Preparo de Matrizes 3D Descelularizadas de Músculo Esquelético de Camundongos Fetais para Cultura Celular

Resumo

Neste trabalho, um protocolo de decelularização foi otimizado para obter matrizes descelularizadas do músculo esquelético fetal de camundongos. Os mioblastos C2C12 podem colonizar essas matrizes, proliferar e diferenciar-se. Este modelo in vitro pode ser utilizado para estudar o comportamento celular no contexto de doenças musculares esqueléticas, como as distrofias musculares.

Resumo

A matriz extracelular (MEC) desempenha um papel crucial no fornecimento de suporte estrutural para as células e na transmissão de sinais que são importantes para vários processos celulares. Modelos bidimensionais (2D) de cultura de células simplificam demais as complexas interações entre células e a MEC, pois a falta de um suporte tridimensional completo (3D) pode alterar o comportamento celular, tornando-as inadequadas para a compreensão de processos in vivo . Deficiências na composição da MEC e nas interações célula-MEC são importantes contribuintes para uma variedade de diferentes doenças.

Um exemplo é a distrofia muscular congênita LAMA2 (LAMA2-CMD), onde a ausência ou redução funcional das lamininas 211 e 221 pode levar a hipotonia grave, detectável no nascimento ou logo após o nascimento. Trabalhos anteriores usando um modelo murino da doença sugerem que seu início ocorre durante a miogênese fetal. O presente estudo teve como objetivo desenvolver um modelo 3D in vitro que permita o estudo das interações entre as células musculares e a MEC muscular fetal, mimetizando o microambiente nativo. Este protocolo utiliza músculos profundos das costas dissecados de fetos de camundongos E18.5, tratados com tampão hipotônico, detergente aniônico e DNase. As matrizes decelularizadas resultantes (dECMs) retiveram todas as proteínas da MEC testadas (laminina α2, lamininas totais, fibronectina, colágeno I e colágeno IV) em comparação com o tecido nativo.

Quando os mioblastos C2C12 foram semeados sobre essas dECMs, eles penetraram e colonizaram as dECMs, o que apoiou sua proliferação e diferenciação. Além disso, as células C2C12 produziram proteínas da MEC, contribuindo para o remodelamento de seu nicho dentro das dECMs. O estabelecimento desta plataforma in vitro fornece uma nova abordagem promissora para desvendar os processos envolvidos no aparecimento da LAMA2-CMD, e tem o potencial de ser adaptada a outras doenças musculares esqueléticas onde deficiências na comunicação entre a MEC e as células musculares esqueléticas contribuem para a progressão da doença.

Introdução

A matriz extracelular (MEC) é um dos principais constituintes dos tecidos, representando seu componente não celular. Essa estrutura tridimensional (3D) não apenas fornece suporte físico para as células, mas também desempenha um papel crucial nos processos bioquímicos envolvidos no desenvolvimento dos organismos¹. A formação de uma MEC tecido-específica ocorre durante o desenvolvimento, como resultado das complexas interações entre as células e seus nichos, influenciadas por diversos estímulos intra e extracelulares. A MEC é uma estrutura altamente dinâmica que sofre rearranjos químicos e mecânicos de forma espaço-temporal e impacta diretamente ....

Protocolo

Todas as metodologias descritas foram aprovadas pela Comissão de Bem-Estar Animal (ORBEA) da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa e pela Direção-Geral de Veterinária (DGAV; ref. 0421/000/000/2022), e estão em conformidade com a Diretiva Europeia 2010/63/UE.

1. Preparação de tampões e reagentes de decelularização

NOTA: Todas as soluções utilizadas durante o protocolo de descelularização devem ser esterilizadas por autoclavagem e armazenadas por até 3 meses, salvo indicação em contrário.

1. Preparar solução salina tamponada com fosfato 10x (10x PBS) adicionando cloreto de sódio (N....

Resultados

O objetivo do protocolo de decelularização é produzir dECMs que se assemelhe à composição do tecido nativo. Para determinar a eficácia do processo de decelularização, vários métodos foram empregados, incluindo exame da morfologia tecidual, medição dos níveis de DNA, coloração para F-actina e análise dos principais componentes da MEC usando técnicas de imunohistoquímica e western blotting. Especificamente, cinco componentes principais da MEC do tecido muscular esquelético foram analisados.

Discussão

A MEC é uma rede complexa de macromoléculas que está presente em todos os tecidos e desempenha um papel crucial na regulação do comportamento e função celular². A MEC atua como um arcabouço físico para as células se ligarem e fornece pistas que modulam ativamente os processos celulares, como proliferação, motilidade, diferenciação e apoptose. Assim, a formação e manutenção adequadas da MEC são essenciais tanto para o desenvolvimento quanto para a homeostase¹

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile	Abdos Labware	P21021
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Merck	D8417
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Bio-Rad	4561093
48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile	Abdos Labware	P21023
96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile	Abdos Labware	P21024
Bovine Serum Albumin, Fraction V	NZYtech	MB04601
BX60 fluorescence microscope	Olympus
Cryostat CM1860 UV	Leica
Dithiothreitol	ThermoFisher	R0862
DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate	Biowest	L0103-500
DNase I	PanReac AppliChem	A3778
DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69506
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Merck	108418
Fetal bovine serum	Biowest	S1560-500
Fine tip transfer pipette	ThermoFisher	15387823
Goat serum	Biowest	S2000-100
Hera Guard Flow Cabinet	Heraeus
Heracell 150 CO2 Incubator	Thermo Scientific
HiMark Pre-stained Protein Standard	Invitrogen
Horse Serum, New Zealand origin	Gibco	16050122
HRP-α- Rabbit IgG	abcam	ab205718
HRP-α- Rat IgG	abcam	ab205720
HRP-α-Mouse IgG	abcam	ab205719
ImageJ v. 1.53t
Methyl Green	Sigma-Aldrich	67060
MM400 Tissue Lyser	Retsch
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer	ThermoFisher
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free	Alfa Aesar	043368-9M
Penicillin-Streptomycin (100x)	GRiSP	GTC05.0100
Phalloidin Alexa 488	Thermo Fisher Sci.	A12379
Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile)	Greiner Bio-One	628161
Qubit dsDNA HS kit	Thermo Scientific	Q32851
Qubit™ 3 Fluorometer	Invitrogen	15387293
S6E Zoom Stereo microscope	Leica
Sodium Dodecyl Sulfate	Merck	11667289001
SuperFrost® Plus adhesion slides	Thermo Scientific	631-9483
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	15626144
TCS SPE confocal microscope	Leica
Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99%	VWR Chemicals	28811.295
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061
Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X)	GRiSP	GTC02.0100
TWEEN 20 (50% Solution)	ThermoFisher	3005
WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm)	Advansta	L-08024-001
α-Collagen I	abcam	ab21286
α-Collagen IV	Millipore	AB756P
α-Collagen IV	Santa Cruz Biotechnology	sc-398655
α-Fibronectin	Sigma	F-3648
α-Laminin α2	Sigma	L-0663
α-MHC	D.S.H.B.	MF20
α-Mouse Alexa 488	Molecular Probes	A11017
α-Mouse Alexa 568	Molecular Probes	A11019
α-pan-Laminin	Sigma	L- 9393
α-phospho-histone 3	Merk Millipore	06-570
α-Rabbit Alexa 568	Molecular Probes	A21069
α-Rabbit Alexa 488	Molecular Probes	A11070
α-Rat Alexa 488	Molecular Probes	A11006