JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

בעבודה זו, פרוטוקול דה-צלולריזציה עבר אופטימיזציה להשגת מטריצות דה-צלולריות של שרירי השלד של עכבר העובר. מיובלסטים C2C12 יכולים ליישב מטריצות אלה, להתרבות ולהבדיל. מודל זה במבחנה יכול לשמש לחקר התנהגות התא בהקשר של מחלות שרירי שלד כגון ניוון שרירים.

Abstract

המטריצה החוץ תאית (ECM) ממלאת תפקיד מכריע במתן תמיכה מבנית לתאים ובהעברת אותות החשובים לתהליכים תאיים שונים. מודלים דו-ממדיים (2D) של תרביות תאים מפשטים יתר על המידה את האינטראקציות המורכבות בין תאים לבין ECM, שכן היעדר תמיכה תלת-ממדית מלאה (3D) יכול לשנות את התנהגות התא, מה שהופך אותם לבלתי מספיקים להבנה של תהליכי in vivo . ליקויים בהרכב ECM ובאינטראקציות בין תאים ל-ECM הם תורמים חשובים למגוון מחלות שונות.

דוגמה אחת היא ניוון שרירים מולד LAMA2 (LAMA2-CMD), שבו היעדר או הפחתה של למינין פונקציונלי 211 ו 221 יכול להוביל היפוטוניות חמורה, לגילוי או מיד לאחר הלידה. עבודה קודמת באמצעות מודל עכבר של המחלה מציעה כי הופעתה מתרחשת במהלך מיוגנזה עוברית. המחקר הנוכחי נועד לפתח מודל תלת ממדי במבחנה שיאפשר לחקור את יחסי הגומלין בין תאי שריר לבין ECM שריר העובר, תוך חיקוי המיקרו-סביבה הטבעית. פרוטוקול זה משתמש בשרירי גב עמוקים שנותחו מעוברי עכבר E18.5, מטופלים בחיץ היפוטוני, חומר ניקוי אניוני ו- DNase. כתוצאה מכך, המטריצות הדה-צלולריות (dECMs) שמרו על כל חלבוני ECM שנבדקו (למינין α2, סך כל הלמינינים, פיברונקטין , קולגן I וקולגן IV) בהשוואה לרקמה הטבעית.

כאשר מיובלסטים C2C12 נזרעו על גבי dECMs אלה, הם חדרו והתיישבו ב-dECMs, מה שתמך בהתרבות ובהתמיינות שלהם. יתר על כן, תאי C2C12 ייצרו חלבוני ECM, ותרמו לעיצוב מחדש של הנישה שלהם בתוך dECMs. הקמת פלטפורמת מבחנה זו מספקת גישה חדשה ומבטיחה לפענוח התהליכים המעורבים בהופעת LAMA2-CMD, ויש לה פוטנציאל להיות מותאמת למחלות שרירי שלד אחרות שבהן ליקויים בתקשורת בין ECM לתאי שריר השלד תורמים להתקדמות המחלה.

Introduction

המטריצה החוץ תאית (ECM) היא מרכיב עיקרי של רקמות, המייצג את המרכיב הלא-תאי שלהן. מבנה תלת-ממדי (תלת-ממדי) זה לא רק מספק תמיכה פיזית לתאים, אלא גם ממלא תפקיד מכריע בתהליכים הביוכימיים המעורבים בהתפתחות אורגניזמים1. היווצרות ECM ספציפי לרקמה מתרחשת במהלך ההתפתחות, כתוצאה מהאינטראקציות המורכבות בין התאים לנישות שלהם, המושפעות מגירויים תוך-תאיים וחוץ-תאיים שונים. ECM הוא מבנה דינמי ביותר העובר סידורים כימיים ומכניים באופן זמני-מרחבי ומשפיע ישירות על גורל התא2. אחד המאפיינים הבולטים של ECM הוא המגוון התפקודי שלו, שכן כל ECM רקמה מציג שילוב ייחודי של מולקולות המספקות טופולוגיות ותכונות שונות המותאמות לתאים שהוא מכיל1.

איתות ותמיכה ב-ECM חיוניים להתפתחות ולהומאוסטזיס, וכאשר הם משובשים הם עלולים להוביל למצבים פתולוגיים מרובים 3,4. דוגמה אחת היא ניוון מולד חסר LAMA2 (LAMA2-CMD), שהיא הצורה הנפוצה ביותר של ניוון שרירים מולד. הגן LAMA2 מקודד לשרשרת למינין α2, אשר קיים בלמינין 211 ולמינין 221, וכאשר הוא עובר מוטציה יכול להוביל ל- LAMA2-CMD 5. למינין 211 הוא האיזופורם העיקרי שנמצא בקרום המרתף המקיף את סיבי שרירי השלד. כאשר למינין 211 אינו תקין או נעדר, הקשר בין קרום המרתף לתאי השריר משתבש, מה שמוביל להתפרצות המחלה6. חולים עם LAMA2-CMD מראים פנוטיפ קל עד חמור בהתאם לסוג המוטציה בגן LAMA2.

כאשר תפקודו של חלבון α2 למינין מושפע, חולים יכולים לחוות היפוטוניה חמורה בשרירים בלידה ולפתח דלקת כרונית, פיברוזיס וניוון שרירים, מה שמוביל לקיצור תוחלת החיים. עד היום לא פותחו טיפולים ממוקדים והגישות הטיפוליות מוגבלות להקלה על תסמיני המחלה7. לכן, הבנת המנגנונים המולקולריים הבסיסיים המעורבים בהתפרצות מחלה זו חיונית לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות מתאימות 6,8. עבודה קודמת שהשתמשה בעכבר dy W 9, מודל עבור LAMA2-CMD, מציעה כי הופעת המחלה מתחילה ברחם, במיוחד במהלך מיוגנזה עוברית10. הבנה טובה יותר של האופן שבו מופיע פגם המיוגנזה העוברית תשנה את כללי המשחק ביצירת גישות טיפוליות חדשניות עבור LAMA2-CMD.

מערכות במבחנה מספקות סביבה מבוקרת לחקר אינטראקציות תא-תא ו-ECM תא, אך מודלים של תרביות דו-ממדיות חסרים את המורכבות של רקמות טבעיות. דה-צלולריזציה של רקמות מייצרת פיגומים אצלולריים אצלולריים ספציפיים לרקמות ולשלבי התפתחות, המחקים בצורה מדויקת יותר את המיקרו-סביבה הטבעית של התא בהשוואה למודלים דו-ממדיים ופיגומים מהונדסים / סינתטיים. למטריצות דה-תאיות (dECMs) יש פוטנציאל לשמר את הרמזים המולקולריים והמכניים של הרקמה המארחת, מה שהופך אותן למודלים חלופיים טובים יותר להבנת תהליכים in vivo 11.

ישנן טכניקות, ריאגנטים ותנאים שונים שניתן להשתמש בהם לדצלולריזציה12,13. במחקר זה, פרוטוקול דה-צלולריזציה של לב עכבר העובר, שתואר על ידי Silva et al.14,15, מותאם לשרירי השלד של עכבר העובר ונמצא כי הוא שומר על כל רכיבי ECM שנבדקו (למינין α2, סך כל הלמינינים, פיברונקטין , קולגן I וקולגן IV). הפרוטוקול כולל שלושה שלבים: ליזה של תאים על ידי הלם אוסמוטי (חיץ היפוטוני), המסת קרום פלזמה ודיסוציאציה של חלבונים (0.05% נתרן דודציל סולפט [SDS]), והרס אנזימטי של DNA (טיפול DNase). למיטב ידיעתנו, זהו הפרוטוקול הראשון שנקבע לפירוק שרירי השלד העוברי של עכבר.

כדי להשתמש במערכת תלת-ממדית זו במבחנה לחקר LAMA2-CMD, חיוני לשמור על שרשרת α2 למינין לאחר דה-צלולריזציה. לכן, יושם פרוטוקול אופטימיזציה שבו נבדקו דטרגנטים שונים (SDS וטריטון X-100) וריכוזים (0.02%, 0.05%, 0.1%, 0.2% ו-0.5%) (הנתונים לא מוצגים). הבחירה האופטימלית להסרת תאים ושימור של חלבון למינין α2 נמצאה 0.05% SDS. תאי C2C12, קו תאי מיובלסטמבוסס היטב 16,17, שימשו לזרע dECMs. תאים אלה פולשים ל-dECM, מתרבים ומתמיינים בתוך פיגומים אלה, תוך סינתזה של חלבוני ECM חדשים. הייצור המוצלח של מודל תלת-ממדי זה במבחנה מציע גישה חדשה להבנת התהליכים המולקולריים והתאיים המעורבים במיוגנזה עוברית, הופעת LAMA2-CMD, וניתן להרחיב אותו למחלות שרירים אחרות שבהן התקשורת בין ECM לתאי שריר השלד משובשת.

Protocol

כל המתודולוגיות המתוארות אושרו על ידי הוועדה לרווחת בעלי חיים (ORBEA) של הפקולטה למדעים, אוניברסיטת ליסבון ו- Direção Geral de Veterinária (DGAV; ref. 0421/000/000/2022), והן בהתאם לדירקטיבה האירופית 2010/63/EU.

1. הכנת מאגרי דה-צלולריזציה וריאגנטים

הערה: יש לעקר את כל הפתרונות המשמשים במהלך פרוטוקול דה-צלולריזציה על ידי autoclaving ולאחסן למשך עד 3 חודשים, אלא אם צוין אחרת.

  1. הכן 10x מלח חוצץ פוספט (10x PBS) על ידי הוספת נתרן כלורי (NaCl) ב 137 mM, אשלגן כלורי (KCl) ב 2.68 mM, אשלגן דימימן פוספט (KH 2 PO 4) ב 8.1 mM, ודיסודיום-מימן-פוספט dihydrate (Na 2 HPO4) ב 1.47 mM למים demineralized (dH2O) ולהתאים את ה- pH ל 6.8. הוסף 100 מ"ל של 10x PBS ל- 900 מ"ל של H2O נטול מינרלים כדי ליצור PBS 1x. Autoclave ולאחסן בטמפרטורת החדר (RT). יש להוסיף תמיסת מלאי סטרילית של פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 U/mL פניצילין ו-10 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין [עט/סטרפטוקו]) לריכוז סופי של 1% לפני השימוש.
  2. הכן את המאגר ההיפוטוני על ידי המסת 1.21 גרם של Tris(hydroxymethyl)aminomethane (בסיס Tris) ו 1 גרם של חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ב 1 L של dH2O (10 mM Tris בסיס 0.1% EDTA). יש להשתמש במערבל מגנטי עד להמסה ולהתאים את רמת החומציות ל-7.8 עם NaOH/HCl. יש לעקר על ידי אוטוקלאבינג ולאחסן ב-RT. יש להוסיף עט/סטרפטוקוקוס לריכוז סופי של 1% לפני השימוש.
  3. הכן את חיץ הכביסה ההיפוטוני על ידי המסת 1.21 גרם של בסיס Tris ב 1 L של dH2O (10 mM בסיס Tris). יש להשתמש במערבל מגנטי עד להמסה ולהתאים את רמת החומציות ל-7.8 עם NaOH/HCl. Autoclave ולאחסן ב-RT. יש להוסיף עט/סטרפטוקוקוס ל-1% לפני השימוש.
  4. הכן את הטיפול בדטרגנט אניוני על ידי הוספת 0.05 גרם נתרן דודציל סולפט (SDS) ל -100 מ"ל של חיץ כביסה היפוטוני כדי לייצר פתרון טיפול 0.05% SDS. יש לסנן דרך מסנן ממברנות בגודל 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן ב-RT למשך עד חודש אחד.
    הערה: אין לבצע autoclaving של פתרון SDS, מכיוון ש-SDS מזרז ומתפרק בעת autoclaving.
  5. הכן את פתרון הטיפול DNase על ידי המסת 1.21 גרם של בסיס Tris ב 0.5 מ"ל של dH 2 O ולהוסיף 1 מ"ל של 1 M מגנזיום כלורי (MgCl2). כוונן את ה- pH ל- 7.8 עם NaOH/HCl. Autoclave ואחסן ב- RT. הוסף DNase I לפני השימוש (50 U/mL).

2. איסוף דוגמאות

הערה: עכברי בר מסוג C57/BL6 שימשו במחקר. כל הטכניקות נערכו במכסה מנוע זרימה למינרי בתנאים סטריליים.

  1. יש להרדים עכברות בוגרות בהריון ביום העוברי (E) 18.5 להריון באמצעות שאיפת איזופלורן ואחריה פריקת צוואר הרחם. יש להעביר את העכברים לדיסקציה סופנית כדי לחלץ את העוברים.
    1. לרסס את הבטן של העכבר עם 70% אתנול.
    2. בעזרת מלקחיים כירורגיים ומספריים מרימים קפל עור בבטן התחתונה ומבצעים חתך בצורת U כדי לחשוף את חלל הבטן18.
    3. אספו את קרני הרחם המכילות את עוברי E18.5 על ידי חיתוך האובידוקט וצוואר הרחם והעבירו אותם מיד לצלחת פטרי עם PBS 1x קר כקרח עם 1% עט/סטרפטוקוקוס18.
    4. הוציאו במהירות את העוברים מהרחם ומהרקמות החוץ-עובריות והרדימו אותם על ידי עריפת ראשים באמצעות מספריים18.
  2. העבירו עובר אחד בכל פעם לצלוחית פטרי עם PBS 1x קר כקרח. באמצעות מיקרוסקופ סטריאו, להסיר את העור לחתוך את הגפיים. מהצד הגחוני, לחתוך דרך כלוב הצלעות ולהסיר את עצם החזה ואת האיברים הבסיסיים.
  3. הפכו את החדק העוברי כלפי מעלה. הסר את החלק הצווארי של עמוד השדרה, את מצבורי השומן הגבי ואת רקמת החיבור על גבי שרירי הגב העמוקים.
  4. השתמש במלקחיים כירורגיים כדי לעגן את כלוב הצלעות ולגרד בזהירות ולנתק את שרירי הגב העמוקים מהרקמות שמסביב באמצעות מיקרו אזמל10. הליך זה מביא לבידוד של שתי חתיכות שריר לכל עובר (שמאל וימין), שתיהן מורכבות בעיקר משרירי לונגיסימוס ואיליוקוסטליס , כאשר חלק משרירי הטרנסוורסוסספינליס והלבטור קוסטרום כלולים.
  5. אחסנו את דגימות השריר ב-PBS 1x עם 1% עט/סטרפטוקוקוס ב-4°C לאחסון לטווח קצר (<1 שבוע), או ב-80°C לפרקי זמן ארוכים יותר.
    הערה: השתמש בדוגמאות חדשות שנאספו לקבלת התוצאות הטובות ביותר. דגימות שהוקפאו לתקופות ממושכות (>3 חודשים) מראות יעילות דה-צלולריזציה נמוכה יותר ויותר פירוק חלבונים. מסות שריר אפאקסיאליות שימשו לניסויי דה-צלולריזציה, אך שרירים אחרים (למשל, שרירי הגפיים) יכולים להיות מעובדים לדצלולריזציה באמצעות אותו פרוטוקול.

3. דה-צלולריזציה של שרירי השלד העוברי

הערה: כל הטכניקות בוצעו במכסה מנוע זרימה למינרית בתנאים סטריליים. לייצוג סכמטי מפורט, ראו איור 1A. כל השלבים בוצעו בתסיסה בשייקר מסלולי, בקוטר של 120 מ"מ (165 סל"ד) ב-25°C, אלא אם צוין אחרת. יש להוסיף 1% עט/סטרפטוקוקוס לתמיסות לפני השימוש. בעת הסרת התמיסות, יש לשאוף בזהירות כדי למנוע מלכודת דגימה בפיפטה.

  1. יום 1 - הכינו כ-2 מ"מ x 1 מ"מ x 1 מ"מ (~3.5 מ"ג) שברי רקמות ממסת השריר האפקסיאלית. הוסף 3 מ"ל של חיץ היפוטוני עם 1% עט / סטרפטוקוקוס לכל באר של צלחת 12 בארות והוסף שבר רקמת שריר שלם אחד לכל באר.
    1. לדגור על שברי הרקמה בחיץ היפוטוני עם תסיסה במשך 18 שעות (לילה) (O/N).
  2. יום 2 - שאפו את החיץ ההיפוטוני באמצעות פיפטה עדינה ושטפו את הדגימות 3 x 1 שעות עם 3 מ"ל של 1x PBS בכל פעם עם תסיסה.
    1. לדגור את הדגימות במשך 24 שעות עם 3 מ"ל של 0.05% SDS דטרגנט פתרון עם תסיסה.
      הערה: (נקודת ביקורת) לאחר דגירה של SDS, הדגימות צריכות להיות שקופות במראה. הדגימות מציגות עקביות דמוית ג'לטין ולכן נוטות יותר להיצמד לפיפטה בעת הסרת הנוזלים.
  3. יום 3 - הסר את תמיסת חומרי הניקוי SDS באמצעות פיפטה עדינה ושטוף את שברי הרקמה 3 x 20 דקות עם 3 מ"ל של חיץ שטיפה היפוטוני בכל פעם עם תסיסה.
    הערה: (נקודת השהיה) ניתן לשמור את הדגימות במאגר שטיפה היפוטוני ב-4°C למשך 18 שעות (O/N). ודא ש-SDS מוסר היטב במהלך שלבי הכביסה, מכיוון ששאריות SDS יכולות להיות ציטוטוקסיות.
    1. לדגור על שברי הרקמה במשך 3 שעות עם 2 מ"ל של תמיסת DNase עם תסיסה ב 37 ° C.
    2. הסר את תמיסת DNase באמצעות פיפטה עדינה ושטוף את שברי הרקמה 3 x 20 דקות עם 3 מ"ל של 1x PBS בכל פעם עם תסיסה. לבסוף, לשטוף O/N עם תסיסה (60 סל"ד).
      הערה: לאחר הטיפול ב- DNase, ה- dECMs הופכים לדביקים עקב נוכחות של שאריות DNA. לכן, כביסה זהירה היא הכרחית.
    3. אחסנו את ה-dECM ב-1x PBS עם 1% עט/סטרפטוקוקוס ב-4°C עד לרצלולריזציה (<1 שבוע). לשימושים אחרים, יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C.

4. הערכת איכות דה-סלולריזציה

הערה: כימות DNA, צביעת DAPI/מתיל ירוק וצביעת פלואדין בוצעו כדי להעריך את נוכחותם של תוכן תאים שיורית לאחר דה-צלולריזציה. אימונוהיסטוכימיה וניתוחי כתמים מערביים נערכו כדי להעריך את השימור של חלבוני ECM מרכזיים לאחר דה-צלולריזציה.

  1. כימות הדנ"א הקיים ב-dECM
    הערה: יש להשוות את dECMs לרקמה המקורית כדי לזהות נוכחות של DNA.
    1. לפני דה-צלולריזציה, יש לשקול צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל בקנה מידה דיגיטלי ברמת דיוק גבוהה. לפני העברת דגימת השריר לצינור, הסר את כל 1x PBS הנותרים באמצעות מגבת נייר. לשקול את הצינור עם הדגימה. חשב את המשקל הרטוב של הדגימות באמצעות משוואה (1):
      משקלרטוב לדוגמה = צינור משקלעם דוגמיות- צינור ריק משקל (1)
    2. בטל את הסלולריות של הדגימות בהתאם לפרוטוקול המתואר בסעיף 3.
    3. מניחים את הדגימות בצינורות מיקרוצנטריפוגות של 2 מ"ל.
      הערה: ניתן לשמור את הדגימות בטמפרטורה של -20°C עד למיצוי וכימות DNA.
    4. בצע מיצוי DNA של dECMs ודגימות רקמה מקוריות באמצעות ערכה מבוססת עמודת ספין. מוסיפים את מאגר העיכול בהתאם להוראות היצרן.
    5. הומוגניזציה של הדגימות בטחנת חרוזים פעמיים במשך 2.5 דקות בכל פעם (היפוך התושבות) באמצעות חרוז טונגסטן קרביד אחד לכל צינור (השתמש בתושבות צינור מקוררות).
    6. מוסיפים פרוטאינאז K ודגרים על O/N עם תסיסה איטית ב-56°C.
    7. המשך עם הפרוטוקול כמתואר בהוראות היצרן.
    8. יש להצמיד עם החיץ שסופק על ידי היצרן ולצנטריפוגה 2 x 1 דקות ב ≥6,000 x גרם, בכל פעם ב 4 ° C כדי להגדיל את תפוקת ה- DNA.
      הערה: DNA יכול להיות מאוחסן ב -20 ° C עד כימות.
    9. כמת את הדנ"א הקיים בדגימות באמצעות ערכת זיהוי dsDNA פלואורסצנטית בהתאם להוראות היצרן.
    10. לנרמל את תכולת ה- DNA כננוגרם של DNA למיליגרם של משקל רטוב מקורי של דגימה.
    11. נתח את הנתונים באמצעות מבחן t של סטודנט דו-זנבי ובטא כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM).
  2. אימונוהיסטוכימיה
    הערה: יש להכין את תמיסות 1, 2 ו-3 ואת התמיסה המקבעת לפני השימוש וניתן לשמור אותן קפואות עד 6 חודשים. כל הנוגדנים והצבעים המשמשים והדילולים המתאימים מפורטים ב טבלה 1.
    1. הכנת פתרונות
      1. הכן תמיסה מקבעת על ידי הוספת 2 גרם של paraformaldehyde (PFA), 8 גרם של סוכרוז, ו 24 μL של 1 M CaCl 2 עד 77 מ"ל של 0.2 M Na 2 HPO 4 ו 23 מ"ל של 0.2 M NaH 2 PO 4, לנפח סופי של 200 מ"ל על ידי הוספת dH2O. התאם את ה- pH ל7.4.
      2. הכן מאגר פוספט 0.12 M על ידי הוספת 13.5 גרם של Na 2 HPO 4 ו- 3.2 גרם של NaH 2 PO 4 עד 1 L של dH2O. התאם את ה- pH ל-7.4.
      3. הכן תמיסה 1 על ידי הוספת 4 גרם סוכרוז ל 100 מ"ל של חיץ פוספט 0.12 M.
      4. הכינו תמיסה 2 על ידי הוספת 15 גרם סוכרוז ל-100 מ"ל של חיץ פוספט 0.12 מ'.
      5. הכינו תמיסה 3 על ידי הוספת 15 גרם סוכרוז ו 7.5 גרם ג'לטין ל 100 מ"ל של חיץ פוספט 0.12 M. מחממים ב-37°C עד שהג'לטין מתמוסס.
      6. הכינו תמיסת מתיל גרין סטוק (2% אבקת מתיל גרין מומסת ב-dH2O)19.
    2. זיהוי חיסוני
      1. תקן את הדגימות באמצעות פתרון קיבוע לפחות 4 שעות ב 4 ° C.
      2. שטפו את הדגימות 2x במשך 10 דקות עם 1x PBS.
      3. יש לשמור O/N, או מעל יום אחד, בתמיסה 1 בטמפרטורה של 4°C.
      4. יש לשטוף ולשמור O/N או מעל יום אחד בתמיסה 2 ב-4°C. תנו לדגימות להתחמם ל-RT.
      5. יש לדגור במשך 3 שעות בתמיסה 3 בטמפרטורה של 37°C. יש לשמור תמיסה נוספת 3 בטמפרטורה של 37°C לשימוש מאוחר יותר.
      6. מיכלי עובש קטנים (2 ס"מ x 1 ס"מ x 1 ס"מ) ברדיד אלומיניום. מניחים שכבה דקה של תמיסה 3 במיכל היצוק ומניחים לה להתייצב. מניחים את הדגימות על תמיסה מוצקה 3 ומכסים בתמיסה חמה 3. לכוון את הדגימות ולתת להם להתמצק. סמן את המיקום בתמיסה 3 המוצקה באמצעות עט צבעוני.
      7. להקפיא על ידי הנחת המיכלים על פני השטח של isopentane יבש מקורר קרח או חנקן נוזלי.
      8. באמצעות תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (O.C.T.), קבע את קוביות הג'לטין הקפואות המכילות את הדגימות לתושבת ההקפאה.
      9. מחלקים את קוביות הג'לטין הקפואות ומעבירים את חלקי הרקמה לשקופיות. תנו להם להתייבש במשך 60 דקות.
      10. השתמש סמן הידרופובי כדי לעקוב אחר קו סביב המקטעים.
      11. שטפו את המגלשות 3 x 10 דקות ב-1x PBS.
      12. כסו את המקטעים באלבומין 1% בסרום בקר (BSA), 1% סרום עיזים ו-0.05% Triton X-100 מדולל ב-1x PBS (פתרון חוסם) למשך 30 דקות (שלב החסימה).
      13. לדלל את הנוגדנים העיקריים בתמיסת החסימה ולכסות את הסעיפים. יש לדגור על O/N בטמפרטורה של 4°C בקופסה סגורה, עם נייר לח, כדי למנוע מהחלקים להתייבש.
      14. שטפו את המגלשות 3 x 10 דקות עם 1x PBS.
      15. לדלל את הנוגדנים המשניים בתמיסה חוסמת ולכסות את הסעיפים. דגרו במשך 1.5 שעות ב-RT בחושך.
        הערה: יש להימנע מחשיפה לאור כדי למנוע התפרקות פלואורופור.
      16. שטפו את המגלשות 3 x 10 דקות עם 4x PBS.
        הערה: ניתן להשתמש בריכוז גבוה יותר של PBS כאשר קיים רקע חזק.
      17. שקעו את השקופיות בתמיסת DAPI (5 מיקרוגרם/מ"ל 1,4-diazabicyclo-2,2,2,2-אוקטן ב-0.1% Triton X-100/1x PBS) למשך 30 שניות כל אחת.
      18. יש לשטוף ב-PBS אחד.
      19. הרכיבו את החלקים במדיום מונע דהייה (50 מ"ג/מ"ל n-פרופיל-גלאט ב-1x PBS:גליצרול [1:9]) ואטמו עם כיסוי. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לתצפית ורכישת תמונה במיקרוסקופ פלואורסצנטי20.
        הערה: בניסויים באימונוהיסטוכימיה בטוטו , נעשה שימוש באותו פרוטוקול (ראה שלבים 4.2.2.12-4.2.2.18), למעט הדגימות שתוקנו בעבר ב-4% PFA מדולל ב-1x PBS למשך 3 שעות ב-RT. צביעת DNA בוצעה על ידי הוספת מתיל ירוק לתמיסת הנוגדנים המשנית. כל הנוגדנים והצבעים שבהם נעשה שימוש, והדילולים המתאימים להם, מפורטים בטבלה 1. לאחר מכן הותקנו הדגימות בתווך נגד דהייה בין שתי כיסויים המופרדים על ידי טבעות פלדה, הודבקו יחד עם שעוות דבורים, וערימות תמונה של 100 מיקרומטר נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי21.
  3. ניתוח כתמים מערביים
    הערה: כל הנוגדנים המשמשים והדילולים המתאימים מפורטים ב טבלה 1.
    1. הכנת פתרונות
      1. הכן את מאגר הטעינה 2x SDS-PAGE על-ידי הוספת 20 מ"ל גליצרול, 4 גרם SDS ו-0.2 מ"ל ברומופנול כחול ל-80 מ"ל של תמיסת הבסיס Tris של 100 מילימול. התאם את ה- pH ל- 6.8. יש להוסיף dithiothreitol טרי (DTT) לפני השימוש.
      2. הכינו את מאגר שטיפת המלח האגירה של Tris עם תמיסת Tween 20 (TBST) על ידי הוספת 2.4 גרם בסיס Tris, 8.8 גרם NaCl ו-1 מ"ל של Tween-20 ל-dH2O לנפח סופי של 1 L. כוונן את ה-pH ל-7.4-7.6 באמצעות HCl.
      3. הכן את מאגר הריצה (RB) 10x על ידי הוספת 30.2 גרם בסיס Tris, 144.2 גרם גליצין ו- 10 גרם SDS ל- 1 L של dH2O. לפני השימוש, הוסף 100 מ"ל של 10x RB ל 900 מ"ל של dH2O כדי להכין 1x RB (פתרון עבודה).
        הערה: בעוד שניתן לאחסן RB 10x ב- RT למשך מספר חודשים, ניתן לעשות שימוש חוזר ב- RB אחד בריצות שונות.
      4. הכן את מאגר ההעברה (TB) על ידי הוספת 5.82 גרם בסיס Tris, 2.93 גרם גליצין ו- 0.5 גרם SDS ל- 800 מ"ל של dH2O. לאחר המסת הרכיבים, להוסיף 200 מ"ל של מתנול. מצננים ב 4 °C.
        הערה: יש להכין את השחפת טרי לפני כל שימוש.
    2. מיצוי חלבונים
      1. אספו שרירים אפאקסיאליים מעכברי E18.5 והניחו אותם מיד בצינור מיקרוצנטריפוגה (2 מ"ל) המכיל 2x SDS-PAGE מאגר טעינה עם DTT טרי שנוסף (100 mM DTT). תהליך E18.5 dECM באותו אופן.
      2. הוסף חרוז טונגסטן קרביד אחד לכל צינור. הומוגניזציה 2x בטחנת חרוזים במשך 2.5 דקות בכל פעם (להפוך את התושבות).
      3. סוניק את הדגימות במשך 5 דקות באמבט אולטרסאונד.
      4. חממו את הדגימות במשך 10 דקות בטמפרטורה של 50°C.
      5. צנטריפוגה הדגימות ב 12,000 × גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C.
      6. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי בנפח 1.5 מ"ל.
      7. כמת את החלבון באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח.
      8. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש חדש.
    3. אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד
      1. יש להשתמש בג'ל הדרגתי אקרילאמיד פריקאסט (4%-20%)
      2. הר את הג'ל במיכל האלקטרופורזה. מוציאים את המסרק בזהירות. הוסף RB 1x עד לקו המוצג במיכל האלקטרופורזה. ודא שהבארות מלאות RB.
      3. יש להעמיס 100 מק"ג חלבון לדגימה בבארות. עומס 12 μL של חלבון במשקל מולקולרי גבוה סטנדרטי.
      4. לרוץ בסך הכל 100 דקות עם מתח קבוע (10 דקות ב 150 V ו 90 דקות ב 185 V).
    4. העברה
      1. השרו את רפידות המסנן והספוגים בשחפת צוננת (4°C) בזמן שהג'ל פועל.
      2. חותכים את קרום polyvinylidene difluoride לגודל של ג'ל. הפעל אותם עם מתנול ולשטוף עם dH2O. להשרות את השחפת.
      3. הרכיבו את קסטת ההעברה עם הספוגים, רפידות הפילטר, הג'לים והקרומים הפעילים בהתאם להוראות היצרן.
      4. הניחו את הקלטת במיכל האלקטרופורזה המכיל את השחפת המצוננת (על מצע קרח). הוסיפו את יחידת הקירור. לרוץ במשך 90 דקות ב 100 V.
      5. לאחר ההעברה, כתם עם תחליף כחול קומאסי כדי להעריך את איכות ההעברה.
    5. זיהוי חיסוני
      1. הכינו את תמיסת החסימה (TBST עם חלב דל שומן 5%). לדגור את הממברנות עם תסיסה במשך 1 שעה ב RT.
      2. יש לשטוף 3 x 5 שניות עם TBST.
      3. לדגור על הממברנות O/N עם נוגדנים ראשוניים מדוללים ב-TBST עם 2% BSA ו-0.02% נתרן אזיד (3 מ"ל לממברנה) בתא קר (4°C) עם תסיסה.
      4. למחרת, שטפו 3X5 דקות עם TBST.
      5. לדגור על הממברנות עם נוגדנים משניים מצומדים של חזרת פרוקסידאז (HRP) מדוללים ב-TBST עם חלב דל שומן 5% (5 מ"ל לכל ממברנה) למשך שעה אחת ב-RT.
      6. שטפו את הממברנות עם TBST 3 x 5 דקות. שמור ב-TBST עד לשלב הזיהוי.
      7. דמיינו את החלבון באמצעות ערכת פיתוח מסחרית. הוסף ריאגנטים לגילוי בהתאם להוראות היצרן. רכוש תמונות של הלהקות.
      8. כדי לבדוק יותר מנוגדן אחד לכל ממברנה, לאחר שלב הזיהוי, הפשיט את הנוגדנים הקודמים בשלוש שטיפות (5 דקות כל אחת) באמצעות TBST וחזור על שלבים 4.3.5.2-4.3.5.7.

טבלה 1: נוגדנים וצבעים המשמשים באימונוהיסטוכימיה ובניתוח כתמים מערביים והדילולים המתאימים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.10,22

5. תרבית תאים במטריצות דה-סלולריות

הערה: כל הטכניקות בוצעו בתנאים סטריליים במכסה מנוע זרימה למינרית. כל הדגירות בוצעו ב 37 ° C ועם 5% CO2.

  1. הכינו את מדיום תרבית התאים ועתיר הגלוקוז מדיום הנשר המעובד של דולבקו עם גלוטמין יציב ועם נתרן פירובט (DMEM), בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% עט/סטרפטוקוקוס (מדיום תרבית שלם).
  2. הניחו את ה-dECM בצלוחית פטרי ב-1x PBS עם 1% עט/סטרפטוקוקוס במכסה מנוע של זרימה למינרית והפרידו אותם לחתיכות של כ-500 מיקרומטר x 500 מיקרומטר x 250 מיקרומטר, באמצעות מיקרו אזמל ופינצטה.
    הערה: ל-dECMs יש מרקם רך, ולכן לעתים קרובות קל יותר להשתמש בפינצטה כדי להפריד אותם לחתיכות בערך באותו גודל במקום לחתוך אותם עם אזמל המיקרו.
  3. מעבירים את השברים לתוך צלחת 96 באר (שלוש או ארבע חתיכות לכל באר) עם 200 μL של מדיום תרבית שלם, שחומם בעבר ל 37 מעלות צלזיוס. דגירה במשך שעתיים באינקובטור.
  4. הוסף 500 μL של טריפסין לבקבוק T25 זרע עם תת-מפגש (~ 70%) C2C12 תאים. Resuspend ב 1 מ"ל של מדיום מלא.
  5. הוסף 10 μL של המתלה ל 10 μL צבע כחול Trypan ולטעון לתוך hemocytometer. ספור וחשב את מספר התא ואשר את כדאיות התא.
  6. שאפו את התווך מלוח 96 הקידוחים המכיל את ה-dECMs והוסיפו 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית שלם המכיל 50,000 תאי C2C12 בני קיימא.
  7. לדגור במשך 2 ימים ולאחר מכן, באמצעות פינצטה, להעביר את dECMs (עם התאים) צלחת 48 באר עם 400 μL של מדיום תרבית שלם. כל יומיים, בזהירות לשאוף את המדיום עם micropipette כדי למנוע dECMs להתנתק מתחתית הבאר ולהוסיף מדיום טרי עד יום 8.
    הערה: מטריצות נשמרות במשך יומיים בצלחות של 96 בארות כדי לקדם הידבקות תאי C2C12 ל-dECMs, ולאחר מכן מועברות לצלחת של 48 בארות כדי לאפשר גישה לנפח גדול יותר של תווך עם חומרים מזינים. dECMs צריך לדבוק בתחתית הבארות.
  8. עבור ניסוי ההתמיינות, החלף את מדיום התרבית המלא במדיום התמיינות (DMEM בתוספת 2% נסיוב סוסים ו-1% עט/סטרפטוקו) ביום 8, ולאחר מכן דגירה במדיום התמיינות במשך 4 ימים עד יום 12.

תוצאות

מטרת פרוטוקול הדה-צלולריזציה היא לייצר dECMs הדומים מאוד להרכב הרקמה הטבעית. כדי לקבוע את יעילות תהליך הדה-צלולריזציה, נעשה שימוש בשיטות שונות, כולל בדיקת מורפולוגיה של רקמות, מדידת רמות DNA, צביעה עבור F-actin, וניתוח של רכיבי ECM מרכזיים באמצעות אימונוהיסטוכימיה וטכניקות הכתמה מערביות. באופן ספצ...

Discussion

ECM היא רשת מורכבת של מקרומולקולות הקיימת בכל הרקמות וממלאת תפקיד מכריע בוויסות התנהגות התא ותפקודו2. ה-ECM משמש כפיגום פיזי שאליו תאים יכולים להיצמד ומספק רמזים המווסתים באופן פעיל תהליכים תאיים כגון התפשטות, תנועתיות, התמיינות ואפופטוזיס. לפיכך, היווצרות נכונה ותחזוקה של ECM חי...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי האגודה הצרפתית contre les Myopathies (AFM-Téléthon; חוזה מס' 23049), פרויקט MATRIHEALTH, ויחידת cE3c מימון UIDB/00329/2020. ברצוננו להודות לתורם שלנו הנריקה מיירלס שבחר לתמוך בפרויקט MATRIHEALTH. עבודה זו נהנתה מהתשתיות של מתקן המיקרוסקופיה של הפקולטה למדעים, צומת של הפלטפורמה הפורטוגזית של הדמיה ביולוגית (סימוכין PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), ואנו מודים לואיס מרקס על עזרתו ברכישת ועיבוד תמונה. לבסוף, אנו מודים למרתה פלמה על התמיכה הטכנית ולצוות המחקר שלנו על תרומתם הנדיבה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, SterileAbdos LabwareP21021
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochlorideMerckD8417
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast GelBio-Rad4561093
48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, SterileAbdos LabwareP21023
96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, SterileAbdos LabwareP21024
Bovine Serum Albumin, Fraction VNZYtechMB04601
BX60 fluorescence microscopeOlympus
Cryostat CM1860 UVLeica
DithiothreitolThermoFisherR0862
DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvateBiowestL0103-500
DNase IPanReac AppliChemA3778
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen69506
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Merck108418
Fetal bovine serumBiowestS1560-500
Fine tip transfer pipetteThermoFisher15387823
Goat serumBiowestS2000-100
Hera Guard Flow CabinetHeraeus
Heracell 150 CO2 IncubatorThermo Scientific
HiMark Pre-stained Protein StandardInvitrogen
Horse Serum, New Zealand originGibco16050122
HRP-α- Rabbit IgGabcamab205718
HRP-α- Rat IgGabcamab205720
HRP-α-Mouse IgGabcamab205719
ImageJ v. 1.53t
Methyl GreenSigma-Aldrich67060
MM400 Tissue LyserRetsch
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer ThermoFisher
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol freeAlfa Aesar043368-9M
Penicillin-Streptomycin (100x) GRiSPGTC05.0100
Phalloidin Alexa 488 Thermo Fisher Sci.A12379
Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile)Greiner Bio-One628161
Qubit dsDNA HS kitThermo ScientificQ32851
Qubit™ 3 FluorometerInvitrogen15387293
S6E Zoom Stereo microscopeLeica
Sodium Dodecyl SulfateMerck11667289001
SuperFrost® Plus adhesion slidesThermo Scientific631-9483
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent SubstrateThermo Scientific15626144
TCS SPE confocal microscopeLeica
Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99%VWR Chemicals28811.295
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco15250061
Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X)GRiSPGTC02.0100
TWEEN 20 (50% Solution)ThermoFisher3005
WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm)AdvanstaL-08024-001
α-Collagen Iabcamab21286
α-Collagen IVMilliporeAB756P
α-Collagen IVSanta Cruz Biotechnologysc-398655
α-FibronectinSigmaF-3648
α-Laminin α2 SigmaL-0663
α-MHCD.S.H.B.MF20
α-Mouse Alexa 488Molecular ProbesA11017
α-Mouse Alexa 568Molecular ProbesA11019
α-pan-LamininSigmaL- 9393
α-phospho-histone 3Merk Millipore06-570
α-Rabbit Alexa 568Molecular ProbesA21069
α-Rabbit Alexa 488Molecular ProbesA11070
α-Rat Alexa 488Molecular ProbesA11006

References

  1. Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
  2. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  3. Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Genetic disorders of the extracellular matrix. Anatomical Record. 303 (6), 1527-1542 (2020).
  4. Ahmad, K., Shaikh, S., Ahmad, S. S., Lee, E. J., Choi, I. Cross-talk between extracellular matrix and skeletal muscle: implications for myopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 142 (2020).
  5. Tome, F. M., et al. Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences. Serie III, Sciences de la Vie. 317 (4), 351-357 (1994).
  6. Gawlik, K. I., Durbeej, M. Skeletal muscle laminin and MDC1A: pathogenesis and treatment strategies. Skeletal Muscle. 1 (1), 9 (2011).
  7. van Ry, P. M., et al. ECM-related myopathies and muscular dystrophies: pros and cons of protein therapies. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1519-1536 (2017).
  8. Gawlik, K. I., Durbeej, M. A family of laminin α2 chain-deficient mouse mutants: advancing the research on LAMA2-CMD. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 59 (2020).
  9. Kuang, W., et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models. Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 844-852 (1998).
  10. Nunes, A. M., et al. Impaired fetal muscle development and JAK-STAT activation mark disease onset and progression in a mouse model for merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 26 (11), 2018-2033 (2017).
  11. McCrary, M. W., Bousalis, D., Mobini, S., Song, Y. H., Schmidt, C. E. Decellularized tissues as platforms for in vitro modeling of healthy and diseased tissues. Acta Biomaterialia. 111, 1-19 (2020).
  12. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  13. Philips, C., Terrie, L., Thorrez, L. Decellularized skeletal muscle: A versatile biomaterial in tissue engineering and regenerative medicine. Biomaterials. 283, 121436 (2022).
  14. Silva, A. C., et al. Comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3D-like platforms for in vitro studies. Journal of Visualized Experiments. (145), e56924 (2019).
  15. Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
  16. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
  17. Burattini, S., et al. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry. 48 (3), 223-233 (2004).
  18. Murphy, D. Caesarean section and fostering. Methods in Molecular Biology. 18, 177-178 (1993).
  19. Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-specific stain methyl green in the fluorescent labeling of embryos. Journal of Visualized Experiments. (99), e52769 (2015).
  20. Lichtman, J. W., Conchello, J. -. A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
  21. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  22. Paulsson, M. A.T.S. Biosynthesis, tissue distribution and isolation of laminins. The Laminins. , 1-26 (1994).
  23. Fedecostante, M., et al. Recellularized native kidney scaffolds as a novel tool in nephrotoxicity screening. Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals. 46 (9), 1338-1350 (2018).
  24. Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
  25. Brouki Milan, P., et al. Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery. Methods. 171, 62-67 (2020).
  26. Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Collagen VI disorders: Insights on form and function in the extracellular matrix and beyond. Matrix Biology. 71, 348-367 (2018).
  27. Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
  28. White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
  29. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences. Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).
  30. Ma, X., et al. Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells. Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101 (2017).
  31. Wu Young, M. Y., et al. Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss. Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE193

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved