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Résumé

Dans ce travail, un protocole de décellularisation a été optimisé pour obtenir des matrices décellularisées du muscle squelettique de souris fœtale. Les myoblastes C2C12 peuvent coloniser ces matrices, proliférer et se différencier. Ce modèle in vitro peut être utilisé pour étudier le comportement cellulaire dans le contexte de maladies musculaires squelettiques telles que les dystrophies musculaires.

Résumé

La matrice extracellulaire (ECM) joue un rôle crucial en fournissant un soutien structurel aux cellules et en transmettant des signaux importants pour divers processus cellulaires. Les modèles de culture cellulaire bidimensionnels (2D) simplifient à l’excès les interactions complexes entre les cellules et l’ECM, car l’absence d’un support tridimensionnel complet (3D) peut modifier le comportement cellulaire, les rendant inadéquats pour comprendre les processus in vivo . Les déficiences dans la composition de l’ECM et les interactions cellule-ECM sont des contributeurs importants à une variété de maladies différentes.

Un exemple est la dystrophie musculaire congénitale LAMA2 (LAMA2-CMD), où l’absence ou la réduction de la laminine fonctionnelle 211 et 221 peut entraîner une hypotonie sévère, détectable à la naissance ou peu après. Des travaux antérieurs utilisant un modèle murin de la maladie suggèrent que son apparition se produit pendant la myogenèse fœtale. La présente étude visait à développer un modèle 3D in vitro permettant l’étude des interactions entre les cellules musculaires et l’ECM du muscle fœtal, imitant le microenvironnement natif. Ce protocole utilise des muscles profonds du dos disséqués à partir de fœtus de souris E18.5, traités avec un tampon hypotonique, un détergent anionique et de la DNase. Les matrices décellularisées résultantes (dECM) ont conservé toutes les protéines ECM testées (laminine α2, laminines totales, fibronectine, collagène I et collagène IV) par rapport au tissu natif.

Lorsque les myoblastes C2C12 ont été ensemencés au-dessus de ces dECM, ils ont pénétré et colonisé les dECM, ce qui a favorisé leur prolifération et leur différenciation. De plus, les cellules C2C12 ont produit des protéines ECM, contribuant au remodelage de leur niche au sein des dECM. La mise en place de cette plateforme in vitro fournit une nouvelle approche prometteuse pour démêler les processus impliqués dans l’apparition de LAMA2-CMD, et a le potentiel d’être adaptée à d’autres maladies musculaires squelettiques où des déficiences dans la communication entre l’ECM et les cellules musculaires squelettiques contribuent à la progression de la maladie.

Introduction

La matrice extracellulaire (MEC) est un constituant majeur des tissus, représentant leur composante non cellulaire. Cette structure tridimensionnelle (3D) fournit non seulement un soutien physique aux cellules, mais joue également un rôle crucial dans les processus biochimiques impliqués dans le développement des organismes1. La formation d’une ECM spécifique au tissu se produit au cours du développement, en raison des interactions complexes entre les cellules et leurs niches, influencées par divers stimuli intra et extracellulaires. L’ECM est une structure très dynamique qui subit des réarrangements chimiques et mécaniques de manière temporelle et spatiale et a un impact direct sur le destin cellulaire2. L’une des caractéristiques les plus remarquables de l’ECM est sa diversité fonctionnelle, car chaque ECM tissulaire présente une combinaison unique de molécules qui fournissent différentes topologies et propriétés adaptées aux cellules qu’il contient1.

La signalisation et le soutien de l’ECM sont cruciaux pour le développement et l’homéostasie et, lorsqu’ils sont perturbés, ils peuvent entraîner de multiples pathologies 3,4. Un exemple est la dystrophie congénitale déficiente en LAMA2 (LAMA2-CMD), qui est la forme la plus courante de dystrophie musculaire congénitale. Le gène LAMA2 code pour la chaîne de laminine α2, qui est présente dans la laminine 211 et la laminine 221, et lorsqu’elle est mutée, peut conduire à LAMA2-CMD 5. La laminine 211 est la principale isoforme trouvée dans la membrane basale entourant les fibres musculaires squelettiques. Lorsque la laminine 211 est anormale ou absente, le lien entre la membrane basale et les cellules musculaires est perturbé, entraînant l’apparition de la maladie6. Les patients atteints de LAMA2-CMD présentent un phénotype léger à sévère en fonction du type de mutation dans le gène LAMA2.

Lorsque la fonction de la protéine laminine α2 est affectée, les patients peuvent présenter une hypotonie musculaire sévère à la naissance et développer une inflammation chronique, une fibrose et une atrophie musculaire, entraînant une réduction de l’espérance de vie. À ce jour, aucun traitement ciblé n’a été développé et les approches thérapeutiques se limitent à soulager les symptômes de la maladie7. Par conséquent, la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents impliqués dans l’apparition de cette maladie est cruciale pour développer des stratégies thérapeutiques appropriées 6,8. Des travaux antérieurs utilisant la souris dyW 9, un modèle pour LAMA2-CMD, suggèrent que l’apparition de la maladie commence in utero, en particulier pendant la myogenèse fœtale10. Une meilleure compréhension de la façon dont le défaut de myogenèse fœtale émerge changerait la donne dans la génération de nouvelles approches thérapeutiques pour LAMA2-CMD.

Les systèmes in vitro fournissent un environnement contrôlé pour étudier les interactions cellule-cellule et cellule-ECM, mais les modèles de culture 2D n’ont pas la complexité des tissus natifs. La décellularisation des tissus produit des échafaudages ECM acellulaires spécifiques aux tissus et aux stades de développement qui imitent plus précisément le microenvironnement cellulaire naturel par rapport aux modèles 2D et aux échafaudages artificiels / synthétiques. Les matrices décellularisées (dECM) ont le potentiel de préserver les signaux moléculaires et mécaniques du tissu hôte, ce qui en fait de meilleurs modèles alternatifs pour comprendre les processus in vivo 11.

Il existe diverses techniques, réactifs et conditions qui peuvent être utilisés pour la décellularisation12,13. Dans cette étude, un protocole de décellularisation pour le cœur de souris fœtale, décrit par Silva et al.14,15, est adapté au muscle squelettique de souris fœtale et conserve tous les composants ECM testés (laminine α2, laminines totales, fibronectine, collagène I et collagène IV). Le protocole comprend trois étapes : la lyse cellulaire par choc osmotique (tampon hypotonique), la dissolution de la membrane plasmique et la dissociation des protéines (dodécylsulfate de sodium à 0,05 % [SDS]), et la destruction enzymatique de l’ADN (traitement par DNase). À notre connaissance, il s’agit du premier protocole établi pour décellulariser le muscle squelettique fœtal de souris.

Pour utiliser ce système 3D in vitro pour étudier LAMA2-CMD, il est crucial de maintenir la chaîne laminine α2 après décellularisation. Par conséquent, un protocole d’optimisation a été mis en œuvre où différents détergents (FDS et Triton X-100) et concentrations (0,02 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,2 % et 0,5 %) ont été testés (données non présentées). Le choix optimal pour l’élimination cellulaire et la préservation de la protéine laminine α2 s’est avéré être 0,05% SDS. Les cellules C2C12, une lignée cellulaire de myoblastes16,17 bien établie, ont été utilisées pour ensemencer les dECM. Ces cellules envahissent la dECM, prolifèrent et se différencient à l’intérieur de ces échafaudages, synthétisant de nouvelles protéines ECM. La production réussie de ce modèle in vitro 3D offre une nouvelle approche pour comprendre les processus moléculaires et cellulaires impliqués dans la myogenèse fœtale, l’apparition de LAMA2-CMD, et peut être étendue à d’autres maladies musculaires où la communication entre l’ECM et les cellules musculaires squelettiques est perturbée.

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Protocole

Toutes les méthodologies décrites ont été approuvées par le Comité du bien-être animal (ORBEA) de la Faculté des sciences de l’Université de Lisbonne et la Direção Geral de Veterinária (DGAV; réf. 0421/000/000/2022), et sont conformes à la directive européenne 2010/63/UE.

1. Préparation des tampons de décellularisation et des réactifs

REMARQUE: Toutes les solutions utilisées pendant le protocole de décellularisation doivent être stérilisées par autoclavage et stockées jusqu’à 3 mois, sauf indication contraire.

  1. Préparer 10x solution saline tamponnée au phosphate (10x PBS) en ajoutant du chlorure de sodium (NaCl) à 137 mM, du chlorure de potassium (KCl) à 2,68 mM, du phosphate de dihydrogène de potassium (KH2PO 4) à 8,1 mM et du dihydrate-phosphate disodique (Na2HPO4) à 1,47 mM à de l’eau déminéralisée (dH2O) et ajuster le pH à6,8. Ajouter 100 mL de 10x PBS à 900 mL de H2O déminéralisé pour générer 1x PBS. Autoclaver et conserver à température ambiante (RT). Ajouter la solution mère stérile de pénicilline/streptomycine (10 000 U/mL de pénicilline et 10 mg/mL de streptomycine [stylo/streptocoque]) à une concentration finale de 1 % avant utilisation.
  2. Préparer le tampon hypotonique en dissolvant 1,21 g de Tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris base) et 1 g d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans 1 L dedH2O(10 mM Tris base 0,1% EDTA). Utiliser un agitateur magnétique jusqu’à dissolution et ajuster le pH à 7,8 avec NaOH/HCl. Stériliser par autoclavage et conserver à TA. Ajouter stylo/streptocoque à une concentration finale de 1 % avant utilisation.
  3. Préparer le tampon de lavage hypotonique en dissolvant 1,21 g de Tris base dans 1 L dedH2O(10 mM de Tris base). Utiliser un agitateur magnétique jusqu’à dissolution et ajuster le pH à 7,8 avec NaOH/HCl. Autoclaver et conserver à TA. Ajouter le stylo/streptocoque à 1 % avant utilisation.
  4. Préparer le traitement détergent anionique en ajoutant 0,05 g de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 100 mL de tampon de lavage hypotonique pour produire une solution de traitement SDS à 0,05%. Filtrer à travers un filtre à membrane de 0,22 μm. Conserver chez RT jusqu’à 1 mois.
    REMARQUE: La solution FDS ne doit pas être autoclavée, car la FDS précipite et se dégrade lors de l’autoclavage.
  5. Préparer la solution de traitement DNase en dissolvant 1,21 g de Tris base dans 0,5 mL de dH2O etajouter 1 mL de chlorure de magnésium 1 M (MgCl2). Ajuster le pH à 7,8 avec NaOH/HCl. Autoclave et conserver à TA. Ajouter la DNase I avant utilisation (50 U/mL).

2. Prélèvement d’échantillons

REMARQUE: Des souris C57 / BL6 de type sauvage ont été utilisées dans l’étude. Toutes les techniques ont été réalisées dans une hotte à flux laminaire dans des conditions stériles.

  1. Euthanasier des souris femelles enceintes adultes au jour embryonnaire (E) 18,5 de la grossesse en inhalant de l’isoflurane suivie d’une luxation cervicale. Soumettre les souris à une dissection terminale pour extraire les fœtus.
    1. Vaporisez l’abdomen de la souris avec de l’éthanol à 70%.
    2. À l’aide de forceps chirurgicaux et de ciseaux, soulevez un pli de peau dans le bas-ventre et faites une incision en forme de U pour exposer la cavité abdominale18.
    3. Recueillir les cornes utérines contenant les fœtus E18.5 en coupant les oviductes et le col de l’utérus et les transférer immédiatement dans une boîte de Petri avec 1x PBS glacé avec 1% stylo / streptocoque18.
    4. Retirer rapidement les fœtus de l’utérus et des tissus extraembryonnaires et les euthanasier par décapitation à l’aide de ciseaux18.
  2. Transférer un fœtus à la fois dans une boîte de Pétri avec 1x PBS glacé. À l’aide d’un stéréomicroscope, retirez la peau et coupez les membres. Du côté ventral, coupez à travers la cage thoracique et retirez le sternum et les organes sous-jacents.
  3. Retournez le côté dorsal du tronc fœtal vers le haut. Enlevez la partie cervicale de la colonne vertébrale, les dépôts de graisse dorsale et le tissu conjonctif au-dessus des muscles profonds du dos.
  4. Utilisez des pinces chirurgicales pour ancrer la cage thoracique et grattez et détachez soigneusement les muscles profonds du dos des tissus environnants à l’aide d’un micro scalpel10. Cette procédure entraîne l’isolement de deux morceaux musculaires par fœtus (gauche et droit), tous deux principalement composés de muscles longissimus et iliocostalis , avec certains des muscles transversospinalis et releveur costarum inclus.
  5. Conservez les échantillons musculaires dans 1x PBS avec 1% stylo/streptocoque à 4 °C pour un stockage à court terme (<1 semaine), ou à -80 °C pendant de plus longues périodes.
    REMARQUE: Utilisez des échantillons fraîchement prélevés pour de meilleurs résultats. Les échantillons congelés pendant de longues périodes (>3 mois) montrent une efficacité de décellularisation plus faible et une plus grande dégradation des protéines. Les masses musculaires épaxiales ont été utilisées pour les expériences de décellularisation, mais d’autres muscles (par exemple, les muscles des membres) peuvent être traités pour la décellularisation en utilisant le même protocole.

3. Décellularisation des muscles squelettiques fœtaux

NOTE: Toutes les techniques ont été effectuées dans une hotte à flux laminaire dans des conditions stériles. Pour une représentation schématique détaillée, voir la figure 1A. Toutes les étapes ont été effectuées avec agitation dans un agitateur orbital d’un diamètre de 120 mm (165 tr/min) à 25 °C, sauf indication contraire. Ajouter 1% stylo/streptocoque aux solutions avant utilisation. Lorsque vous retirez les solutions, aspirez soigneusement pour éviter que l’échantillon ne soit piégé dans la pipette.

  1. Jour 1 - Préparer environ 2 mm x 1 mm x 1 mm (~3,5 mg) de fragments de tissu à partir des masses musculaires épaxiales. Ajouter 3 mL de tampon hypotonique avec stylo/streptocoque à 1 % dans chaque puits d’une plaque de 12 puits et ajouter un fragment de tissu musculaire entier par puits.
    1. Incuber les fragments de tissu dans un tampon hypotonique en agitant pendant 18 h (pendant la nuit) (O/N).
  2. Jour 2 - Aspirer le tampon hypotonique à l’aide d’une pipette à pointe fine et laver les échantillons 3 x 1 h avec 3 ml de 1x PBS à chaque fois avec agitation.
    1. Incuber les échantillons pendant 24 h avec 3 mL de solution détergente SDS à 0,05% avec agitation.
      NOTE: (POINT DE CONTRÔLE) Après l’incubation de la FDS, les échantillons doivent être transparents en apparence. Les échantillons présentent une consistance semblable à celle de la gélatine et sont donc plus susceptibles d’adhérer à la pipette lors de l’élimination des liquides.
  3. Jour 3 - Retirer la solution détergente SDS à l’aide d’une pipette à pointe fine et laver les fragments de tissu 3 x 20 min avec 3 mL de tampon de lavage hypotonique à chaque fois avec agitation.
    NOTE: (POINT DE PAUSE) Les échantillons peuvent être conservés dans un tampon de lavage hypotonique à 4 °C pendant 18 h (O/N). Assurez-vous que les FDS sont bien éliminées pendant les étapes de lavage, car les FDS résiduelles peuvent être cytotoxiques.
    1. Incuber les fragments de tissu pendant 3 h avec 2 mL de solution de DNase en agitant à 37 °C.
    2. Retirer la solution de DNase à l’aide d’une pipette à pointe fine et laver les fragments de tissu 3 x 20 min avec 3 mL de 1x PBS à chaque fois avec agitation. Enfin, laver O/N avec agitation (60 tr/min).
      REMARQUE: Après le traitement par DNase, les dECM deviennent collants en raison de la présence de résidus d’ADN. Par conséquent, un lavage soigneux est nécessaire.
    3. Conservez les dECM dans 1x PBS avec 1% stylo/streptocoque à 4 °C jusqu’à recellularisation (<1 semaine). Pour les autres utilisations, conserver à -80 °C.

4. Évaluation de la qualité de la décellularisation

REMARQUE : La quantification de l’ADN, la coloration DAPI/vert de méthyle et la coloration à la phalloïdine ont été effectuées pour évaluer la présence de contenu cellulaire résiduel après décellularisation. Des analyses immunohistochimiques et Western blot ont été effectuées pour évaluer la rétention des protéines ECM clés après la décellularisation.

  1. Quantification de l’ADN présent dans le dECM
    REMARQUE: Les dECM doivent être comparés au tissu natif pour détecter la présence d’ADN.
    1. Avant la décellularisation, peser un tube microcentrifuge de 1,5 mL sur une balance numérique de haute précision. Avant de transférer l’échantillon musculaire dans le tube, retirez tous les 1x PBS restants à l’aide d’une serviette en papier. Peser le tube avec l’échantillon. Calculer le poids humide des échantillons à l’aide de l’équation (1):
      Poids humide de l’échantillon = tube de poidsavec échantillons -tube vide de poids (1)
    2. Décellulariser les échantillons en suivant le protocole décrit à la rubrique 3.
    3. Placer les échantillons dans des tubes microcentrifuges de 2 mL.
      NOTE: Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C jusqu’à l’extraction et la quantification de l’ADN.
    4. Effectuez l’extraction de l’ADN des dECM et des échantillons de tissus natifs à l’aide d’un kit à base de colonne de spin. Ajouter le tampon de digestion selon les instructions du fabricant.
    5. Homogénéiser les échantillons dans un broyeur à billes deux fois pendant 2,5 minutes à chaque fois (en retournant les supports) en utilisant une perle de carbure de tungstène par tube (utilisez des supports de tube réfrigérés).
    6. Ajouter la protéinase K et incuber O/N en agitant lentement à 56 °C.
    7. Suivez le protocole décrit dans les instructions du fabricant.
    8. Éluer avec le tampon fourni par le fabricant et centrifuger 2 x 1 min à ≥6 000 x g, chaque fois à 4 °C pour augmenter le rendement en ADN.
      NOTE: L’ADN peut être stocké à -20 ° C jusqu’à la quantification.
    9. Quantifier l’ADN présent dans les échantillons à l’aide d’un kit de détection d’ADNds fluorescent en suivant les instructions du fabricant.
    10. Normaliser la teneur en ADN en nanogrammes d’ADN par milligramme de poids humide initial de l’échantillon.
    11. Analysez les données à l’aide d’un test t de Student bilatéral et exprimez comme moyenne ±erreur type de la moyenne (MEB).
  2. Immunohistochimie
    NOTE: Les solutions 1, 2 et 3 et la solution fixatrice doivent être préparées avant utilisation et peuvent être conservées congelées jusqu’à 6 mois. Tous les anticorps et colorants utilisés et les dilutions respectives sont énumérés dans Tableau 1.
    1. Préparation des solutions
      1. Préparer la solution fixatrice en ajoutant 2 g de paraformaldéhyde (PFA), 8 g de saccharose, et 24 μL de 1 M CaCl2 à 77 mL de 0,2 M Na2HPO 4 et 23 mL de 0,2 M NaH2PO4, jusqu’à un volume final de 200 mL en ajoutantdH2O. Ajuster le pH à7,4.
      2. Préparer le tampon phosphate 0,12 M en ajoutant 13,5 g deNa2HPO4 et 3,2 g de NaH2PO4 à 1 L de dH2O. Ajuster le pH à 7,4.
      3. Préparer la solution 1 en ajoutant 4 g de saccharose à 100 mL de tampon phosphate 0,12 M.
      4. Préparer la solution 2 en ajoutant 15 g de saccharose à 100 mL de tampon phosphate 0,12 M.
      5. Préparer la solution 3 en ajoutant 15 g de saccharose et 7,5 g de gélatine à 100 mL de tampon phosphate 0,12 M. Chauffer à 37 °C jusqu’à dissolution de la gélatine.
      6. Préparer la solution mère de vert de méthyle (poudre de vert de méthyle à 2 % dissoute dans ledH2O)19.
    2. Immunodétection
      1. Fixer les échantillons à l’aide de la solution fixatrice pendant au moins 4 h à 4 °C.
      2. Lavez les échantillons 2x pendant 10 min avec 1x PBS.
      3. Conserver O/N, ou plus de 1 jour, dans la solution 1 à 4 °C.
      4. Laver et conserver O/N ou plus de 1 jour dans la solution 2 à 4 °C. Laisser les échantillons chauffer à TA.
      5. Incuber pendant 3 h dans la solution 3 à 37 °C. Conserver la solution supplémentaire 3 à 37 °C à utiliser ultérieurement.
      6. Mouler de petits contenants (2 cm x 1 cm x 1 cm) en papier d’aluminium. Placez une fine couche de solution 3 dans le récipient moulé et laissez-le prendre. Placer les échantillons sur la solution solidifiée 3 et couvrir de solution chaude 3. Orientez les échantillons et laissez-les se solidifier. Marquez l’emplacement sur la solution solidifiée 3 avec un stylo de couleur.
      7. Congeler en plaçant les contenants à la surface de l’isopentane réfrigéré à la glace carbonique ou à l’azote liquide.
      8. À l’aide d’un composé à température de coupe optimale (O.C.T.), fixer les cubes de gélatine congelés contenant les échantillons sur le support du cryostat.
      9. Sectionner les cubes de gélatine congelés et transférer les sections de tissu sur les lames. Laissez-les sécher pendant 60 min.
      10. Utilisez un marqueur hydrophobe pour tracer une ligne autour des sections.
      11. Lavez les lames 3 x 10 min dans 1x PBS.
      12. Couvrir les sections avec 1% d’albumine sérique bovine (BSA), 1% de sérum de chèvre et 0,05% de Triton X-100 dilué dans 1x PBS (solution bloquante) pendant 30 min (étape de blocage).
      13. Diluer les anticorps primaires dans une solution de blocage et couvrir les sections. Incuber O/N à 4 °C dans une boîte fermée, avec du papier humide, pour éviter que les sections ne sèchent.
      14. Lavez les diapositives 3 x 10 min avec 1x PBS.
      15. Diluer les anticorps secondaires dans une solution de blocage et couvrir les sections. Incuber pendant 1,5 h à TA dans l’obscurité.
        REMARQUE: Évitez l’exposition à la lumière pour prévenir la dégradation des fluorophores.
      16. Lavez les lames 3 x 10 min avec 4x PBS.
        REMARQUE: Une concentration plus élevée de PBS peut être utilisée lorsqu’un fond fort est présent.
      17. Immerger les lames dans une solution DAPI (5 μg/mL 1,4-diazabicyclo-2,2,2-octane dans du Triton X-100/1x PBS à 0,1 %) pendant 30 s chacune.
      18. Rincer dans 1x PBS.
      19. Monter les sections dans un milieu anti-décoloration (50 mg/mL de n-propyl-gallate dans 1x PBS:glycérol [1:9]) et sceller avec un couvercle. Conserver à 4 °C jusqu’à l’observation et l’acquisition de l’image au microscope à fluorescence20.
        NOTE: Pour les expériences d’immunohistochimie in toto , le même protocole (voir les étapes 4.2.2.12-4.2.2.18) a été utilisé, sauf que les échantillons ont été préalablement fixés dans du PFA à 4% dilué dans 1x PBS pendant 3 h à TA. La coloration de l’ADN a été réalisée en ajoutant du vert de méthyle à la solution d’anticorps secondaire. Tous les anticorps et colorants utilisés, ainsi que leurs dilutions respectives, sont énumérés dans le tableau 1. Les échantillons ont ensuite été montés dans un milieu anti-décoloration entre deux lamelles de couverture séparées par des anneaux en acier, collées ensemble avec de la cire d’abeille, et des piles d’images de 100 μm ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal21.
  3. Analyse Western blot
    NOTE: Tous les anticorps utilisés et les dilutions respectives sont énumérés dans Tableau 1.
    1. Préparation des solutions
      1. Préparez le tampon de chargement 2x SDS-PAGE en ajoutant 20 ml de glycérol, 4 g de SDS et 0,2 mL de bleu de bromophénol à 80 mL de solution de base Tris 100 mM. Ajuster le pH à 6,8. Ajouter le dithiothréitol frais (DTT) avant utilisation.
      2. Préparer le tampon de lavage salin tamponné Tris avec la solution Tween 20 (TBST) en ajoutant 2,4 g de Tris base, 8,8 g de NaCl et 1 mL de Tween-20 àdH2Ojusqu’à un volume final de 1 L. Ajuster le pH à 7,4-7,6 en utilisant HCl.
      3. Préparer le tampon de fonctionnement 10x (RB) en ajoutant 30,2 g de Tris base, 144,2 g de glycine et 10 g de SDS à 1 L dedH2O. Avant utilisation, ajouter 100 mL de 10x RB à 900 mL de dH2O pour préparer 1x RB (solution de travail).
        REMARQUE: Alors que 10x RB peut être stocké chez RT pendant plusieurs mois, 1x RB peut être réutilisé sur différentes séries.
      4. Préparer le tampon de transfert (TB) en ajoutant 5,82 g de Tris base, 2,93 g de glycine et 0,5 g de SDS à 800 mL dedH2O. Une fois les composants dissous, ajouter 200 mL de méthanol. Refroidir à 4 °C.
        NOTE: La tuberculose doit être préparée fraîchement avant chaque utilisation.
    2. Extraction de protéines
      1. Recueillir les muscles épaxiaux des souris E18.5 et les placer immédiatement dans un tube microcentrifuge (2 mL) contenant 2x tampon de chargement SDS-PAGE avec du DTT fraîchement ajouté (DTT 100 mM). Traiter E18.5 dECM de la même manière.
      2. Ajouter une perle de carbure de tungstène par tube. Homogénéiser 2x dans un broyeur à perles pendant 2,5 min à chaque fois (retourner les supports).
      3. Sonifier les échantillons pendant 5 min dans un bain d’ultrasons.
      4. Chauffer les échantillons pendant 10 min à 50 °C.
      5. Centrifuger les échantillons à 12 000 × g pendant 15 min à 4 °C.
      6. Transférer le surnageant dans un tube microcentrifuge frais de 1,5 mL.
      7. Quantifier la protéine à l’aide d’un spectrophotomètre à microvolume.
      8. Conserver à -20 °C jusqu’à nouvelle utilisation.
    3. Électrophorèse sur gel de polyacrylamide
      1. Utilisez du gel de gradient d’acrylamide préfabriqué (4% -20%)
      2. Montez le gel dans le réservoir d’électrophorèse. Retirez le peigne avec précaution. Ajouter 1x RB jusqu’à ce que la ligne s’affiche dans le réservoir d’électrophorèse. Assurez-vous que les puits sont remplis de RB.
      3. Charger 100 μg de protéines par échantillon dans les puits. Charge 12 μL de protéine étalon de haut poids moléculaire.
      4. Fonctionnement total de 100 min à tension constante (10 min à 150 V et 90 min à 185 V).
    4. Transfert
      1. Trempez les tampons filtrants et les éponges avec du TB réfrigéré (4 °C) pendant que le gel fonctionne.
      2. Coupez les membranes de difluorure de polyvinylidène à la taille du gel. Activez-les avec du méthanol et lavez avec du dH2O. Faire tremper dans la TB.
      3. Montez la cassette de transfert avec les éponges, les tampons filtrants, les gels et les membranes activées conformément aux instructions du fabricant.
      4. Placez la cassette dans le réservoir d’électrophorèse contenant la TB réfrigérée (sur un lit de glace). Ajoutez l’unité de refroidissement. Fonctionnement pendant 90 min à 100 V.
      5. Après le transfert, colorer avec un substitut bleu de Coomassie pour évaluer la qualité du transfert.
    5. Immunodétection
      1. Préparez la solution bloquante (TBST avec 5% de lait faible en gras). Incuber les membranes en agitant pendant 1 h à TA.
      2. Rincer 3 x 5 s avec TBST.
      3. Incuber les membranes O/N avec les anticorps primaires dilués dans du TBST avec 2% de BSA et 0,02% d’azoture de sodium (3 mL par membrane) dans une chambre froide (4 °C) avec agitation.
      4. Le lendemain, laver 3 x 5 min avec TBST.
      5. Incuber les membranes avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) dilués dans du TBST avec du lait faible en gras à 5 % (5 mL pour chaque membrane) pendant 1 h à TA.
      6. Laver les membranes avec TBST 3 x 5 min. Conserver TBST jusqu’à l’étape de détection.
      7. Visualisez la protéine à l’aide d’un kit de développement disponible dans le commerce. Ajouter des réactifs de détection selon les instructions du fabricant. Acquérir des images des groupes.
      8. Pour tester plus d’un anticorps par membrane, après l’étape de détection, supprimer les anciens anticorps avec trois lavages (5 min chacun) en utilisant TBST et répéter les étapes 4.3.5.2-4.3.5.7.

Tableau 1 : Anticorps et colorants utilisés en immunohistochimie et en analyse par transfert Western et dilutions respectives. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.10,22

5. Culture cellulaire dans des matrices décellularisées

NOTE: Toutes les techniques ont été effectuées dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire. Toutes les incubations ont été réalisées à 37 °C et avec 5 % de CO2.

  1. Préparer le milieu de culture cellulaire, le milieu Eagle modifié de Dulbecco à haute teneur en glucose avec de la glutamine stable et du pyruvate de sodium (DMEM), complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de stylo/streptocoque (milieu de culture complet).
  2. Placez les dECM dans une boîte de Petri dans 1x PBS avec 1% stylo/streptocoque dans une hotte à flux laminaire et séparez-les en morceaux d’environ 500 μm x 500 μm x 250 μm, à l’aide d’un microscalpel et d’une pince à épiler.
    REMARQUE: Les dECM ont une texture douce, et il est donc souvent plus facile d’utiliser une pince à épiler pour les séparer en morceaux de taille approximative égale au lieu de les couper avec le micro scalpel.
  3. Transférer les fragments dans une plaque de 96 puits (trois ou quatre morceaux par puits) avec 200 μL de milieu de culture complet, préalablement chauffé à 37 °C. Incuber pendant 2 h dans l’incubateur.
  4. Ajouter 500 μL de trypsine dans une fiole T25 ensemencée de cellules C2C12 sous-confluentes (~70%). Resuspendre dans 1 mL de milieu complet.
  5. Ajouter 10 μL de la remise en suspension à 10 μL de colorant bleu de trypan et charger dans un hémocytomètre. Comptez et calculez le numéro de cellule et confirmez la viabilité de la cellule.
  6. Aspirer le milieu de la plaque de 96 puits contenant les dECM et ajouter 200 μL de milieu de culture complet contenant 50 000 cellules C2C12 viables.
  7. Incuber pendant 2 jours puis, à l’aide d’une pince à épiler, transférer les dECM (avec les cellules) sur une plaque de 48 puits avec 400 μL de milieu de culture complet. Tous les 2 jours, aspirer soigneusement le milieu avec une micropipette pour éviter que les dECM ne se détachent du fond du puits et ajouter du milieu frais jusqu’au jour 8.
    NOTE: Les matrices sont conservées pendant 2 jours dans des plaques de 96 puits pour favoriser l’adhésion des cellules C2C12 aux dECM, puis transférées dans une plaque de 48 puits pour permettre l’accès à un plus grand volume de milieu contenant des nutriments. Les dECM doivent adhérer au fond des puits.
  8. Pour l’expérience de différenciation, remplacer le milieu de culture complet par un milieu de différenciation (DMEM complété par 2% de sérum de cheval et 1% de stylo/streptocoque) le jour 8, suivi d’une incubation dans un milieu de différenciation pendant 4 jours jusqu’au jour 12.

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Résultats

Le but du protocole de décellularisation est de produire des dECM qui ressemblent étroitement à la composition des tissus natifs. Pour déterminer l’efficacité du processus de décellularisation, diverses méthodes ont été utilisées, y compris l’examen de la morphologie des tissus, la mesure des niveaux d’ADN, la coloration de la F-actine et l’analyse des composants clés de l’ECM à l’aide de techniques d’immunohistochimie et de transfert Western. Plus précisément, cinq composants majeurs de l’E...

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Discussion

L’ECM est un réseau complexe de macromolécules présent dans tous les tissus et jouant un rôle crucial dans la régulation du comportement et de la fonctioncellulaire 2. L’ECM agit comme un échafaudage physique auquel les cellules peuvent se fixer et fournit des indices qui modulent activement les processus cellulaires tels que la prolifération, la motilité, la différenciation et l’apoptose. Ainsi, la formation et le maintien appropriés de l’ECM sont essentiels à la fois pour le d...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ces travaux ont été financés par l’Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon ; contrat n° 23049), le projet MATRIHEALTH, et l’unité cE3c de financement UIDB/00329/2020. Nous tenons à remercier notre donateur Henrique Meirelles qui a choisi de soutenir le projet MATRIHEALTH. Ce travail a bénéficié des infrastructures de l’installation de microscopie de la Faculté des sciences, un nœud de la plate-forme portugaise de bioimagerie (référence PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), et nous remercions Luís Marques pour son aide dans l’acquisition et le traitement des images. Enfin, nous remercions Marta Palma pour son soutien technique et notre équipe de recherche pour leurs généreuses contributions.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, SterileAbdos LabwareP21021
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochlorideMerckD8417
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast GelBio-Rad4561093
48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, SterileAbdos LabwareP21023
96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, SterileAbdos LabwareP21024
Bovine Serum Albumin, Fraction VNZYtechMB04601
BX60 fluorescence microscopeOlympus
Cryostat CM1860 UVLeica
DithiothreitolThermoFisherR0862
DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvateBiowestL0103-500
DNase IPanReac AppliChemA3778
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen69506
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Merck108418
Fetal bovine serumBiowestS1560-500
Fine tip transfer pipetteThermoFisher15387823
Goat serumBiowestS2000-100
Hera Guard Flow CabinetHeraeus
Heracell 150 CO2 IncubatorThermo Scientific
HiMark Pre-stained Protein StandardInvitrogen
Horse Serum, New Zealand originGibco16050122
HRP-α- Rabbit IgGabcamab205718
HRP-α- Rat IgGabcamab205720
HRP-α-Mouse IgGabcamab205719
ImageJ v. 1.53t
Methyl GreenSigma-Aldrich67060
MM400 Tissue LyserRetsch
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer ThermoFisher
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol freeAlfa Aesar043368-9M
Penicillin-Streptomycin (100x) GRiSPGTC05.0100
Phalloidin Alexa 488 Thermo Fisher Sci.A12379
Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile)Greiner Bio-One628161
Qubit dsDNA HS kitThermo ScientificQ32851
Qubit™ 3 FluorometerInvitrogen15387293
S6E Zoom Stereo microscopeLeica
Sodium Dodecyl SulfateMerck11667289001
SuperFrost® Plus adhesion slidesThermo Scientific631-9483
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent SubstrateThermo Scientific15626144
TCS SPE confocal microscopeLeica
Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99%VWR Chemicals28811.295
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco15250061
Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X)GRiSPGTC02.0100
TWEEN 20 (50% Solution)ThermoFisher3005
WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm)AdvanstaL-08024-001
α-Collagen Iabcamab21286
α-Collagen IVMilliporeAB756P
α-Collagen IVSanta Cruz Biotechnologysc-398655
α-FibronectinSigmaF-3648
α-Laminin α2 SigmaL-0663
α-MHCD.S.H.B.MF20
α-Mouse Alexa 488Molecular ProbesA11017
α-Mouse Alexa 568Molecular ProbesA11019
α-pan-LamininSigmaL- 9393
α-phospho-histone 3Merk Millipore06-570
α-Rabbit Alexa 568Molecular ProbesA21069
α-Rabbit Alexa 488Molecular ProbesA11070
α-Rat Alexa 488Molecular ProbesA11006

Références

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