Hibridização in situ por fluorescência de RNA para localização de RNA longo e não codificante em células de osteossarcoma humano

Resumo

O presente protocolo descreve um método de hibridização in situ por fluorescência de RNA para localizar os lncRNAs em células humanas de osteossarcoma.

Resumo

Os papéis importantes dos RNAs longos não-codificadores (lncRNAs) no câncer têm sido estudados, tais como a regulação da proliferação, transição epitélio-mesenquimal (EMT), migração, infiltração e autofagia de células cancerosas. A detecção de localização de lncRNAs em células pode fornecer informações sobre suas funções. Ao projetar a sequência de cadeia antisense específica para lncRNA seguida de marcação com corantes fluorescentes, a hibridização in situ por fluorescência de RNA (FISH) pode ser aplicada para detectar a localização celular de lncRNAs. Juntamente com o desenvolvimento da microscopia, as técnicas de RNA FISH agora permitem até mesmo a visualização dos lncRNAs mal expressos. Este método pode não só detectar a localização de lncRNAs sozinho, mas também detectar a colocalização de outros RNAs, DNA, ou proteínas usando imunofluorescência de cor dupla ou multicolorida. Aqui, incluímos o procedimento detalhado de operação experimental e precauções de RNA FISH usando lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) em células humanas de osteossarcoma (143B) como um exemplo, para fornecer uma referência para pesquisadores que desejam realizar experimentos de RNA FISH, especialmente lncRNA FISH.

Introdução

Nossa compreensão do genoma humano tem sido grandemente expandida pelos recentes avanços na tecnologia do genoma completo. Cerca de 93% do genoma humano pode ser transcrito em RNAs, mas apenas 2% dos RNAs podem ser traduzidos em proteínas; os 98% restantes dos RNAs que não têm função de tradução de proteínas são chamados de RNA não codificantes (ncRNA)¹. Como uma classe de RNAs não codificantes (ncRNAs), os ncRNAs longos (lncRNAs), contendo mais de 200 nucleotídeos2, têm atraído atenção crescente devido ao seu envolvimento em muitos processos fisiológicos e patológicos das células, como diferenciação, controle do ciclo, ....

Protocolo

Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes de todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo. A Figura 1 mostra o protocolo geral para RNA FISH; A Tabela 1 contém a composição de todas as soluções e a Tabela 2 contém as sequências de primers utilizadas neste protocolo.

1. Preparação da sonda

1. Identificar e adquirir a sequência FASTA de um lncRNA alvo de interesse, por exemplo, do GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Seguindo as indicações no site, projete as sondas ISH online^19....

Discussão

Este protocolo de RNA FISH pode não apenas detectar a localização de lncRNAs em células, mas também detectar a colocalização de outros RNAs, DNA ou proteínas nas células, que também podem ser usados para detectar a localização de lncRNAs em tecidos embebidos em parafina. Entretanto, o protocolo específico nesses casos é diferente, pois os tecidos emblocados em parafina necessitam ser desparafinados²¹. Este procedimento experimental pode ser aplicado em placas de 48 ou 96 poços, mas .......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic cell counter	Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd	IC1000	Counting cells
Cell culture plate-12	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	3513,corning	Place the coverslips in the plate
Cell line (143B)	Cell Bank of Chinese Academy of Sciences	CRL-8303	osteosarcoma cancer cell line
Centrifuge tube (15 mL, 50 mL)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	430790, Corning	Centrifuge the cells
Coverslips	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	abs7026	The cells are seeded on the coverslips
Cy3 label-SNHG6 DNA probe	Shanghai GenePharma Co.,Ltd	A10005	Detect SNHG6 location
DMEM media	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	LM-E1141	Cell culture medium
Dry Bath Incubator	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.	DKT200-2	Incubation at different high temperatures
Ethanol 100%	Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd	10009218	dehydration
Fluorescence microscope	Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD	Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus	Observation and positioning
Incubator	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD	DHP-9051	The samples were incubated at 37 °C.
Mounting Medium	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	E675004	Attach the coverslips to the slide
Shaker	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.	TS-8S	Washing sample
Slide	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	188105	The coverslips is placed on the slide
Triton X-100	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A600198	Permeable membrane and nuclear membrane
Trypsin (0.25%)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	25200056, Gibco	trypsin treatment of cells
Tween-20	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A600560	detergent