RNA פלואורסצנטי באתרו הכלאה ללוקליזציה ארוכה של RNA לא מקודד בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה של הכלאה פלואורסצנטית באתרו של RNA כדי למקם את lncRNA בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים.

Abstract

התפקידים החשובים של RNA ארוך שאינו מקודד (lncRNAs) בסרטן נחקרו, כגון ויסות ההתפשטות, מעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT), הגירה, חדירה ואוטופגיה של תאים סרטניים. זיהוי לוקליזציה של lncRNA בתאים יכול לספק תובנה לגבי תפקודיהם. על ידי תכנון רצף שרשרת האנטיסנס הספציפי ל-lncRNA ואחריו תיוג בצבעים פלואורסצנטיים, ניתן ליישם הכלאה פלואורסצנטית באתרו של RNA (FISH) כדי לזהות את הלוקליזציה התאית של lncRNAs. יחד עם התפתחות המיקרוסקופ, טכניקות RNA FISH מאפשרות כעת אפילו הדמיה של lncRNA מבוטא בצורה גרועה. שיטה זו יכולה לא רק לזהות לוקליזציה של lncRNA לבד, אלא גם לזהות את הלוקליזציה של RNA אחרים, DNA, או חלבונים באמצעות צבע כפול או multicolor immunofluorescence. כאן, כללנו את הליך הפעולה הניסויי המפורט ואת אמצעי הזהירות של RNA FISH באמצעות lncRNA גרעין קטן RNA מארח גן 6 (SNHG6) בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים (143B) כדוגמה, כדי לספק התייחסות לחוקרים שרוצים לבצע ניסויים RNA FISH, במיוחד lncRNA דגים.

Introduction

הבנתנו את הגנום האנושי הורחבה מאוד על ידי ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיית הגנום השלם. כ-93% מהגנום האנושי ניתן לשעתוק לרנ"א, אך רק 2% מהרנ"א ניתן לתרגם לחלבונים; 98% הנותרים של RNA שאין להם פונקציית תרגום חלבונים נקראים RNA לא מקודד (ncRNA)¹. כקבוצה של רנ"א לא מקודד (ncRNAs), ncRNA ארוך (lncRNAs), המכיל מעל 200 נוקלאוטידים², משכו תשומת לב גוברת בשל מעורבותם בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים של התאים, כגון התמיינות, בקרת מחזור, אפופטוזיס, הגירה ופלישה ^3,4,5. LncRNA ממלאים את תפקידם באמצעות מנגנונים שונים, כגון ויסות מבנה הכרומטין וביטוי גנים גרעיניים, שליטה בתהליך השחבור mRNA, ושינוי לאחר שעתוק⁶. LncRNAs מווסתים את ההתרחשות, ההתפתחות והגרורות של ממאירויות הן ברמת השעתוק והן ברמת השעתוק שלאחר השעתוק. ויסות השעתוק מתממש בגרעין על ידי השפעה על שעתוק RNA באמצעות קשירה למבנים הכרומוזומליים, בעוד שהוויסות שלאחר השעתוק מתממש בציטופלסמה על ידי שליטה בגני המטרה באמצעות מנגנון RNA תחרותי אנדוגני⁽ceRNA) ^5,7,8. CeRNA חשפה מנגנון חדש של אינטראקציית RNA, כלומר ש-lncRNA יכול לשמש כספוג כדי לספוח miRNA ולעכב את הפירוק בתיווך miRNA של גני מטרה קשורים⁹. לכן, המידע לגבי לוקליזציה תת-תאית של lncRNAs, האם lncRNA מסוים ממוקם בציטופלסמה או בגרעין, חשוב כדי לסייע בזיהוי הפונקציות הביולוגיות שלהם.

כיום, לוקליזציה של lncRNA מזוהה בעיקר על ידי שתי שיטות, האחת היא על ידי בדיקת בידוד שברים גרעין/ציטופלסמה, והשנייה היא על ידי RNA FISH. בראשון, RNAs בשברים הציטופלזמיים והגרעיניים מופקים בהתאמה, ולאחר מכן הגברה PCR מבוצעת עם פריימרים ספציפיים lncRNA כדי לזהות את היחס של lncRNA בציטופלסמה ובגרעין. היתרון של שיטה זו הוא יעילות הזמן, בעוד החיסרון הוא כי לוקליזציה lncRNA בפועל אינו משתקף ישירות על ידי החלק היחסי של lncRNA בציטופלסמה ובגרעין. RNA FISH יכול לזהות לוקליזציה של lncRNA בתאים באמצעות תכנון רצפי שרשרת אנטיסנס ספציפיים ל-lncRNA ולאחר מכן תיוג בצבעים פלואורסצנטיים¹⁰. שיטות RNA FISH שופרו עם התקדמות בטכניקות בדיקה ושיטות זיהוי, כולל ערכות בדיקה מרובות אוליגו¹¹ המסומנות בפלואורופור, בדיקות LNA 12 ובדיקות DNA מסועף (bDNA)¹³. RNA FISH יכול לא רק לזהות לוקליזציה של lncRNA, אלא גם לזהות את הלוקליזציה של RNAs אחרים, DNA, או חלבונים באמצעות צבע כפול או צבעוני immunofluorescence¹⁴.

בעבודה זו, כללנו את פרוטוקול זיהוי הלוקליזציה התוך-תאי המפורט של lncRNA גן מארח גרעין קטן RNA 6 (SNHG6) בתאי אוסטאוסרקומה (143B) על ידי RNA FISH כדוגמה. SNHG6 הוא lncRNA נוקלאוטיד 600-730 בצורתו השחבור הבוגר ומזוהה כאונקוגן חדשני במגוון סוגי סרטן אנושיים, כולל סרטן המעי הגס, סרטן קיבה, קרצינומה של תאים צלולים בשחלות, אוסטאוסרקומה וקרצינומה הפטוצלולרית^15,16,17,18. מחקרים אישרו את מעורבותו של SNHG6 בהתנהגויות ביולוגיות של תאים סרטניים, כגון התפשטות, EMT ואוטופגיה, והראו לוקליזציה ציטופלזמית של SNHG6 שם הוא עשוי להשפיע על גני המטרה על ידי קשירה (ספוג) של miRNA^15,16,17. פרוטוקול זיהוי מפורט זה של לוקליזציה תוך-תאית SNHG6 על ידי RNA FISH מוצג כאן.

Protocol

עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים, הריאגנטים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה. איור 1 מראה את הפרוטוקול הכולל של דגי RNA; טבלה 1 מכילה את ההרכב של כל הפתרונות וטבלה 2 מכילה את רצפי הפריימר המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנת בדיקה

1. זהה ורכוש את רצף FASTA של lncRNA יעד של עניין, למשל, מ GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). בעקבות האינדיקציות באתר, עצבו את הגשושיות ISH באינטרנט¹⁹, ועיינו בהצעות של אלגוריתם העיצוב לרשום את הגשושיות שיש להזמין עם תווית Cy3.
2. יש לדגור על מאגר ההכלאה בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים מראש.
3. יש להמיס 4 בדיקות בצפיפות אופטית (OD) ב-160 מיקרוליטר של דיאתילפירוקרבונט (DEPC) המטופל ב-ddH₂O בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל הרחק מהאור.
   הערה: צפיפות אופטית (OD) מייצגת את יחידת המידה של DNA ו-RNA. בדרך כלל, 1 יחידת OD = 33 מיקרוגרם / מ"ל DNA.
4. הכינו 200 μL של תערובת הבדיקה עבור כל באר (1.2 μL-10 μL של בדיקה, 70 μL של חיץ הכלאה, להשלים את הנפח עם ddH₂O עד 200 μL מטופל DEPC), ולהגדיר סדרה של 50 מיקרוגרם / מ"ל, 25 מיקרוגרם / מ"ל, 12.5 מיקרוגרם / מ"ל ו 6 מיקרוגרם / מ"ל.
   הערה: ריכוז הגשושית צריך להיחקר באופן ניסיוני מראש. ריכוז בדיקה גבוה יוביל לקשירה לא ספציפית של lncRNAs, בעוד שריכוז בדיקה נמוך יוביל לזיהוי לא רגיש או כושל של lncRNAs.
5. נטרל את תערובת הבדיקה ב 73 ° C במשך 5 דקות.
   הערה: אם בדיקת הדנ"א המסומנת ב-Cy3 היא דו-גדילית, יש לפרק את הגשושית לדנ"א חד-גדילי בטמפרטורה של 95°C למשך 5 דקות, ואז לקרר במהירות למשך 2 דקות על קרח.

2. הכנת תאים

1. זרעו 50,000 תאי 143B לבאר על כיסויי זכוכית סטריליים בצלחת תרבית תאים של 12 בארות ודגרו עליהם במשך 24 שעות (37°C, 5% CO₂) ב-DMEM.
   הערה: מספר התאים הספציפי שנזרע כאן משתנה בהתאם לגודל התא, המתאים לתאי הזרע להגיע למפגש של 50% לאחר הדגירה במשך 24 שעות. כיסויי הזכוכית הסטריליים עגולים כדי להתאים לצלחת 12 בארות.
2. הסר את המדיום ושטוף במשך 2 x 5 דקות עם 1x מי מלח חוצצים פוספט (PBS).
   הערה: הכן PBS 1x עם ddH₂O. PBS ללא טיפול DEPC לא ניתן להשתמש מכיוון שהוא מכיל RNase. בצע את כל השלבים הבאים בתנאים נטולי RNase.
3. הסר PBS 1x והוסף 200 μL של 100% אתנול בכל באר כדי לתקן במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
4. מוציאים את האתנול, מוסיפים 200 μL של 0.1% Triton X-100 (ב-1x PBS) בכל באר, ודגרים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: הזמן צריך להיות נשלט בקפידה עם חדירות Triton X-100 ולא יכול להיות ארוך מדי.
5. יש להסיר 0.1% Triton X-100 ולשטוף 2 x 5 דקות עם 1x PBS.
   הערה: אם יש להשהות את הפרוטוקול כאן, החלף את PBS באתנול 70% (דילול של 100% אתנול עם ddH₂O נטול RNase) ואחסן את הדגימה ב- 4 ° C למשך עד 3 חודשים.
6. הסר 1x PBS, הוסף 200 μL של 2x סודיום ציטראט מלח (SSC) חיץ (דילול של 20x SSC עם ddH₂O ללא RNase) לתוך כל באר, ודגרה במשך 30 דקות ב 37 ° C.
7. יש להסיר 2x SSC buffer, להוסיף 200 μL של 70% אתנול לתוך כל באר, ולדגור במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
8. יש להשליך את 70% האתנול, להוסיף 200 μL של 85% אתנול (דילול של 100% אתנול עם ddH₂O נטול RNase) לתוך כל באר, ולדגור במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
9. יש להשליך את 85% האתנול, להוסיף 200 μL של 100% אתנול לכל באר, ולדגור במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
10. לספוג ולהשליך 100% אתנול; תנו לבארות להתייבש.

3. הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH)

1. הוסיפו 200 מיקרוליטר של תערובת בדיקה (מפורקת כמו בשלב 1.5) לכל באר ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה (16-18 שעות).
   הערה: קיים מתאם חיובי חזק בין טמפרטורת ההכלאה לבין ריכוז הבדיקה; לכן, כדי לייעל את הרקע, יש להפחית הן את טמפרטורת ההכלאה והן את ריכוז הבדיקה.
2. למחרת, להוציא דגימות מ 37 מעלות צלזיוס ולהשליך את תערובת הבדיקה. יש להוסיף 200 μL של 0.4x SSC/0.3% Tween-20 buffer לכל באר (שחומם מראש ב-65°C) ולשטוף במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
3. הסר את מאגר 0.4x SSC/0.3% Tween-20, הוסף 200 μL של חיץ 2x SSC/0.1% Tween-20 לכל באר ושטוף במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
4. יש להסיר 2x SSC/0.1% Tween-20 buffer, להוסיף 200 μL של תמיסת צביעה 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1 מיקרוגרם/מ"ל), ולהכתים למשך 20 דקות הרחק מאור.
5. יש להשליך את תמיסת הצבע DAPI ולשטוף עם PBS אחד למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
6. הוסף 50 μL של אמצעי הרכבה המכיל מסטיק על המגלשה והנח את מכסה הזכוכית על המגלשה כדי לתקן.
   הערה: הקפד למקם את תלוש הכיסוי על השקופית כשצד התא כלפי מטה.
7. התבוננו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
   הערה: השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי או במיקרוסקופ קונפוקלי לייזר; האחרון מייצר רגישות גבוהה יותר הדמיה בהירות.

תוצאות

מוצגות תמונות מייצגות של דגי SNHG6 בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים (איור 2). השליטה השלילית מטופלת עם בדיקת Ctrl שלילית; בקרה חיובית מטופלת עם U6 probe ²⁰. בדיקת SNHG6 וגשושית U6 מסומנות ב- Cy3, הפולט פלואורסצנטיות אדומה. DAPI הוא צבע שמכתים את הדנ"א, אשר פולט פלואורסצנטיות כחולה. תוצא?...

Discussion

פרוטוקול RNA FISH זה יכול לא רק לזהות לוקליזציה של lncRNA בתאים, אלא גם לזהות את הקולוקליזציה של RNAs אחרים, DNA, או חלבונים בתאים, אשר יכול לשמש גם כדי לזהות את המיקום של lncRNA ברקמות משובצות פרפין. עם זאת, הפרוטוקול הספציפי במקרים כאלה שונה מכיוון שהרקמות המשובצות בפרפין צריכות להיות בשעווה^21...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic cell counter	Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd	IC1000	Counting cells
Cell culture plate-12	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	3513,corning	Place the coverslips in the plate
Cell line (143B)	Cell Bank of Chinese Academy of Sciences	CRL-8303	osteosarcoma cancer cell line
Centrifuge tube (15 mL, 50 mL)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	430790, Corning	Centrifuge the cells
Coverslips	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	abs7026	The cells are seeded on the coverslips
Cy3 label-SNHG6 DNA probe	Shanghai GenePharma Co.,Ltd	A10005	Detect SNHG6 location
DMEM media	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	LM-E1141	Cell culture medium
Dry Bath Incubator	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.	DKT200-2	Incubation at different high temperatures
Ethanol 100%	Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd	10009218	dehydration
Fluorescence microscope	Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD	Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus	Observation and positioning
Incubator	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD	DHP-9051	The samples were incubated at 37 °C.
Mounting Medium	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	E675004	Attach the coverslips to the slide
Shaker	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.	TS-8S	Washing sample
Slide	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	188105	The coverslips is placed on the slide
Triton X-100	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A600198	Permeable membrane and nuclear membrane
Trypsin (0.25%)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	25200056, Gibco	trypsin treatment of cells
Tween-20	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A600560	detergent