных изменений, происходящих в эпителиальной клетке во время пролиферации¹. Кроме того, измерение динамической регуляции между передачей сигналов и экспрессией генов ограничено в системах in vivo ². В исследованиях рака моделирование линии эпителиальных клеток рака позволило идентифицировать молекулярные драйверы прогрессирования заболевания и потенциальные мишени для лекарств³. Однако выращивание линий эпителиальных клеток рака в двумерной плоскости имеет ограничения, поскольку большинство из них генетически иммортализированы и модифицированы, часто клональны по своей природе, отобраны по их способности расти в нефизиологических условиях, ограничены в оценке трехмерной (3D) архитектуры опухолевой ткани и не адекватно моделируют взаимодействия микроокружения в реалистичной тканевой среде⁴. Эти ограничения особенно очевидны при моделировании метастазирования, которое in vivo включает в себя несколько различных биологических стадий, включая инвазию, распространение, циркуляцию и колонизацию в отдаленном участке^{органа 5}.

Эпителиальные органоиды рака были разработаны для лучшего повторения 3D-среды и поведения опухолей ^6,7,8. Органоиды были впервые разработаны из отдельных клеток кишечника LRG5+ и дифференцированы для представления 3D-структуры звеньев крипты-ворсинок, которые поддерживали иерархическую структуру тонкой кишки in vitro⁹. Этот подход позволил в режиме реального времени визуализировать и охарактеризовать самоорганизующуюся тканевую архитектуру в гомеостатических и стрессовых условиях. В качестве естественного расширения были разработаны органоиды эпителия рака для моделирования множества различных типов рака, включая колоректальный рак¹⁰, рак поджелудочной железы¹¹, рак молочной железы¹², печень^{13, легкие 14}, мозг 15 и рак желудка¹⁶. Эпителиальные органоиды рака были использованы для характеристики эволюции рака^17,18 и метастатического пространственно-временного поведения ^19,20 и опроса гетерогенности опухоли 21 и тестирования химиотерапии ²². Раковые эпителиальные органоиды также были выделены и собраны во время текущих клинических испытаний для прогнозирования реакции пациента на противоопухолевые агенты и лучевую терапию ex vivo 8,23,24,25. Кроме того, системы, включающие раковые эпителиальные органоиды, могут быть объединены с другими нераковыми клетками, такими как иммунные клетки, для формирования более полной модели микроокружения опухоли для визуализации взаимодействий в режиме реального времени, раскрытия того, как раковые эпителиальные клетки изменяют фундаментальную природу цитотоксических эффекторных иммунных клеток, таких как естественные клетки-киллеры, и тестирования потенциальной иммунотерапии и антитело-лекарственной цитотоксической активности^{26, 27,28}. В данной статье демонстрируется способ получения эпителиальных органоидов без пассажа и встраивания в коллаген и базальный внеклеточный матрикс (ECM). Кроме того, используются методы последующей визуализации изолированных органоидов.

протокол

Все ткани мышей, использованные в этой рукописи, были этически собраны в соответствии с правилами и рекомендациями Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Юго-западного медицинского центра Техасского университета. Аналогичным образом, все пациенты дали согласие до донорства тканей под надзором Институционального наблюдательного совета (IRB), и образцы были деидентифицированы.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает генерацию органоидов из первичной ткани.

1. Ночная подготовка материалов

1. Для встраивания в подвальный внеклеточный матрикс (BECM) разморозьте аликвоту BECM, оставив ее при температуре 4 °C.

2. Приготовление раствора для покрытия коллагеназой и бычьим сывороточным альбумином (BSA)

1. Приготовьте 2,64% раствор покрытия BSA/PBS (раствор BSA): стерильный фильтр 50 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) и 4,10 мл 30% раствора BSA с использованием фильтрующей колбы объемом 50 мл/0,2 мкм. Этот раствор BSA можно отфильтровать и использовать снова.
2. Приготовьте раствор коллагеназы для ткани молочной железы мыши: стерильный фильтр 27 мл базальноклеточной среды, 1,5 мл эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 30 мкл 50 мг/мл гентамицина, 15 мкл инсулина 10 мг/мл, 600 мкл 0,1 г/мл коллагеназы А и 600 мкл 0,1 г/мл трипсина 0,1 г/мл с использованием фильтрующей колбы 50 мл/0,2 мкм. Выделите от 10 мл до 30 мл раствора коллагеназы на мышь, в зависимости от массы ткани.
3. Приготовьте раствор коллагеназы для тканей молочной железы человека: стерильный фильтр 18 мл RPMI-1640, 200 мкл 100-кратного раствора пенициллина-стрептомицина (ручка/стрептококк), 200 мкл 10 мМ буфера 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетанасульфоновой кислоты (HEPES), 1 мл FBS и 400 мкл 0,1 г/мл коллагеназы A с использованием фильтрующей колбы объемом 50 мл/0,2 мкм. Выделяют от 10 мл до 20 мл на образец ткани, в зависимости от массы ткани.

3. Подготовка носителей

1. Подготовьте органоидную среду: стерильную фильтрующую базальноклеточную среду с 1% пером/стрептококком и 1% инсулин-трансферрин-селеном (ITS) с использованием фильтрующей колбы 50 мл/0,2 мкм. Чтобы получить среду с органоидным фактором роста, добавьте основной фактор роста фибробластов (bFGF) к конечной концентрации 2,5 нМ.
2. Подготовьте эпителиальные среды молочной железы: чтобы сделать 100 мл эпителиальной среды молочной железы, стерильный фильтр с высоким содержанием глюкозы общей базальной среды с 1 мл 100-кратной добавки глютамина, 1 мл шприц-ручки / стрептококка, 1 мл 10 мМ буфера HEPES (7,3 pH), 250 мкл 30% запаса BSA, 1 мкл 1 мг / мл запаса холерного токсина, 1 мл 50 мкг / мл гидрокортизона в PBS, 50 мкл 10 мг/мл раствора человеческого инсулина, 10 мкл 50 мкг/мл эпидермального фактора роста (EGF) и 1% FBS с использованием фильтрующей колбы объемом 150 мл/0,2 мкм. Храните носитель при температуре 4 °C и используйте до 2 недель.
3. Приготовьте промывку амфотерицином: стерильный фильтр PBS с 2% пером/стрептококком и 2% амфотерицином B. Хранить при температуре 4 °C.

4. Сбор и переваривание тканей

1. Ткань молочной железы мыши
   1. Усыпьте мышь, поместив ее в камеру CO 2 на_2-5 минут, а затем последует вывих шейки матки. Брюшной стороной вверх растопырите конечности мыши и используйте четыре иглы 19 G, чтобы прижать мышь за лапы к доске, покрытой впитывающей прокладкой. Сбрызните 70% этанолом, чтобы разгладить шерсть и продезинфицировать кожу. Вытрите кал марлевой салфеткой или салфеткой.
   2. Начиная чуть выше аногенитальной области, разрежьте вверх от средней линии хирургическими ножницами, стараясь не проткнуть брюшину. Достигнув подбородка, сделайте боковые надрезы по обеим ключицам и вниз задних лап и прижмите натянутую кожу мыши к доске, чтобы обнажить жировые подушечки молочной железы.
   3. Найдите паховые жировые подушечки молочной железы у мышей дикого типа, определив паховый лимфатический узел, расположенный рядом с задними конечностями. Найдите грудные жировые подушечки молочной железы у мышей дикого типа как более толстую васкуляризированную ткань под передними конечностями.
   4. Используйте щипцы, чтобы поднять жировую подушечку молочной железы. Избегайте скопления нижележащих мышц. Используя тупой конец ножниц с острым тупым предметом, создайте карман под жировой подушечкой молочной железы, подальше от кожи. Отрежьте жировую подушечку молочной железы одним целым куском.
   5. После удаления жировых отложений молочной железы промойте их в PBS, прежде чем помещать их в стерильную чашку для культивирования тканей. Быстро переносят в тканевый культуральный колпак.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При опухолях молочной железы используйте ватный тампон, смоченный PBS, чтобы аккуратно откатить опухоль от кожи. Обязательно избегайте затемненных или мягких участков, так как темное обесцвечивание указывает на некроз, который не даст здоровых органоидов.
   6. Измельчите опухоли молочной железы скальпелем #10 или #11, чтобы ослабить ткань, пока она не достигнет пастообразной консистенции. Переведите измельченную ткань в коническую трубку, содержащую 10-30 мл раствора коллагеназы, с помощью скальпеля. Чтобы убедиться, что вся ткань собрана, пипеткой нанесите 1 мл раствора коллагеназы на пластину для культивирования тканей и обратно в коническую трубку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения более крупных органоидов механическое разложение должно быть сведено к минимуму, оставляя некоторые небольшие видимые кусочки ткани нетронутыми. В качестве альтернативы, ткань можно хранить в замороженном виде для последующего приготовления органоидов с минимальной потерей жизнеспособности. Для этого промойте ткань в растворе PBS или базальноклеточной среде + 1% FBS, а затем крупно измельчите для увеличения площади поверхности (сохраняя ткань в одном или двух твердых кусочках). Переместите ткань в крио-флакон, залейте замораживающей средой (90% FBS + 10% диметилсульфоксида (ДМСО)). Заморозьте флаконы в контейнере для замораживания с контролируемой скоростью на ночь, прежде чем перемещать их на хранение в жидком азоте.
   7. Поместите коническую трубку в настольный встряхивающий инкубатор с температурой 37 °C при 180 об/мин до тех пор, пока ткань не станет волокнистой, а раствор коллагеназы не помутнеет. Например, большая масса ткани (около 500-800 мг) из опухоли занимает 30-60 минут. Меньшая масса ткани (около 100-300 мг) из жировых подушечек молочной железы дикого типа занимает около 20-30 минут. Если вы не уверены, проверяйте с интервалом в 5 минут.
   8. После инкубации центрифугируют коническую пробирку в течение 10 мин при 550 x g при комнатной температуре (RT).
   9. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость из конической трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Двигаясь вперед, предварительно покройте все наконечники пипеток, серологические пипетки и конические трубки раствором BSA, чтобы избежать потери органоидов из-за адгезии к пластику.
   10. Добавьте в пробирку 8 мл базальноклеточной среды и 80 мкл раствора ДНКазы [2 ЕД/мкл]. Аккуратно переверните на 1-3 минуты.
   11. Добавьте 12 мл базальноклеточной среды в пробирку и тщательно перемешайте пипеткой или осторожно поверните пробирку 15 раз, чтобы перемешать.
   12. Центрифуга в течение 10 мин при 550 x g при RT.
   13. Аспирируют надосадочную жидкость, а затем ресуспендируют гранулу в 12 мл базальноклеточной среды.
   14. Пусть самые тяжелые фрагменты ткани осядут на дно. Соберите надосадочную жидкость с помощью серологической пипетки и перенесите в коническую пробирку объемом 15 мл. Эта суспензия содержит эпителиальные органоиды и стромальные/иммунные клетки.
2. Ткань молочной железы человека
   1. Обработайте образцы тканей молочной железы человека на наличие органоидов или храните их в течение 24 часов после сбора. Храните образцы при температуре 4 °C в среде CO_{2-Independent} с 1% 100-кратным антибиотиком-антимикотиком.
   2. Перенесите ткань в пластину для культивирования тканей. Наклоните пластину и аспирируйте излишки среды хранения, а затем промойте ткань 5 мл промывки амфотерицином B. Немедленно удалите смывку амфотерицина B.
   3. Измельчите образец ткани скальпелем #10 или #11, чтобы ослабить ткань, пока она не достигнет пастообразной консистенции. Переведите измельченную ткань в коническую трубку, содержащую 10-30 мл раствора коллагеназы, с помощью скальпеля. Чтобы убедиться, что вся ткань собрана, пипеткой нанесите 1 мл раствора коллагеназы на пластину для культивирования тканей и верните в коническую трубку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения более крупных органоидов механическое разложение должно быть сведено к минимуму, оставляя некоторые небольшие видимые кусочки ткани нетронутыми. Начальная масса ткани для этого протокола варьировалась в пределах 100-250 мг. В качестве альтернативы, ткань можно хранить замороженной для последующего приготовления органоидов с минимальной потерей жизнеспособности после шага 4.2.2 в 90% FBS + 10% DMSO, как указано выше.
   4. Поместите коническую трубку в настольный встряхивающий инкубатор с температурой 37 °C при 180 об/мин до тех пор, пока ткань не станет меньше, а коллагеназа не помутнеет. Проверяйте ткань с интервалом в 5 минут. Диссоциация коллагеназы образцов человека занимает примерно 5-20 минут.
   5. После инкубации откручивают коническую трубку в течение 10 мин при 550 x g при RT.
   6. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость из конической трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Двигаясь вперед, предварительно покройте все наконечники пипеток, серологических пипеток и конических пробирок раствором BSA, чтобы избежать потери органоидов из-за адгезии к пластику.
   7. Добавьте 4 мл базальноклеточной среды и 40 мкл раствора ДНКазы [2 Ед/мкл] в коническую пробирку. Аккуратно переверните на 3 минуты.
   8. Добавьте 6 мл базальноклеточной среды в пробирку и тщательно перемешайте пипеткой или осторожно поверните коническую трубку 15 раз, чтобы перемешать.
   9. Центрифуга в течение 10 мин при 550 x g при RT.
   10. Аспирируют надосадочную жидкость, а затем ресуспендируют гранулу в 10 мл базальноклеточной среды.
   11. Пусть самые тяжелые фрагменты ткани осядут на дно. Соберите надосадочную жидкость и перенесите ее в коническую пробирку объемом 15 мл. Эта суспензия содержит эпителиальные органоиды и стромальные/иммунные клетки.

5. Дифференциальное центрифугирование

1. Пульсируют до 550 x g в течение 3-4 с при RT, аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулу в 10 мл базальноклеточной среды. Повторите этот шаг еще три раза (всего четыре вращения).
2. После каждого центрифугирования следите за тем, чтобы гранулы становились все более непрозрачными. Эта оставшаяся гранула будет эпителиальными органоидами.

6. Сбор мелких органоидов

1. Импульс до 80-100 x g в течение 3 с при RT. Соберите надосадочную жидкость в свежую пробирку, покрытую BSA, а затем импульсируйте до 550 x g в течение 3 с при RT, чтобы гранулировать мелкие органоиды.

7. Встраивание органоидов в BECM

1. Аликвотировать целесообразную суспензию органоидов в микроцентрифужные пробирки в соответствии с плотностью органоидов по отношению к количеству БЭКМ на лунку (табл. 1). Например, используйте 50-100 органоидов на 20 мкл БЭКМ в одной лунке 96-луночного планшета.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность органоидов можно рассчитать по следующей формуле: ((Среднее количество органоидов)/50 мкл) х коэффициент разбавления.
2. Выполняйте все действия на льду. Поместите размороженный BECM на лед в тканевый культуральный колпак. Во время подготовки вытяжки поместите все кончики пипеток на лед, чтобы они остыли.
3. Центрифугируйте микроцентрифужные пробирки в течение 10 мин при 300 x g при RT. Выбросьте надосадочную жидкость из пробирок. Переместите пробирки с органоидными гранулами на лед и добавьте соответствующий объем BECM в каждую микроцентрифужную пробирку (таблица 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку BECM является вязким, добавьте дополнительные объемы (примерно на 10-20% больше объема купола) BECM, чтобы учесть потери в наконечнике пипетки.
4. Аккуратно пипеткой вверх и вниз, чтобы ресуспендировать органоиды в BECM, стараясь не образовывать пузырьков.
5. Медленно и осторожно нанесите суспендированные BECM органоиды на поверхность покрытия. Во время пипетки медленно поднимите пипетку, чтобы создать купол. Заполните все пустые колодцы PBS для поддержания влажности.
6. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C на 1 час, чтобы дать BECM затвердеть, а затем накройте средой соответствующего объема (таблица 1).

8. Встраивание органоидов в коллаген

1. Выполняйте все действия на льду. Приготовьте раствор коллагена, комбинируя в последовательном порядке 375 мкл 10x DMEM, 100 мкл 1 N гидроксида натрия (NaOH) и 3 мл раствора коллагена I крысиного хвоста в конической пробирке объемом 15 мл. Пипеткой перемешайте, стараясь не делать пузырьков. Титруйте раствор до рН 7,2-7,4 небольшими количествами (с шагом 1-3 мкл) NaOH или 10x DMEM по мере необходимости.
2. Покройте дно лунок минимальным количеством коллагена, необходимым для полного покрытия дна лунки. Один из подходов заключается в том, чтобы поместить небольшое количество коллагена и раскачивать пластину из стороны в сторону, чтобы покрыть. Дайте коллагеновой подложке застыть при температуре 37 °C в течение 30 мин-2 ч.
3. Аликвотируют соответствующую суспензию органоидов в микроцентрифужные пробирки в соответствии с плотностью органоидов относительно количества коллагена в лунке (табл. 1). Поместить в инкубатор с температурой 37 °C.
4. Храните раствор коллагена при температуре 4 °C и контролируйте полимеризацию, проверяя образование волокон под микроскопом каждые 10 минут. Коллаген достигнет соответствующей полимеризации между 30 мин-2 часами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Правильная полимеризация может быть определена по наличию волокон, разветвляющихся по всей матрице. Сразу же переходите к шагу 8.5, как только в поле зрения будет замечено несколько волокон.
5. Центрифугируйте микроцентрифужные пробирки при 300 x g в течение 10 мин при ЛТ. Выбросьте надосадочную жидкость из пробирок. Переместите гранулы органоидов в лед и добавьте соответствующий объем коллагена в каждую микроцентрифужную пробирку (таблица 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку коллаген вязкий, добавьте дополнительные объемы (примерно на 10-20% больше объема купола) коллагена, чтобы учесть потерю наконечника пипетки.
6. Осторожно пипеткой вверх и вниз, чтобы ресуспендировать органоиды в коллагене, стараясь не образовывать пузырьков.
7. Медленно и осторожно нанесите суспендированные коллагеном органоиды на поверхность покрытия. Во время пипетки медленно поднимите пипетку, чтобы создать купол. Заполните все пустые колодцы PBS для поддержания влажности.
8. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C на 1 час, чтобы коллаген затвердел, а затем накройте средой соответствующего объема (таблица 1).
9. ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды сохраняют жизнеспособность в 3D-матрице до 7 дней. Если для анализа используется визуализация, перейдите к шагам 9 и 10.

9. Исправление встроенных органоидов

1. Используйте пипетку для удаления всех сред из скважин, не вступая в контакт с куполами ECM.
2. Зафиксируйте 4% раствором параформальдегида (PFA)/PBS в течение 5 мин.
3. Вымойте два-три раза, нанеся PBS на лунки, поместив их на медленно движущийся шейкер. После мытья нанесите свежий PBS на купола и храните пластину при температуре 4 °C.

10. Иммунофлюоресцентное окрашивание встроенных органоидов

1. Приготовление растворов для иммунофлюоресцентного окрашивания
   1. Буфер для пермеабилизации: Приготовьте раствор PBS с 10% Triton X-100.
   2. Блокирующий буфер: Приготовьте раствор PBS с 10% FBS и 0,2% Triton X-100.
   3. Буфер для разведения антител: Приготовьте раствор PBS с 2% FBS и 0,2% Triton X-100.
2. Пермеабилизация и блокировка
   1. Пипетка достаточно проницаемого буфера, чтобы покрыть купола ECM. Инкубировать в течение 1 ч при РТ на медленно движущемся шейкере.
   2. Извлеките пермеабилизирующий буфер пипеткой и нанесите тот же объем блокирующего буфера в течение 3 ч.
3. Первичная инкубация антител
   1. Удалите блокирующий буфер с помощью пипетки и нанесите буфер для разбавления антител, содержащий первичное антитело, в концентрациях, указанных производителем. Инкубируйте образец при температуре 4 °C в течение 12-16 ч на медленно движущемся шейкере.
   2. Удалите раствор первичного антитела и промойте образцы три раза в течение 10 минут с помощью PBS при RT на медленно движущемся шейкере.
4. Инкубация вторичных антител и ядерное окрашивание
   1. Аспирируйте оставшуюся промывку PBS и нанесите буфер для разбавления антител, содержащий вторичные антитела, в концентрациях, указанных производителем. Кроме того, добавьте DAPI или Hoechst (для маркировки ядер) или фаллоидин (для маркировки актина) в буфер в соотношении 1:250. Инкубировать в течение 2-4 ч при RT на медленно движущемся шейкере.
   2. Удалите раствор вторичных антител и промойте образцы три раза в течение 10 мин в PBS при RT на шейкере. Храните образцы в PBS при температуре 4 °C до получения изображения.

Результаты

Изображения, представленные на рисунке 1, представляют собой пример эпителиальных органоидов эпителия молочной железы дикого типа из тканей человека и мыши. Краткая иллюстрация метода выделения эпителиальных органоидов с помощью дифференциального центрифугирования ...

Обсуждение

В литературе описаны различные методы получения опухолевых органоидов. В этом протоколе описывается метод получения опухолевых органоидов непосредственно из опухоли без пассажа. Используя этот метод, опухолевые органоиды могут быть получены в течение нескольких часов после начала п...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mM HEPES Buffer	Gibco	15630080
100x Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-096
100x Glutamax	Life Technologies	35050-061	Glutamine supplement
100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)	Life Technologies	51500-056
100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Sigma	P4333
10x DMEM	Sigma	D2429
50 mL/0.2 µm filter flask	Fisher	#564-0020
Amphotericin B	Life Technologies	15290-018
bFGF	Sigma	F0291
BSA Solution (32%)	Sigma	#A9576
Cholera Toxin	Sigma	C8052
CO2-Independent Medium	Gibco	18045-088
Collagenase A	Sigma	C2139
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase)	Sigma	D4263
DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture	Sigma	D6546	Common basal medium
D-MEM/F12	Life Technologies	#10565-018	Basal cell medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Sigma	#D8662	PBS
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	#F0926
Gentamicin	Life Technologies	#15750-060
Human epidermal growth factor (EGF)	Sigma	E9644
Hydrocortisone	Sigma	H0396
Insulin	Sigma	#I9278
Matrigel	Corning	#354230	Basement Extracellular Matrix (BECM)
NaOH (1 N)	Sigma	S2770
Rat Tail Collagen I	Corning	354236
RPMI-1640 media	Fisher	SH3002701
Trypsin	Life Technologies	27250-018