細胞培養のためのマウス胎児骨格筋からの3D脱細胞化マトリックスの調製

要約

この研究では、脱細胞化プロトコルを最適化して、マウス胎児骨格筋の脱細胞化マトリックスを取得しました。C2C12筋芽細胞は、これらのマトリックスにコロニーを形成し、増殖し、分化することができます。この in vitro モデルは、筋ジストロフィーなどの骨格筋疾患の状況における細胞の挙動を研究するために使用できます。

要約

細胞外マトリックス(ECM)は、細胞の構造的サポートを提供し、さまざまな細胞プロセスに重要なシグナルを伝達する上で重要な役割を果たします。2次元(2D)細胞培養モデルは、完全な3次元(3D)サポートがないため、細胞の挙動が変化し、 in vivo プロセスの理解に不十分になるため、細胞とECMの間の複雑な相互作用を単純化しすぎます。ECM組成と細胞-ECM相互作用の欠損は、さまざまな異なる疾患の重要な原因です。

一例はLAMA2-先天性筋ジストロフィー(LAMA2-CMD)であり、機能的なラミニン211および221の不在または減少は、出生時または出生直後に検出可能な重度の低張症につながる可能性があります。この疾患のマウスモデルを用いた以前の研究は、その発症が胎児の筋形成中に起こることを示唆している。本研究は、筋肉細胞と胎児の筋肉ECMとの間の相互作用の研究を可能にする3D インビトロ モデルを開発することを目的としており、ネイティブの微小環境を模倣しています。このプロトコルは、E18.5マウス胎児から解剖し、低張緩衝液、陰イオン界面活性剤、およびDNaseで処理した深部背筋を使用します。得られた脱細胞化マトリックス(dECM)は、天然組織と比較して、テストされたすべてのECMタンパク質(ラミニンα2、総ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンI、およびコラーゲンIV)を保持していました。

C2C12筋芽細胞がこれらのdECMの上に播種されると、それらはdECMに浸透してコロニーを形成し、増殖と分化をサポートしました。さらに、C2C12細胞はECMタンパク質を産生し、dECM内のニッチのリモデリングに寄与した。この in vitro プラットフォームの確立は、LAMA2-CMDの発症に関与するプロセスを解明するための新しい有望なアプローチを提供し、ECMと骨格筋細胞間のコミュニケーションの欠陥が疾患の進行に寄与する他の骨格筋疾患に適応する可能性があります。

概要

細胞外マトリックス(ECM)は、組織の主要な構成要素であり、それらの非細胞成分を表す。この3次元(3D)構造は、細胞を物理的にサポートするだけでなく、生物の発生に関与する生化学的プロセスにおいても重要な役割を果たします¹。組織特異的ECMの形成は、細胞とそれらのニッチとの間の複雑な相互作用の結果として、様々な細胞内および細胞外の刺激の影響を受ける発生中に起こる。ECMは、時間空間的に化学的および機械的再配列を起こし、細胞の運命に直接影響を与える非常に動的な構造です²。ECMの最も顕著な特徴の1つは、各組織ECMが、それに含まれる細胞に合わせた異なるトポロジーおよび特性を提供する分子の固有の組み合わせを示すため、その機能の多様性である¹。

ECMシグナル伝達とサポートは、発生と恒常性に不可欠であり、破壊されると複数の病理学的状態につながる可能性があります^3,4。一例は、先天性筋ジストロフィーの最も一般的な形態であるLAMA2欠損先天性ジストロフィー(LAMA2-CMD)です。LAMA2遺伝子は、ラミニン211およびラミニン221に存在するラミニンα2鎖をコードし、変異するとLAMA2-CMD5につながる可能性があります。ラミニン211は、骨格筋線維を取り囲む基底膜に見られる主要なアイソフォームです。ラミニン211が異常または不在の場合、基底膜と筋細胞との間のリンクが破壊され、疾患の発症につながる⁶。LAMA2-CMDの患者は、LAMA2遺伝子の突然変異の種類に応じて軽度から重度の表現型を示します。

ラミニンα2タンパク質の機能に影響を与えると、患者は出生時に重度の筋緊張低下を経験し、慢性炎症、線維症、筋萎縮を発症し、平均余命を縮める可能性があります。今日まで、標的療法は開発されておらず、治療アプローチは病気の症状を緩和することに限定されています⁷。したがって、この病気の発症に関与する根本的な分子メカニズムを理解することは、適切な治療戦略を開発するために重要です^6,8。LAMA2-CMDのモデルであるdy^Wマウス⁹を用いた以前の研究では、この病気の発症は子宮内、特に胎児の筋形成¹⁰の間に始まることが示唆されています。胎児の筋形成障害がどのように現れるかをよりよく理解することは、LAMA2-CMDの新しい治療アプローチを生み出す上でのゲームチェンジャーとなるでしょう。

in vitro システムは、細胞-細胞および細胞-ECM相互作用を研究するための制御された環境を提供しますが、2D培養モデルにはネイティブ組織の複雑さが欠けています。組織の脱細胞化により、2Dモデルや人工/合成足場と比較して、自然の細胞微小環境をより正確に模倣する組織および発生段階特異的な無細胞ECM足場が生成されます。脱細胞化マトリックス(dECM)は、宿主組織の分子的および機械的手がかりを保存する可能性があり、 in vivo プロセスを理解するためのより良い代替モデルになります¹¹。

脱細胞化に使用できる様々な技術、試薬、および条件がある^12、13。この研究では、Silvaら^14,15によって記述された胎児マウス心臓の脱細胞化プロトコルがマウス胎児骨格筋に適合し、テストされたすべてのECM成分(ラミニンα2、総ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンI、およびコラーゲンIV)を保持することが判明しました。このプロトコルには、浸透圧ショックによる細胞溶解(低張緩衝液)、原形質膜溶解およびタンパク質解離(0.05%ドデシル硫酸ナトリウム[SDS])、およびDNAの酵素的破壊(DNase処理)の3つのステップが含まれます。我々の知る限り、これはマウス胎児骨格筋を脱細胞化するための最初の確立されたプロトコルである。

この3DインビトロシステムをLAMA2-CMDの研究に使用するには、脱細胞化後のラミニンα2鎖を維持することが重要です。したがって、異なる洗剤(SDSおよびTriton X-100)および濃度(0.02%、0.05%、0.1%、0.2%、および0.5%)がテストされた最適化プロトコルが実装された(データは示されていない)。ラミニンα2タンパク質の細胞除去および保存のための最適な選択は、0.05%SDSであることがわかった。十分に確立された筋芽細胞株であるC2C12細胞^16,17を使用して、dECMを播種しました。これらの細胞はdECMに侵入し、増殖し、これらの足場内で分化し、新しいECMタンパク質を合成します。この3Din vitroモデルの作成の成功は、胎児の筋形成、LAMA2-CMDの発症に関与する分子および細胞プロセスを理解するための新しいアプローチを提供し、ECMと骨格筋細胞間のコミュニケーションが破壊される他の筋肉疾患に拡張することができます。

プロトコル

記載されているすべての方法論は、リスボン大学理学部の動物福祉委員会(ORBEA)およびDireção Geral de Veterinária(DGAV、ref. 0421/000/000/2022)によって承認されており、欧州指令2010/63 / EUに準拠しています。

1. 脱細胞化バッファーおよび試薬の調製

注:脱細胞化プロトコル中に使用されるすべての溶液は、特に明記されていない限り、オートクレーブ滅菌し、最大3か月間保管する必要があります。

1. 脱塩水(_dH2O)に塩化ナトリウム(NaCl)を137 mM、塩化カリウム(KCl)を2.68 mM、リン酸二水素カリウム(_KH2PO₄)を8.1 mM、リン酸二水素二水和物(Na₂HPO₄)を1.47 mMで添加し、pHを6.8に調整して、リン酸緩衝生理食塩水10倍(PBS10倍)を調製します。100 mLの10x PBSを900 mLの脱塩_H2Oに加えて、1x PBSを生成します。オートクレーブし、室温(RT)で保存します。滅菌ペニシリン/ストレプトマイシンストック溶液(10,000 U / mLペニシリンおよび10 mg / mLストレプトマイシン[ペン/連鎖球菌])を使用前に最終濃度1%まで加えます。.
2. 1.21 gのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(トリス塩基)と1 gのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を1 LのdH₂O(10 mMトリス塩基0.1%EDTA)に溶解して、低張緩衝液を調製します。溶解するまでマグネチックスターラーを使用し、NaOH / HClでpHを7.8に調整します。 オートクレーブ滅菌し、RTで保管します。 使用前にペン/連鎖球菌を最終濃度1%まで追加します。
3. 1.21 gのトリス塩基を1 LのdH₂O(10 mMトリス塩基)に溶解して、低張洗浄バッファーを調製します。溶解するまでマグネチックスターラーを使用し、NaOH / HClでpHを7.8に調整します。 オートクレーブしてRTで保管します。 使用前にペン/連鎖球菌を1%まで加えます。
4. 0.05 gのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を100 mLの低張洗浄液に加えて陰イオン界面活性剤処理を調製し、0.05%SDS処理液を生成します。0.22 μmのメンブレンフィルターでろ過します。RTで最大1か月間保管してください。
   注:SDS溶液はオートクレーブ時に沈殿および分解するため、オートクレーブしないでください。
5. 1.21 gのトリス塩基を0.5 mLのdH 2 Oに溶解し、1 mLの1 M塩化マグネシウム(MgCl₂)を加えてDNase処理液を調製します。NaOH/HClでpHを7.8に調整します。 オートクレーブでRTで保存し、使用前にDNase Iを加えてください(50 U/mL)。

2. サンプル収集

注:野生型C57 / BL6マウスが研究に利用されました。全ての技術は、無菌条件下で層流フード内で実施した。

1. 妊娠の胚の日(E)18.5に成体の妊娠中の雌マウスをイソフルラン吸入とそれに続く頸部脱臼を使用して安楽死させます。.マウスを終末解剖に供し、胎児を抽出する。
   1. マウスの腹部に70%エタノールをスプレーします。
   2. 外科用鉗子とはさみを用いて、下腹部の皮膚のひだを持ち上げ、U字型の切開を行い、腹腔を露出させる¹⁸。
   3. 卵管と子宮頸部を切断してE18.5胎児を含む子宮角を収集し、すぐに1%ペン/連鎖球菌¹⁸を含む氷冷1x PBSのペトリ皿に移します。
   4. 子宮や胚外組織から胎児をすばやく取り除き、ハサミを使用して斬首して安楽死させます¹⁸。
2. 一度に1人の胎児を氷のように冷たい1x PBSのペトリ皿に移します。実体顕微鏡を使用して、皮膚を取り除き、手足を切り取ります。腹側から、胸郭を切り裂き、胸骨とその下にある臓器を取り除きます。
3. 胎児体幹の背側を上にします。脊柱の頸部、背側脂肪沈着物、および背中の深部筋肉の上にある結合組織を取り除きます。
4. 外科用鉗子を使用して胸郭を固定し、マイクロメス¹⁰を使用して周囲の組織から背中の深部の筋肉を注意深くこすり、切り離します。この手順により、胎児ごとに2つの筋肉片(左右)が分離され、どちらも主に 長 肋筋と 腸肋 筋で構成され、 横棘 筋と 挙筋 の一部が含まれます。
5. 筋肉サンプルを1%ペン/連鎖球菌を含む1x PBSに4°Cで短期保存(<1週間)、または-80°Cで長期間保存します。
   注意: 最良の結果を得るには、新しく収集したサンプルを使用してください。長期間(>3ヶ月)凍結されたサンプルは、より低い脱細胞化効率およびより多くのタンパク質分解を示す。エパキシャル筋量は脱細胞化実験に使用されたが、他の筋肉(例えば、四肢の筋肉)は同じプロトコルを使用して脱細胞化のために処理することができる。

3.胎児骨格筋脱細胞化

注:すべての技術は、無菌条件下で層流フードで実施されました。詳細な回路図については、 図1Aを参照してください。全ての工程は、特に断りのない限り、直径120mm(165rpm)のオービタルシェーカー中で25°Cで攪拌しながら行った。使用前に1%ペン/連鎖球菌を溶液に加えます。溶液を除去するときは、サンプルがピペットに閉じ込められないように慎重に吸引してください。

1. 1日目 - 上軸筋量から約2 mm x 1 mm x 1 mm(~3.5 mg)の組織片を準備します。12ウェルプレートの各ウェルに1%ペン/連鎖球菌を含む3 mLの低張バッファーを追加し、ウェルごとに1つの筋肉組織断片全体を追加します。
   1. 組織断片を低張バッファー中で18時間(一晩)撹拌しながらインキュベートします(O / N)。
2. 2日目 -ファインチップピペットを使用して低張バッファーを吸引し、サンプルを攪拌しながら毎回3 mLの1x PBSで3 x 1時間洗浄します。
   1. サンプルを3 mLの0.05%SDS洗剤溶液で攪拌しながら24時間インキュベートします。
      注:(チェックポイント)SDSインキュベーション後、サンプルの外観は透明である必要があります。サンプルはゼラチンのような粘稠度を示すため、液体を除去するときにピペットに付着する傾向があります。
3. 3日目-ファインチップピペットを使用してSDS洗剤溶液を取り除き、組織断片を3 mLの低張洗浄バッファーで3 x 20分洗浄します。
   注:(一時停止ポイント)サンプルは、低張洗浄バッファーで4°Cで18時間(O/N)維持できます。残留SDSは細胞毒性である可能性があるため、洗浄ステップ中にSDSが十分に除去されていることを確認してください。
   1. 組織断片を2 mLのDNase溶液で3時間インキュベートし、37°Cで攪拌します。
   2. ファインチップピペットを使用してDNase溶液を取り出し、組織断片を攪拌しながら毎回3 mLの1x PBSで3 x 20分洗浄します。最後に、攪拌(60 rpm)でO / Nを洗浄します。
      注:DNase処理後、DNA残基が存在するため、dECMは粘着性になります。したがって、慎重な洗浄が必要です。
   3. dECMは、再細胞化(<1週間)まで、1%ペン/連鎖球菌を用いて4°Cで1x PBSで保存します。その他の用途は-80°Cで保管してください。

4. 脱細胞化品質評価

注:DNA定量、DAPI/メチルグリーン染色、およびファロイジン染色を実施して、脱細胞化後の残留細胞含有量の存在を評価しました。免疫組織化学およびウェスタンブロット解析を実施して、脱細胞化後の重要なECMタンパク質の保持を評価しました。

1. dECM中に存在するDNAの定量
   注:DNAの存在を検出するには、dECMを天然組織と比較する必要があります。
   1. 脱細胞化の前に、1.5 mLの微量遠心チューブを高精度のデジタルスケールで計量します。筋肉サンプルをチューブに移す前に、ペーパータオルを使用して残りの1x PBSをすべて取り除きます。チューブとサンプルの重量を量ります。式(1)を使用してサンプルの湿重量を計算します。
      サンプル_湿 重量=_{サンプル付き重量チューブ}-重量_{空のチューブ}(1)
   2. セクション3で説明されているプロトコルに従ってサンプルを脱細胞化します。
   3. サンプルを2 mLの微量遠心チューブに入れます。
      注:サンプルは、DNAの抽出と定量まで-20°Cに保つことができます。
   4. スピンカラムベースのキットを使用して、dECMおよびネイティブ組織サンプルのDNA抽出を実行します。製造元の指示に従って消化バッファーを追加します。
   5. チューブごとに1つの炭化タングステンビーズを使用して、ビーズミルで2回2.5分間サンプルを均質化します(マウントを反転させます)。
   6. プロテイナーゼKを添加し、56°Cでゆっくりと攪拌しながらO/Nをインキュベートします。
   7. 製造元の指示に記載されているプロトコルを続行します。
   8. メーカーが提供するバッファーで溶出し、4°Cで毎回≥6,000 x gで2 x 1分間遠心分離して、DNA収量を増やします。
      注:DNAは定量するまで-20°Cで保存できます。
   9. 製造元の指示に従って、蛍光dsDNA検出キットを使用してサンプル中に存在するDNAを定量します。
   10. DNA含有量を、サンプルの元の湿重量のミリグラムあたりのDNAナノグラムとして正規化します。
   11. 両側スチューデントの t検定を使用してデータを分析し、平均の平均±標準誤差(SEM)として表します。
2. 免疫組織化学
   注意: 溶液1、2、および3と固定液は使用前に準備する必要があり、最大6か月間凍結しておくことができます。使用したすべての抗体と色素、およびそれぞれの希釈液は、 テーブル 1.
   1. 溶液の調製
      1. パラホルムアルデヒド(PFA)2 g、スクロース8 g、および24 μLの1 M CaCl 2を77 mLの0.2 M Na 2 HPO 4および23 mLの0.2 M NaH 2 PO 4を加えて固定液を調製し、dH₂ Oを加えて最終容量200 mLにします。 pHを_7.4に調整します。
      2. 13.5 gのNa₂HPO 4および3.2 gのNaH 2 PO 4を1 LのdH₂Oに添加することにより、0.12 Mリン酸緩衝液を調製し、pHを_7.4に調整します。
      3. 100 mLの0.12 Mリン酸緩衝液に4 gのスクロースを加えて溶液1を調製します。
      4. 15 gのスクロースを100 mLの0.12 Mリン酸緩衝液に加えて溶液2を調製します。
      5. 100 mLの0.12 Mリン酸緩衝液に15 gのスクロースと7.5 gのゼラチンを加えて溶液3を調製します。ゼラチンが溶解するまで37°Cで加熱する。
      6. メチルグリーンストック溶液(dH 2 Oに溶解した₂%メチルグリーン粉末)¹⁹を準備します。
   2. 免疫検出
      1. 固定液を使用してサンプルを4°Cで少なくとも4時間固定します。
      2. サンプルを1x PBSで2回10分間洗浄します。
      3. O / Nを1日以上、溶液1に4°Cで保ちます。
      4. 洗浄し、O / Nまたは溶液2で4日以上4日以上保持します。 サンプルをRTまで温めます。
      5. 溶液3中で37°Cで3時間インキュベートします。 後で使用するために、追加の溶液3を37°Cに保管してください。
      6. 小さな容器(2 cm x 1 cm x 1 cm)をアルミホイルで成形します。溶液3の薄層を成形容器に入れ、固めます。固化溶液3の上にサンプルを置き、温かい溶液3で覆います。サンプルの向きを変えて固化させます。固化溶液3上の箇所をカラーペンで印する。
      7. ドライアイスチルドまたは液体窒素チルドイソペンタンの表面に容器を置いて凍結します。
      8. 最適な切断温度(O.C.T.)コンパウンドを使用して、サンプルを含む凍結ゼラチンキューブをクライオスタットマウントに固定します。
      9. 凍結ゼラチンキューブを切断し、組織切片をスライドに移します。60分間乾かします。
      10. 疎水性マーカーを使用して、セクションの周りの線をトレースします。
      11. スライドを1x PBSで3 x 10分洗浄します。
      12. 切片を1%ウシ血清アルブミン(BSA)、1%ヤギ血清、および1x PBS(ブロッキング溶液)で希釈した0.05%Triton X-100で30分間覆います(ブロッキングステップ)。
      13. 一次抗体をブロッキング溶液で希釈し、切片を覆います。切片が乾燥するのを防ぐために、湿った紙を入れた密閉箱の中で4°CでO / Nをインキュベートします。
      14. スライドを1x PBSで3 x 10分洗浄します。
      15. 二次抗体をブロッキング溶液で希釈し、切片を覆います。暗所でRTで1.5時間インキュベートします。
          注:蛍光色素の劣化を防ぐため、光への暴露は避けてください。
      16. スライドを4x PBSで3 x 10分洗浄します。
          注意: 強いバックグラウンドが存在する場合は、高濃度のPBSを使用できます。
      17. スライドをDAPI溶液(5 μg/mL 1,4-ジアザビシクロ-2,2,2-オクタン、0.1%トリトンX-100/1x PBS溶液)にそれぞれ30秒間沈めます。
      18. 1x PBSですすいでください。
      19. 切片を退色防止培地(1x PBS:グリセロール[1:9]に50 mg / mL n-プロピルガレート)で取り付け、カバーガラスで密封します。蛍光顕微鏡²⁰で観察・画像取得するまで4°Cで保存する。
          注: toto 免疫組織化学実験では、サンプルを1x PBSで希釈した4%PFAでRTで3時間固定したことを除いて、同じプロトコル(ステップ4.2.2.12-4.2.2.18を参照)を使用しました。使用した全ての抗体および色素、ならびにそれらのそれぞれの希釈液を 、表1に列挙する。次に、サンプルをスチールリングで分離された2つのカバーガラスの間に退色防止媒体にマウントし、蜜蝋で接着し、共焦点顕微鏡²¹を使用して100μmの画像スタックを取得しました。
3. ウェスタンブロット解析
   注:使用したすべての抗体とそれぞれの希釈液は、 テーブル 1.
   1. 溶液の調製
      1. グリセロール20 mL、SDS4 g、ブロモフェノールブルー0.2 mLを100 mM Tris塩基溶液80 mLに加えて、2x SDS-PAGEローディングバッファーを調製します。pHを6.8に調整します。使用前に新鮮なジチオスレイトール(DTT)を追加してください。.
      2. 2.4 gのトリス塩基、8.8 gのNaCl、および1 mLのTween-20をdH₂Oに最終容量1 Lまで加えることにより、Tween 20(TBST)溶液でトリス緩衝生理食塩水洗浄バッファーを調製します。 HClを使用してpHを7.4〜7.6に調整します。
      3. 10 LのdH 2 Oに30.2 gのトリス塩基、144.2 gのグリシン、および10 gのSDSを加えて、10xランニングバッファー(RB)を調製します。使用前に、100 mLの10x RBを900 mLのdH₂Oに加えて、1x RB(作業溶液)を調製します。
         注:10x RBはRTで数か月間保存できますが、1x RBはさまざまな実行で再利用できます。
      4. 5.82 gのトリス塩基、2.93 gのグリシン、および0.5 gのSDSを800 mLのdH₂Oに加えることにより、トランスファーバッファー(TB)を調製します。成分が溶解したら、メタノール200mLを加える。4°Cで冷却します。
         注意: TBは、毎回使用する前に新たに準備する必要があります。
   2. タンパク質抽出
      1. E18.5マウスから上軸筋を採取し、新たにDTT(100 mM DTT)を添加した2x SDS-PAGEローディングバッファーを含むマイクロ遠心チューブ(2 mL)に直ちに入れます。同じ方法でE18.5 dECMを処理します。
      2. チューブごとに1つのタングステンカーバイドビーズを追加します。ビーズミルで毎回2.5分間2倍ホモジナイズします(マウントを裏返します)。
      3. 超音波浴中で5分間サンプルを超音波処理する。
      4. サンプルを50°Cで10分間加熱します。
      5. サンプルを12,000 × g で4°Cで15分間遠心分離します。
      6. 上清を新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。
      7. 微量分光光度計を用いてタンパク質を定量する。
      8. さらに使用するまで-20°Cで保管してください。
   3. ポリアクリルアミドゲル電気泳動
      1. プレキャストアクリルアミドグラジエントゲルを使用(4%-20%)
      2. ゲルを電気泳動タンクにマウントします。櫛を慎重に取り外します。電気泳動タンクにラインが表示されるまで1x RBを追加します。ウェルがRBで満たされていることを確認してください。
      3. サンプルあたり100 μgのタンパク質をウェルにロードします。12 μLの高分子量タンパク質標準物質をロードします。
      4. 定電圧で合計100分間実行します(150Vで10分、185Vで90分)。
   4. 移転
      1. ゲルが流れている間、フィルターパッドとスポンジを冷やしたTB(4°C)に浸します。
      2. ポリビニリデン二フッ化膜をゲルのサイズにカットします。メタノールで活性化し、dH₂Oで洗浄します。
      3. 製造元の指示に従って、スポンジ、フィルターパッド、ゲル、および活性膜を使用してトランスファーカセットを取り付けます。
      4. カセットを冷やしたTBの入った電気泳動タンク(氷床の上)に入れます。冷却ユニットを追加します。100Vで90分間動作します。
      5. 移し替え後、クーマシーブルーの代用品で染色して転写品質を評価します。
   5. 免疫検出
      1. ブロッキング溶液(5%低脂肪牛乳を含むTBST)を準備します。RTで1時間攪拌しながら膜をインキュベートします。
      2. TBSTで3 x 5秒すすぎます。
      3. TBSTで希釈した一次抗体を2%BSAおよび0.02%アジ化ナトリウム(メンブレンあたり3 mL)でメンブレンO/Nをコールドチャンバー(4°C)で撹拌しながらインキュベートします。
      4. 翌日、TBSTで3 x 5分洗浄します。
      5. 西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体をTBSTで希釈し、5%低脂肪ミルク(各メンブレンに5 mL)を加えてメンブレンをRTで1時間インキュベートします。
      6. TBSTで膜を3 x 5分洗浄します。検出ステップまでTBSTに保管してください。
      7. 市販の開発キットを使用してタンパク質を視覚化します。製造元の指示に従って検出試薬を追加してください。バンドの画像を取得します。
      8. メンブレンごとに複数の抗体を検査するには、検出ステップの後、TBSTを使用して3回の洗浄(各5分)で前者の抗体を取り除き、ステップ4.3.5.2-4.3.5.7を繰り返します。

表1:免疫組織化学およびウェスタンブロット分析に用いた抗体および色素ならびにそれぞれの希釈液。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。^10.22

5. 脱細胞化マトリックスにおける細胞培養

注:すべての技術は、層流フード内の無菌条件下で実行されました。全てのインキュベーションは、37°Cおよび5%_CO2を用いて行った。

1. 細胞培養培地、高グルコースダルベッコ改変イーグル培地を安定グルタミンとピルビン酸ナトリウム(DMEM)で調製し、10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペン/連鎖球菌(完全培養培地)を添加します。
2. dECMを層流フードに1%ペン/ストレプトを入れた1x PBSのペトリ皿に入れ、マイクロメスとピンセットを使用して約500 μm x 500 μm x 250 μmの断片に分離します。
   注:dECMは柔らかい質感を持っているため、マイクロメスで切断するよりも、ピンセットを使用してほぼ同じサイズの断片に分離する方が簡単なことがよくあります。
3. 断片を、あらかじめ37°Cに温めた200 μLの完全培養培地を含む96ウェルプレート(ウェルあたり3個または4個)に移します。 インキュベーターで2時間インキュベートします。
4. サブコンフルエント(~70%)C2C12細胞を播種したT25フラスコに500 μLのトリプシンを加えます。1 mLの完全培地に再懸濁します。.
5. 10 μLの再懸濁液を10 μLのトリパンブルー色素に加え、血球計算盤にロードします。細胞数をカウントして計算し、細胞の生存率を確認します。
6. dECMを含む96ウェルプレートから培地を吸引し、50,000個の生存C2C12細胞を含む200 μLの完全培養培地を追加します。
7. 2日間インキュベートした後、ピンセットを使用して、dECM(細胞を含む)を400 μLの完全培養培地を含む48ウェルプレートに移します。2日ごとに、マイクロピペットで培地を注意深く吸引して、dECMがウェルの底から剥離しないようにし、8日目まで新しい培地を追加します。
   注:マトリックスは、dECMへのC2C12細胞の接着を促進するために96ウェルプレートで2日間保持され、その後、栄養素を含むより多くの培地にアクセスできるように48ウェルプレートに移されます。dECMはウェルの底に付着する必要があります。
8. 分化実験では、8日目に完全培養培地を分化培地(2%ウマ血清と1%ペン/連鎖球菌を添加したDMEM)に交換し、その後分化培地で12日目まで4日間インキュベートします。

結果

脱細胞化プロトコルの目標は、天然組織の組成によく似たdECMを産生することです。脱細胞化プロセスの有効性を判断するために、組織形態の検査、DNAレベルの測定、F-アクチンの染色、免疫組織化学およびウェスタンブロッティング技術を使用した主要なECM成分の分析など、さまざまな方法が採用されました。具体的には、骨格筋組織の5つの主要なECM成分を分析しました。

ディスカッション

ECMは、すべての組織に存在する高分子の複雑なネットワークであり、細胞の挙動と機能の調節に重要な役割を果たします²。ECMは、細胞が付着するための物理的な足場として機能し、増殖、運動性、分化、アポトーシスなどの細胞プロセスをアクティブに調節する手がかりを提供します。したがって、ECMの適切な形成と維持は、発生と恒常性の両方にとって不可欠です

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile	Abdos Labware	P21021
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Merck	D8417
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Bio-Rad	4561093
48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile	Abdos Labware	P21023
96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile	Abdos Labware	P21024
Bovine Serum Albumin, Fraction V	NZYtech	MB04601
BX60 fluorescence microscope	Olympus
Cryostat CM1860 UV	Leica
Dithiothreitol	ThermoFisher	R0862
DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate	Biowest	L0103-500
DNase I	PanReac AppliChem	A3778
DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69506
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Merck	108418
Fetal bovine serum	Biowest	S1560-500
Fine tip transfer pipette	ThermoFisher	15387823
Goat serum	Biowest	S2000-100
Hera Guard Flow Cabinet	Heraeus
Heracell 150 CO2 Incubator	Thermo Scientific
HiMark Pre-stained Protein Standard	Invitrogen
Horse Serum, New Zealand origin	Gibco	16050122
HRP-α- Rabbit IgG	abcam	ab205718
HRP-α- Rat IgG	abcam	ab205720
HRP-α-Mouse IgG	abcam	ab205719
ImageJ v. 1.53t
Methyl Green	Sigma-Aldrich	67060
MM400 Tissue Lyser	Retsch
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer	ThermoFisher
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free	Alfa Aesar	043368-9M
Penicillin-Streptomycin (100x)	GRiSP	GTC05.0100
Phalloidin Alexa 488	Thermo Fisher Sci.	A12379
Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile)	Greiner Bio-One	628161
Qubit dsDNA HS kit	Thermo Scientific	Q32851
Qubit™ 3 Fluorometer	Invitrogen	15387293
S6E Zoom Stereo microscope	Leica
Sodium Dodecyl Sulfate	Merck	11667289001
SuperFrost® Plus adhesion slides	Thermo Scientific	631-9483
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	15626144
TCS SPE confocal microscope	Leica
Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99%	VWR Chemicals	28811.295
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061
Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X)	GRiSP	GTC02.0100
TWEEN 20 (50% Solution)	ThermoFisher	3005
WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm)	Advansta	L-08024-001
α-Collagen I	abcam	ab21286
α-Collagen IV	Millipore	AB756P
α-Collagen IV	Santa Cruz Biotechnology	sc-398655
α-Fibronectin	Sigma	F-3648
α-Laminin α2	Sigma	L-0663
α-MHC	D.S.H.B.	MF20
α-Mouse Alexa 488	Molecular Probes	A11017
α-Mouse Alexa 568	Molecular Probes	A11019
α-pan-Laminin	Sigma	L- 9393
α-phospho-histone 3	Merk Millipore	06-570
α-Rabbit Alexa 568	Molecular Probes	A21069
α-Rabbit Alexa 488	Molecular Probes	A11070
α-Rat Alexa 488	Molecular Probes	A11006