JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной работе был оптимизирован протокол децеллюляризации для получения децеллюляризированных матриц скелетных мышц плода мыши. Миобласты C2C12 могут колонизировать эти матрицы, размножаться и дифференцироваться. Эта модель in vitro может быть использована для изучения поведения клеток в контексте заболеваний скелетных мышц, таких как мышечные дистрофии.

Аннотация

Внеклеточный матрикс (ECM) играет решающую роль в обеспечении структурной поддержки клеток и передаче сигналов, которые важны для различных клеточных процессов. Двумерные (2D) модели клеточных культур чрезмерно упрощают сложные взаимодействия между клетками и ECM, поскольку отсутствие полной трехмерной (3D) поддержки может изменить поведение клеток, делая их неадекватными для понимания процессов in vivo . Недостатки в составе ECM и взаимодействиях между клетками и ECM являются важными факторами, способствующими множеству различных заболеваний.

Одним из примеров является врожденная мышечная дистрофия LAMA2 (LAMA2-CMD), при которой отсутствие или снижение функционального ламинина 211 и 221 может привести к тяжелой гипотонии, обнаруживаемой при рождении или вскоре после него. Предыдущая работа с использованием мышиной модели заболевания предполагает, что его начало происходит во время миогенеза плода. Настоящее исследование было направлено на разработку 3D-модели in vitro , позволяющей изучать взаимодействия между мышечными клетками и ECM мышц плода, имитируя нативное микроокружение. В этом протоколе используются глубокие мышцы спины, рассеченные из плодов мыши E18.5, обработанные гипотоническим буфером, анионным моющим средством и ДНКазой. Полученные децеллюляризованные матрицы (dECM) сохранили все протестированные белки ECM (ламинин α2, общие ламинины, фибронектин, коллаген I и коллаген IV) по сравнению с нативной тканью.

Когда миобласты C2C12 были посеяны поверх этих dECM, они проникли и колонизировали dECM, что поддерживало их пролиферацию и дифференцировку. Кроме того, клетки C2C12 продуцируют белки ECM, способствуя ремоделированию их ниши в dECM. Создание этой платформы in vitro обеспечивает новый многообещающий подход к разгадке процессов, связанных с возникновением LAMA2-CMD, и может быть адаптировано к другим заболеваниям скелетных мышц, где недостатки в коммуникации между ECM и клетками скелетных мышц способствуют прогрессированию заболевания.

Введение

Внеклеточный матрикс (ECM) является основным компонентом тканей, представляя их неклеточный компонент. Эта трехмерная (3D) структура не только обеспечивает физическую поддержку клеток, но и играет решающую роль в биохимических процессах, участвующих в развитии организмов1. Формирование тканеспецифической ЭКМ происходит в процессе развития, в результате сложных взаимодействий между клетками и их нишами, на которые влияют различные внутри- и внеклеточные раздражители. ECM представляет собой высокодинамичную структуру, которая претерпевает химические и механические перестройки временно-пространственным образом и напрямую влияет на судьбу клетки2. Одной из наиболее примечательных характеристик ECM является его функциональное разнообразие, поскольку каждая тканевая ECM отображает уникальную комбинацию молекул, которые обеспечивают различные топологии и свойства, адаптированные к содержащимся в ней клеткам1.

Передача сигналов и поддержка ECM имеют решающее значение для развития и гомеостаза, и при нарушении могут привести к множественным патологическим состояниям 3,4. Одним из примеров является врожденная дистрофия с дефицитом LAMA2 (LAMA2-CMD), которая является наиболее распространенной формой врожденной мышечной дистрофии. Ген LAMA2 кодирует цепь ламинина α2, которая присутствует в ламинине 211 и ламинине 221, и при мутации может привести к LAMA2-CMD 5. Ламинин 211 является основной изоформой, обнаруженной в базальной мембране, окружающей волокна скелетных мышц. Когда ламинин 211 является аномальным или отсутствует, связь между базальной мембраной и мышечными клетками нарушается, что приводит к возникновению заболевания6. Пациенты с LAMA2-CMD демонстрируют фенотип от легкой до тяжелой степени в зависимости от типа мутации в гене LAMA2.

Когда нарушается функция белка ламинина α2, пациенты могут испытывать тяжелую мышечную гипотонию при рождении и развивать хроническое воспаление, фиброз и мышечную атрофию, что приводит к сокращению продолжительности жизни. На сегодняшний день не разработано таргетных методов лечения, а терапевтические подходы ограничиваются облегчением симптомов заболевания7. Таким образом, понимание основных молекулярных механизмов, участвующих в возникновении этого заболевания, имеет решающее значение для разработки соответствующих терапевтических стратегий 6,8. Предыдущая работа с использованием мыши dyW 9, модели для LAMA2-CMD, предполагает, что начало заболевания начинается в утробе матери, особенно во время миогенезаплода 10. Лучшее понимание того, как возникает дефект миогенеза плода, изменит правила игры в создании новых терапевтических подходов для LAMA2-CMD.

Системы in vitro обеспечивают контролируемую среду для изучения межклеточных и клеточно-ECM-взаимодействий, но 2D-моделям культур не хватает сложности нативных тканей. Децеллюляризация тканей производит тканеспецифические и стадия развития бесклеточные каркасы ECM, которые более точно имитируют естественное микроокружение клеток по сравнению с 2D-моделями и инженерными/синтетическими каркасами. Децеллюлярные матрицы (dECM) обладают потенциалом для сохранения молекулярных и механических сигналов ткани хозяина, что делает их лучшими альтернативными моделями для понимания процессов in vivo 11.

Существуют различные методы, реагенты и условия, которые могут быть использованы для децеллюляризации12,13. В этом исследовании протокол децеллюляризации сердца плода мыши, описанный Silva et al.14,15, адаптирован к скелетным мышцам плода мыши и, как было обнаружено, сохраняет все протестированные компоненты ECM (ламинин α2, общие ламинины, фибронектин, коллаген I и коллаген IV). Протокол включает три этапа: лизис клеток осмотическим шоком (гипотонический буфер), растворение плазматической мембраны и диссоциацию белка (0,05% додецилсульфата натрия [SDS]) и ферментативное разрушение ДНК (обработка ДНКазой). Насколько нам известно, это первый установленный протокол децеллюляризации скелетных мышц плода мыши.

Чтобы использовать эту 3D-систему in vitro для изучения LAMA2-CMD, крайне важно поддерживать цепь ламинина α2 после децеллюляризации. Поэтому был реализован протокол оптимизации, в котором тестировались различные моющие средства (SDS и Triton X-100) и концентрации (0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2% и 0,5%) (данные не показаны). Было обнаружено, что оптимальным выбором для удаления клеток и сохранения белка ламинина α2 является 0,05% SDS. Клетки C2C12, хорошо зарекомендовавшая себя линияклеток миобластов 16,17, были использованы для посева dECM. Эти клетки вторгаются в dECM, размножаются и дифференцируются внутри этих каркасов, синтезируя новые белки ECM. Успешное создание этой 3D-модели in vitro предлагает новый подход к пониманию молекулярных и клеточных процессов, участвующих в миогенезе плода, начале LAMA2-CMD, и может быть распространено на другие мышечные заболевания, при которых нарушается связь между ECM и клетками скелетных мышц.

протокол

Все описанные методологии были одобрены Комитетом по благополучию животных (ORBEA) факультета естественных наук Лиссабонского университета и Direção Geral de Veterinária (DGAV; арт. 0421/000/000/2022) и соответствуют Европейской директиве 2010/63/ЕС.

1. Приготовление децеллюляризационных буферов и реагентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы, используемые во время протокола децеллюляризации, должны быть стерилизованы автоклавированием и храниться до 3 месяцев, если не указано иное.

  1. Приготовьте 10-кратный фосфатно-буферный физиологический раствор (10x PBS), добавив хлорид натрия (NaCl) при 137 мМ, хлорид калия (KCl) при 2,68 мМ, дигидрофосфат калия (KH 2 PO 4) при 8,1 мМ и дигидрат натрий-водород-фосфата (Na 2 HPO4) при 1,47 мМ в деминерализованной воде (dH2O) и отрегулируйте рН до 6,8. Добавьте 100 мл 10x PBS к 900 мл деминерализованного H2O для получения 1x PBS. Автоклав и хранить при комнатной температуре (RT). Перед использованием добавьте стерильный исходный раствор пенициллина/стрептомицина (10 000 ЕД/мл пенициллина и 10 мг/мл стрептомицина [ручка/стрептококк]) до конечной концентрации 1%.
  2. Приготовьте гипотонический буфер, растворив 1,21 г трис(гидроксиметил)аминометана (трис-основания) и 1 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в 1 лdH2O (10 мМ трис-основания 0,1% ЭДТА). Используйте магнитную мешалку до полного растворения и отрегулируйте pH до 7,8 с помощью NaOH / HCl. Стерилизовать автоклавированием и хранить при RT. Перед использованием добавьте ручку/стрептококк до конечной концентрации 1%.
  3. Приготовьте гипотонический буфер для промывки, растворив 1,21 г основания Tris в 1 л dH2O (10 мМ основания Tris). Используйте магнитную мешалку до растворения и отрегулируйте pH до 7,8 с помощью NaOH / HCl. Автоклав и хранить при RT. Добавьте ручку / стрептококк до 1% перед использованием.
  4. Приготовьте анионное моющее средство, добавив 0,05 г додецилсульфата натрия (SDS) к 100 мл гипотонического буфера для промывки для получения 0,05% раствора для обработки SDS. Фильтруйте через мембранный фильтр 0,22 мкм. Хранить при RT до 1 месяца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор SDS не следует автоклавировать, так как SDS выпадает в осадок и разлагается при автоклавировании.
  5. Приготовьте раствор для обработки ДНКазой, растворив 1,21 г основания Tris в 0,5 мл dH 2 O и добавив1 мл 1 М хлорида магния (MgCl2). Отрегулируйте рН до 7,8 с помощью NaOH / HCl. Автоклав и храните при RT. Добавьте ДНКазу I перед использованием (50 ЕД / мл).

2. Сбор образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: В исследовании использовались мыши дикого типа C57 / BL6. Все методики проводились в ламинарном колпаке в стерильных условиях.

  1. Усыпляют взрослых беременных самок мышей на эмбриональный день (E) 18,5 беременности с помощью ингаляции изофлурана с последующим вывихом шейки матки. Подвергните мышей терминальному вскрытию, чтобы извлечь плоды.
    1. Опрыскайте живот мыши 70% этанолом.
    2. С помощью хирургических щипцов и ножниц приподнимите складку кожи внизу живота и сделайте U-образный разрез, чтобы обнажить брюшную полость18.
    3. Соберите рога матки, содержащие плоды E18.5, разрезав яйцеводы и шейку матки, и немедленно перенесите их в чашку Петри с ледяным 1x PBS с 1% пером / стрептококком18.
    4. Быстро извлекают плоды из матки и внезародышевых тканей и усыпляют их путем обезглавливания с помощью ножниц18.
  2. Перекладывайте по одному плоду в чашку Петри с ледяным 1x PBS. С помощью стереомикроскопа снимают кожу и отрезают конечности. С брюшной стороны прорежьте грудную клетку и удалите грудину и нижележащие органы.
  3. Переверните туловище плода тыльной стороной вверх. Удалите шейную часть позвоночника, дорсальные жировые отложения и соединительную ткань поверх глубоких мышц спины.
  4. Используйте хирургические щипцы, чтобы закрепить грудную клетку и осторожно соскоблить и отделить глубокие мышцы спины от окружающих тканей с помощью микроскальпеля10. Эта процедура приводит к выделению двух мышечных частей на плод (левой и правой), которые в основном состоят из длинной и подвздошно-реберной мышц, включая некоторые трансверсоспинальные мышцы и мышцы, поднимающие костарную мышцу .
  5. Храните образцы мышц в 1x PBS с 1% ручкой/стрептококком при 4 ° C для краткосрочного хранения (<1 неделя) или при -80 ° C в течение более длительных периодов времени.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов используйте свежесобранные образцы. Образцы, замороженные в течение длительных периодов времени (>3 месяца), демонстрируют более низкую эффективность децеллюляризации и большую деградацию белка. Для экспериментов по децеллюляризации использовались эпаксиальные мышечные массы, но другие мышцы (например, мышцы конечностей) могут быть обработаны для децеллюляризации с использованием того же протокола.

3. Децеллюляризация скелетных мышц плода

ПРИМЕЧАНИЕ: Все методики проводились в ламинарном колпаке в стерильных условиях. Подробное схематическое изображение см. на рисунке 1A. Все шаги выполнялись с перемешиванием в орбитальном шейкере диаметром 120 мм (165 об/мин) при 25 °C, если не указано иное. Перед употреблением добавляйте в растворы 1% шприц-ручки/стрептококка. При удалении растворов тщательно аспирируйте, чтобы избежать попадания образца в пипетку.

  1. День 1 - Подготовьте примерно 2 мм x 1 мм x 1 мм (~ 3,5 мг) фрагменты ткани из эпаксиальных мышечных масс. Добавьте 3 мл гипотонического буфера с 1% ручкой/стрептококком в каждую лунку 12-луночной пластины и добавьте по одному цельному фрагменту мышечной ткани в каждую лунку.
    1. Инкубируют фрагменты тканей в гипотоническом буфере с перемешиванием в течение 18 ч (на ночь) (О/Н).
  2. День 2 - Аспирируйте гипотонический буфер с помощью пипетки с тонким наконечником и промывайте образцы 3 x 1 ч 3 мл 1x PBS каждый раз с перемешиванием.
    1. Инкубируют образцы в течение 24 ч с 3 мл 0,05% раствора моющего средства SDS при перемешивании.
      ПРИМЕЧАНИЕ: (КОНТРОЛЬНАЯ ТОЧКА) После инкубации SDS образцы должны быть прозрачными на вид. Образцы имеют желатиноподобную консистенцию и, следовательно, более склонны прилипать к пипетке при удалении жидкостей.
  3. День 3 - Удалите раствор моющего средства SDS с помощью пипетки с тонким наконечником и промойте фрагменты ткани 3 x 20 мин 3 мл гипотонического буфера для промывания каждый раз при перемешивании.
    ПРИМЕЧАНИЕ: (ТОЧКА ПАУЗЫ) Образцы можно выдерживать в гипотоническом буфере для промывки при 4 °C в течение 18 ч (М/Н). Убедитесь, что SDS хорошо удален на этапах стирки, так как остаточные SDS могут быть цитотоксичными.
    1. Инкубируют фрагменты ткани в течение 3 ч с 2 мл раствора ДНКазы при перемешивании при 37 °C.
    2. Удалите раствор ДНКазы с помощью пипетки с тонким наконечником и промойте фрагменты ткани 3 x 20 мин 3 мл 1x PBS каждый раз с перемешиванием. Наконец, промойте O/N с перемешиванием (60 об/мин).
      ПРИМЕЧАНИЕ: После обработки ДНКазой dECM становятся липкими из-за присутствия остатков ДНК. Поэтому необходима тщательная стирка.
    3. Храните dECM в 1x PBS с 1% ручкой/стрептококком при 4 °C до рецеллюляризации (<1 неделя). Для других целей хранить при температуре -80 °C.

4. Оценка качества децеллюляризации

ПРИМЕЧАНИЕ: Количественное определение ДНК, окрашивание DAPI / метиловым зеленым и окрашивание фаллоидином были выполнены для оценки наличия остаточного содержимого клеток после децеллюляризации. Иммуногистохимия и вестерн-блоттинг были проведены для оценки сохранения ключевых белков ECM после децеллюляризации.

  1. Количественная оценка ДНК, присутствующей в dECM
    ПРИМЕЧАНИЕ: dECM следует сравнивать с нативной тканью, чтобы обнаружить присутствие ДНК.
    1. Перед децеллюляризацией взвесьте микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл на высокоточных цифровых весах. Перед переносом мышечного образца в пробирку удалите все оставшиеся 1x PBS с помощью бумажного полотенца. Взвесьте пробирку с образцом. Рассчитайте сырой вес образцов, используя уравнение (1):
      Сырой вес образца = весоваяпробирка с образцами -вес пустой пробирки (1)
    2. Децеллюляризируйте образцы в соответствии с протоколом, описанным в разделе 3.
    3. Поместите образцы в микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно хранить при -20 ° C до экстракции и количественного определения ДНК.
    4. Выполните экстракцию ДНК dECM и образцов нативных тканей с помощью набора на основе спиновой колонки. Добавьте буфер для разложения в соответствии с инструкциями производителя.
    5. Гомогенизируйте образцы в бисерной мельнице два раза в течение 2,5 минут каждый раз (переворачивая крепления), используя один шарик карбида вольфрама на трубку (используйте крепления для охлажденных труб).
    6. Добавьте протеиназу К и инкубируйте O/N при медленном перемешивании при 56 °C.
    7. Следуйте протоколу, как описано в инструкциях производителя.
    8. Разбавляют буфером, предоставленным производителем, и центрифугой 2 x 1 мин при ≥6000 x g, каждый раз при 4 °C для увеличения выхода ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК можно хранить при -20 ° C до количественного определения.
    9. Количественно определите ДНК, присутствующую в образцах, с помощью флуоресцентного набора для обнаружения дцДНК, следуя инструкциям производителя.
    10. Нормализуйте содержание ДНК в нанограммах ДНК на миллиграмм исходного сырого веса образца.
    11. Проанализируйте данные с помощью двустороннего t-критерия Стьюдента и выразите как среднее ± стандартную ошибку среднего значения (SEM).
  2. Иммуногистохимия
    ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы 1, 2 и 3 и фиксирующий раствор должны быть приготовлены перед использованием и могут храниться в замороженном виде до 6 месяцев. Все используемые антитела и красители, а также соответствующие разведения перечислены в Таблица 1.
    1. Приготовление растворов
      1. Приготовьте фиксирующий раствор, добавив 2 г параформальдегида (ПФА), 8 г сахарозы и 24 мкл 1 МCaCl2 до 77 мл 0,2 М Na 2 HPO 4 и 23 мл 0,2 М 2 PO 4 доконечного объема 200 мл, добавив dH2O. Отрегулируйте рН до7,4.
      2. Приготовьте 0,12 М фосфатного буфера, добавив 13,5 г Na 2 HPO 4и 3,2 г 2 PO 4 к 1 л dH2O. Отрегулируйте pH до7,4.
      3. Готовят раствор 1, добавляя 4 г сахарозы к 100 мл 0,12 М фосфатного буфера.
      4. Готовят раствор 2, добавляя 15 г сахарозы к 100 мл 0,12 М фосфатного буфера.
      5. Готовят раствор 3, добавляя 15 г сахарозы и 7,5 г желатина к 100 мл 0,12 М фосфатного буфера. Нагрейте при 37 ° C, пока желатин не растворится.
      6. Приготовьте исходный раствор метилового зеленого (2% порошка метилового зеленого, растворенного в dH2O)19.
    2. Иммунодетекция
      1. Фиксируют образцы с помощью фиксирующего раствора в течение не менее 4 ч при 4 °C.
      2. Промойте образцы 2 раза в течение 10 минут с помощью 1x PBS.
      3. Хранить О / N или более 1 дня в растворе 1 при 4 ° C.
      4. Промыть и хранить М/Н или более 1 дня в растворе 2 при 4 °C. Дайте образцам нагреться до RT.
      5. Инкубировать в течение 3 ч в растворе 3 при 37 °C. Храните дополнительный раствор 3 при температуре 37 °C, чтобы использовать его позже.
      6. Формовка небольших (2 см х 1 см х 1 см) контейнеров в алюминиевой фольге. Поместите тонкий слой раствора 3 в формованную емкость и дайте ему застыть. Поместите образцы на застывший раствор 3 и залейте теплым раствором 3. Сориентируйте образцы и дайте им застыть. Отметьте место на застывшем растворе 3 цветной ручкой.
      7. Заморозьте, поместив контейнеры на поверхность сухого изопентана, охлажденного льдом или жидким азотом.
      8. Используя компаунд с оптимальной температурой резки (O.C.T.), прикрепите замороженные желатиновые кубики, содержащие образцы, к криостатному креплению.
      9. Нарежьте замороженные желатиновые кубики и перенесите срезы ткани на предметные стекла. Дайте им высохнуть в течение 60 минут.
      10. Используйте гидрофобный маркер, чтобы обвести линию вокруг участков.
      11. Промыть предметные стекла 3 x 10 мин в 1x PBS.
      12. Покройте срезы 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA), 1% козьей сывороткой и 0,05% Triton X-100, разведенными в 1x PBS (блокирующий раствор) в течение 30 мин (этап блокировки).
      13. Развести первичные антитела в блокирующем растворе и накрыть срезы. Инкубировать O/N при 4 °C в закрытой коробке с влажной бумагой, чтобы предотвратить высыхание срезов.
      14. Промойте предметные стекла 3 раза по 10 минут с помощью 1x PBS.
      15. Разбавьте вторичные антитела в блокирующем растворе и накройте срезы. Инкубировать в течение 1,5 ч при РТ в темноте.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте воздействия света, чтобы предотвратить деградацию флуорофора.
      16. Промойте предметные стекла 3 раза по 10 минут с помощью 4x PBS.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокую концентрацию PBS можно использовать при наличии сильного фона.
      17. Погрузите предметные стекла в раствор DAPI (5 мкг/мл 1,4-диазабицикло-2,2,2--октана в 0,1% Triton X-100/1x PBS) на 30 с каждый.
      18. Смойте в 1x PBS.
      19. Установите срезы в антивыцветающей среде (50 мг/мл н-пропилгаллата в 1x PBS:глицерин [1:9]) и запечатайте покровным стеклом. Хранить при температуре 4 °C до наблюдения и получения изображения во флуоресцентном микроскопе20.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для иммуногистохимических экспериментов in toto использовался тот же протокол (см. этапы 4.2.2.12-4.2.2.18), за исключением того, что образцы были предварительно зафиксированы в 4% PFA, разбавленном в 1x PBS в течение 3 ч при RT. Окрашивание ДНК проводили путем добавления метилового зеленого к раствору вторичного антитела. Все используемые антитела и красители, а также их соответствующие разведения перечислены в таблице 1. Затем образцы устанавливали в среде, препятствующей выцветанию, между двумя покровными стеклами, разделенными стальными кольцами, склеенными пчелиным воском, и с помощью конфокального микроскопа21 получали стеки изображений размером 100 мкм.
  3. Вестерн-блоттинг-анализ
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все используемые антитела и соответствующие разведения перечислены в Таблица 1.
    1. Приготовление растворов
      1. Приготовьте 2-кратный загрузочный буфер SDS-PAGE, добавив 20 мл глицерина, 4 г SDS и 0,2 мл бромфенольного синего к 80 мл 100 мМ основного раствора Tris. Отрегулируйте рН до 6,8. Добавьте свежий дитиотрейтол (DTT) перед использованием.
      2. Приготовьте буферный солевой буфер для промывки Tris раствором Tween 20 (TBST), добавив 2,4 г основания Tris, 8,8 г NaCl и 1 мл Tween-20 до dH2O до конечного объема 1 л. Отрегулируйте pH до 7,4-7,6 с помощью HCl.
      3. Приготовьте 10-кратный проточный буфер (RB), добавив 30,2 г основания Tris, 144,2 г глицина и 10 г SDS к 1 л dH2O. Перед использованием добавьте 100 мл 10x RB к 900 мл dH2O для приготовления 1x RB (рабочего раствора).
        ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как 10x RB можно хранить в RT в течение нескольких месяцев, 1x RB можно повторно использовать в разных прогонах.
      4. Приготовьте буфер переноса (TB), добавив 5,82 г основания Tris, 2,93 г глицина и 0,5 г SDS к 800 мл dH2O. После того, как компоненты растворятся, добавьте 200 мл метанола. Охладить при температуре 4 °C.
        ПРИМЕЧАНИЕ: TB следует готовить свежим перед каждым использованием.
    2. Экстракция белка
      1. Соберите эпаксиальные мышцы у мышей E18.5 и немедленно поместите их в микроцентрифужную пробирку (2 мл), содержащую 2x загрузочный буфер SDS-PAGE со свежедобавленным DTT (100 мМ DTT). Обработайте E18.5 dECM таким же образом.
      2. Добавьте один шарик карбида вольфрама на трубку. Гомогенизируйте 2 раза в бисерной мельнице в течение 2,5 минут каждый раз (переворачивайте крепления).
      3. Обработайте образцы ультразвуком в течение 5 минут в ультразвуковой ванне.
      4. Нагрейте образцы в течение 10 мин при 50 °C.
      5. Центрифугируют образцы при 12 000 × г в течение 15 мин при 4 °C.
      6. Переведите надосадочную жидкость в свежую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
      7. Количественное определение белка с помощью микрообъемного спектрофотометра.
      8. Хранить при температуре -20 °C до дальнейшего использования.
    3. Электрофорез в полиакриламидном геле
      1. Используйте сборный акриламидный градиентный гель (4% -20%)
      2. Установите гель в резервуар для электрофореза. Аккуратно снимите расческу. Добавьте 1x RB до линии, отображаемой в резервуаре для электрофореза. Убедитесь, что скважины заполнены RB.
      3. Загрузите в лунки 100 мкг белка на образец. Загрузите 12 мкл стандарта высокомолекулярного белка.
      4. Работает в общей сложности 100 минут при постоянном напряжении (10 минут при 150 В и 90 минут при 185 В).
    4. Перенос
      1. Смочите фильтрующие прокладки и губки охлажденным TB (4 °C) во время работы геля.
      2. Разрежьте мембраны из поливинилидендифторида по размеру геля. Активируйте их метанолом и промойте dH2O. Замочите в ТБ.
      3. Установите передаточную кассету с губками, фильтрующими прокладками, гелями и активированными мембранами в соответствии с инструкциями производителя.
      4. Поместите кассету в резервуар для электрофореза, содержащий охлажденный ТБ (на ложе со льдом). Добавьте блок охлаждения. Работать в течение 90 минут при 100 В.
      5. После переноса окрашивайте синим заменителем Coomassie, чтобы оценить качество передачи.
    5. Иммунодетекция
      1. Приготовьте блокирующий раствор (ТБСТ с 5% нежирным молоком). Инкубируют мембраны при перемешивании в течение 1 ч при РТ.
      2. Смойте 3 x 5 с TBST.
      3. Инкубируют мембраны O/N с первичными антителами, разбавленными в TBST с 2% BSA и 0,02% азида натрия (3 мл на мембрану) в холодильной камере (4 °C) с перемешиванием.
      4. На следующий день умывайтесь 3 х 5 мин с TBST.
      5. Инкубируйте мембраны с конъюгированными вторичными антителами пероксидазы хрена (HRP), разведенными в TBST с 5% обезжиренным молоком (5 мл на каждую мембрану) в течение 1 ч при RT.
      6. Промойте мембраны с помощью TBST 3 x 5 мин. Хранить в TBST до момента обнаружения.
      7. Визуализируйте белок с помощью коммерчески доступного набора для проявки. Добавьте реагенты для обнаружения в соответствии с инструкциями производителя. Приобретите изображения групп.
      8. Чтобы протестировать более одного антитела на мембрану, после этапа обнаружения удалите прежние антитела тремя промывками (по 5 минут каждая) с использованием TBST и повторите шаги 4.3.5.2-4.3.5.7.

Таблица 1: Антитела и красители, используемые в иммуногистохимии и вестерн-блоттинге, и соответствующие разведения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.10,22

5. Культура клеток в децеллюлярных матрицах

ПРИМЕЧАНИЕ: Все методики выполнялись в стерильных условиях в ламинарном вытяжном шкафу. Все инкубации проводили при 37 °C и с содержаниемСО2 5%.

  1. Приготовьте среду для культивирования клеток, модифицированную среду Dulbecco Modified Eagle Medium с высоким содержанием глюкозы со стабильным глютамином и пируватом натрия (DMEM), дополненную 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% ручкой / стрептококком (полная питательная среда).
  2. Поместите dECM в чашку Петри в 1x PBS с 1% ручкой/стрептококком в вытяжном шкафу с ламинарным потоком и разделите их на кусочки размером примерно 500 мкм x 500 мкм x 250 мкм с помощью микроскальпеля и пинцета.
    ПРИМЕЧАНИЕ: dECM имеют мягкую текстуру, и поэтому часто проще использовать пинцет, чтобы разделить их на кусочки примерно одинакового размера, чем резать их микроскальпелем.
  3. Перенесите фрагменты в 96-луночную тарелку (по три-четыре штуки на лунку) с 200 мкл полной питательной среды, предварительно нагретой до 37 °C. Инкубировать в течение 2 ч в инкубаторе.
  4. Добавьте 500 мкл трипсина в колбу T25, засеянную субсливающимися (~ 70%) клетками C2C12. Ресуспендировать в 1 мл полной среды.
  5. Добавьте 10 мкл ресуспензии к 10 мкл красителя трипанового синего и загрузите в гемоцитометр. Подсчитайте и рассчитайте количество клеток и подтвердите жизнеспособность клеток.
  6. Аспирируют среду из 96-луночного планшета, содержащего dECM, и добавляют 200 мкл полной питательной среды, содержащей 50 000 жизнеспособных клеток C2C12.
  7. Инкубируют в течение 2 дней, а затем с помощью пинцета переносят dECM (с клетками) в 48-луночную пластину с 400 мкл полной питательной среды. Каждые 2 дня тщательно аспирируйте среду микропипеткой, чтобы предотвратить отрыв dECM от дна лунки, и добавляйте свежую среду до 8-го дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Матрицы выдерживают в течение 2 дней в 96-луночных планшетах, чтобы способствовать адгезии клеток C2C12 к dECM, а затем переносят на 48-луночную пластину, чтобы обеспечить доступ к большему объему среды с питательными веществами. dECM должны прилипать к дну скважин.
  8. Для эксперимента по дифференцировке замените полную питательную среду дифференцирующей средой (DMEM с добавлением 2% лошадиной сыворотки и 1% пера/стрептококка) на 8-й день с последующей инкубацией в дифференцировочной среде в течение 4 дней до 12-го дня.

Результаты

Целью протокола децеллюляризации является получение dECM, которые очень похожи на состав нативной ткани. Для определения эффективности процесса децеллюляризации использовались различные методы, включая изучение морфологии тканей, измерение уровня ДНК, окрашивание на F-актин и анализ к...

Обсуждение

ECM представляет собой сложную сеть макромолекул, которая присутствует во всех тканях и играет решающую роль в регуляции поведения и функции клеток2. ECM действует как физический каркас для прикрепления клеток и обеспечивает сигналы, которые активно модулируют клеточные про...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.

Благодарности

Эта работа финансировалась Французской ассоциацией борьбы с миопатиями (AFM-Téléthon; контракт No 23049), проектом MATRIHEALTH и финансированием подразделения cE3c UIDB/00329/2020. Мы хотели бы поблагодарить нашего донора Энрике Мейреллеса, который решил поддержать проект MATRIHEALTH. В этой работе использовалась инфраструктура Центра микроскопии факультета естественных наук, узла Португальской платформы биовизуализации (ссылка PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), и мы благодарим Луиса Маркеса за его помощь в получении и обработке изображений. Наконец, мы благодарим Марту Пальму за техническую поддержку и нашу исследовательскую группу за их щедрый вклад.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, SterileAbdos LabwareP21021
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochlorideMerckD8417
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast GelBio-Rad4561093
48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, SterileAbdos LabwareP21023
96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, SterileAbdos LabwareP21024
Bovine Serum Albumin, Fraction VNZYtechMB04601
BX60 fluorescence microscopeOlympus
Cryostat CM1860 UVLeica
DithiothreitolThermoFisherR0862
DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvateBiowestL0103-500
DNase IPanReac AppliChemA3778
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen69506
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Merck108418
Fetal bovine serumBiowestS1560-500
Fine tip transfer pipetteThermoFisher15387823
Goat serumBiowestS2000-100
Hera Guard Flow CabinetHeraeus
Heracell 150 CO2 IncubatorThermo Scientific
HiMark Pre-stained Protein StandardInvitrogen
Horse Serum, New Zealand originGibco16050122
HRP-α- Rabbit IgGabcamab205718
HRP-α- Rat IgGabcamab205720
HRP-α-Mouse IgGabcamab205719
ImageJ v. 1.53t
Methyl GreenSigma-Aldrich67060
MM400 Tissue LyserRetsch
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer ThermoFisher
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol freeAlfa Aesar043368-9M
Penicillin-Streptomycin (100x) GRiSPGTC05.0100
Phalloidin Alexa 488 Thermo Fisher Sci.A12379
Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile)Greiner Bio-One628161
Qubit dsDNA HS kitThermo ScientificQ32851
Qubit™ 3 FluorometerInvitrogen15387293
S6E Zoom Stereo microscopeLeica
Sodium Dodecyl SulfateMerck11667289001
SuperFrost® Plus adhesion slidesThermo Scientific631-9483
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent SubstrateThermo Scientific15626144
TCS SPE confocal microscopeLeica
Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99%VWR Chemicals28811.295
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco15250061
Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X)GRiSPGTC02.0100
TWEEN 20 (50% Solution)ThermoFisher3005
WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm)AdvanstaL-08024-001
α-Collagen Iabcamab21286
α-Collagen IVMilliporeAB756P
α-Collagen IVSanta Cruz Biotechnologysc-398655
α-FibronectinSigmaF-3648
α-Laminin α2 SigmaL-0663
α-MHCD.S.H.B.MF20
α-Mouse Alexa 488Molecular ProbesA11017
α-Mouse Alexa 568Molecular ProbesA11019
α-pan-LamininSigmaL- 9393
α-phospho-histone 3Merk Millipore06-570
α-Rabbit Alexa 568Molecular ProbesA21069
α-Rabbit Alexa 488Molecular ProbesA11070
α-Rat Alexa 488Molecular ProbesA11006

Ссылки

  1. Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
  2. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  3. Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Genetic disorders of the extracellular matrix. Anatomical Record. 303 (6), 1527-1542 (2020).
  4. Ahmad, K., Shaikh, S., Ahmad, S. S., Lee, E. J., Choi, I. Cross-talk between extracellular matrix and skeletal muscle: implications for myopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 142 (2020).
  5. Tome, F. M., et al. Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences. Serie III, Sciences de la Vie. 317 (4), 351-357 (1994).
  6. Gawlik, K. I., Durbeej, M. Skeletal muscle laminin and MDC1A: pathogenesis and treatment strategies. Skeletal Muscle. 1 (1), 9 (2011).
  7. van Ry, P. M., et al. ECM-related myopathies and muscular dystrophies: pros and cons of protein therapies. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1519-1536 (2017).
  8. Gawlik, K. I., Durbeej, M. A family of laminin α2 chain-deficient mouse mutants: advancing the research on LAMA2-CMD. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 59 (2020).
  9. Kuang, W., et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models. Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 844-852 (1998).
  10. Nunes, A. M., et al. Impaired fetal muscle development and JAK-STAT activation mark disease onset and progression in a mouse model for merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 26 (11), 2018-2033 (2017).
  11. McCrary, M. W., Bousalis, D., Mobini, S., Song, Y. H., Schmidt, C. E. Decellularized tissues as platforms for in vitro modeling of healthy and diseased tissues. Acta Biomaterialia. 111, 1-19 (2020).
  12. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  13. Philips, C., Terrie, L., Thorrez, L. Decellularized skeletal muscle: A versatile biomaterial in tissue engineering and regenerative medicine. Biomaterials. 283, 121436 (2022).
  14. Silva, A. C., et al. Comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3D-like platforms for in vitro studies. Journal of Visualized Experiments. (145), e56924 (2019).
  15. Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
  16. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
  17. Burattini, S., et al. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry. 48 (3), 223-233 (2004).
  18. Murphy, D. Caesarean section and fostering. Methods in Molecular Biology. 18, 177-178 (1993).
  19. Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-specific stain methyl green in the fluorescent labeling of embryos. Journal of Visualized Experiments. (99), e52769 (2015).
  20. Lichtman, J. W., Conchello, J. -. A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
  21. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  22. Paulsson, M. A.T.S. Biosynthesis, tissue distribution and isolation of laminins. The Laminins. , 1-26 (1994).
  23. Fedecostante, M., et al. Recellularized native kidney scaffolds as a novel tool in nephrotoxicity screening. Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals. 46 (9), 1338-1350 (2018).
  24. Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
  25. Brouki Milan, P., et al. Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery. Methods. 171, 62-67 (2020).
  26. Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Collagen VI disorders: Insights on form and function in the extracellular matrix and beyond. Matrix Biology. 71, 348-367 (2018).
  27. Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
  28. White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
  29. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences. Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).
  30. Ma, X., et al. Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells. Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101 (2017).
  31. Wu Young, M. Y., et al. Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss. Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE193

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены