מיקרו-הזרקה של רטרו-וירוס רקומביננטי RCAS(A) לעדשת עוף עוברית

Summary

מאמר פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה של מיקרו-הזרקה של רטרו-וירוס RCAS(A) בעדשת עוף עוברית ככלי לחקר תפקוד באתרו וביטוי חלבונים במהלך התפתחות העדשה.

Abstract

עוף עוברי (Gallus domesticus) הוא מודל חייתי מבוסס היטב לחקר התפתחות העדשה והפיזיולוגיה, בהתחשב במידת הדמיון הגבוהה שלה לעדשה האנושית. RCAS(A) הוא רטרו-וירוס עוף בעל יכולת שכפול המדביק תאים מתחלקים, המשמש ככלי רב עוצמה לחקר הביטוי באתרו ותפקודם של חלבונים מסוג בר וחלבונים מוטנטיים במהלך התפתחות העדשה על ידי מיקרו-הזרקה ללומן הריק של שלפוחית העדשה בשלבי התפתחות מוקדמים, ומגביל את פעולתו לתאי עדשה מתרבים סביב. בהשוואה לגישות אחרות, כגון מודלים טרנסגניים ותרביות ex vivo, השימוש ברטרו-וירוס עופות בעל יכולת שכפול RCAS(A) מספק מערכת יעילה, מהירה וניתנת להתאמה אישית לביטוי חלבונים אקסוגניים בעוברי אפרוחים. באופן ספציפי, העברת גנים ממוקדת יכולה להיות מוגבלת לתאי סיבי עדשה מתרבים ללא צורך במקדמים ספציפיים לרקמות. במאמר זה, נסקור בקצרה את השלבים הדרושים להכנת רטרו-וירוס רקומביננטי RCAS(A), נספק סקירה מפורטת ומקיפה של הליך המיקרו-הזרקה, ונספק תוצאות לדוגמה של הטכניקה.

Introduction

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר את המתודולוגיה של מיקרו-הזרקה של עדשת עוף עוברית של RCAS(A) (סרקומה של עופות / רטרו-וירוס לויקוזיס A). העברה רטרו-ויראלית יעילה בעדשת עוף עוברית הוכחה ככלי מבטיח לחקר in vivo של המנגנון המולקולרי והמבנה-תפקוד של חלבוני עדשה בפיזיולוגיה רגילה של העדשה, בתנאים פתולוגיים ובהתפתחות. יתר על כן, מודל ניסיוני זה יכול לשמש לזיהוי מטרות טיפוליות וסינון תרופות למצבים כגון קטרקט מולד אנושי. בסך הכל, פרוטוקול זה נועד לפרוס את הצעדים הדרושים לפיתוח פלטפורמה להתאמה אישית לחקר חלבוני עדשה.

אפרוחים עובריים (Gallus domesticus), בשל הדמיון שלהם במבנה העדשה ובתפקודה עם העדשה האנושית, הם מודל חייתי מבוסס היטב לחקר התפתחות העדשה ופיזיולוגיה 1,2,3,4. השימוש ברטרו-וירוס עופות RCAS(A) בעל יכולת שכפול נחשב למערכת יעילה, מהירה וניתנת להתאמה אישית לביטוי חלבונים אקסוגניים בעוברי אפרוחים. יש לציין כי יש לו יכולת ייחודית להגביל את העברת גן המטרה לתאי סיבי עדשה שגשוגיים ללא צורך במקדמים ספציפיים לרקמות, תוך שימוש במסגרת הזמן הייחודית להתפתחות עוברית שבה נוכחות לומן עדשה ריק מאפשרת באתרו מיקרו-הזרקה RCAS(A) לאתר המוגבל לביטוי חלבונים אקסוגניים בתוך תאי סיבי עדשה מתרבים^{5, 6,7,8}.

הליך המיקרו-הזרקה של עובר אפרוח, המתואר כאן בהרחבה, מבוסס בחלקו על עבודתו של Fekete et. ^al.6 ופותח עוד יותר על ידי Jiang et. ^al.8 ושימש כאמצעי להחדרת פלסמידים נגיפיים ולא ויראליים לעדשת אפרוחים עובריים 1,9,10,11,12,13. בסך הכל, העבודה הקודמת מדגימה את הפוטנציאל של שימוש במתודולוגיה זו לחקר התפתחות עדשות, התמיינות שלהן, תקשורת תאית והתקדמות מחלות, ולגילוי ובדיקה של מטרות טיפוליות למצבים פתולוגיים של עדשות כגון קטרקט.

Protocol

מחקר זה נערך בהתאם לחוק צער בעלי חיים ולתקנות צער בעלי חיים בהתאם לעקרונות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס בסן אנטוניו. לסקירה כללית של הפרוטוקול, ראו איור 1; עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים, הריאגנטים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.

איור 1: מתווה ניסויי. 1 . השלב הראשון של הפרוטוקול הוא קביעת חלבון מטרה ספציפי, זיהוי רצפי הגנים הקשורים ויצירת מקטעי DNA. 2 . שיבוט רצפי הגן לווקטור רטרו-ויראלי על ידי שיבוט ראשוני לווקטור מתאם, 3. ואחריו וקטור ויראלי . 4 . הכנת חלקיקים נגיפיים בעלי טיטר גבוה באמצעות תאי אריזה לקציר והתרכיז. 5 . השלב האחרון, והמוקד של פרוטוקול זה, הוא מיקרו-הזרקה של חלקיקי נגיפים RCAS(A) לתוך לומן העדשה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

1. הכנת רטרו-וירוסים רקומביננטיים בעלי טיטר גבוה

1. תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ליצירת מקטעי DNA של חלבון מטרה
   הערה: סעיף זה נועד להגביר את רצף הדנ"א המתאים לחלבון עדשת המטרה. לקבלת פרטים נוספים, ראה ^7,8.
   1. תכנון פריימרים עבור PCR, המתאימים לחלבון המעניין, כדי ליצור מקטעי DNA עם termini carboxyl שלהם בתוך מסגרת עם או בלי רצף אפיטופ FLAG (5'-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3'), קודון עצירה, ואתר אנזים הגבלה (כלומר, EcoRI) נוכח בתוך אזור פולילינקר של CLa12NCO)) על פי המפרטים שצוינו בפרוטוקולים שפורסמו בעבר, עם רצפים עבור אנזימי הגבלה נאותים^1, 7,8,10,11.
   2. בצע את תגובת ה-PCR¹⁰. שלב 100 pmol של חישה ואנטיסנס של הפריימרים המעוצבים עם 0.5 מיקרוגרם של connexin cDNA (כגון Cx50, Cx43, או שילובים כימריים Cx50*43L), למאגר התגובה PCR הנבחר. בצע 30 מחזורים שכל אחד מהם מורכב מ- 94 ° C למשך דקה אחת, 58 ° C למשך דקה אחת ו- 72 ° C למשך דקה אחת, ולאחר מכן הארכה סופית למשך 10 דקות ב- 72 ° C.
   3. בודדו וטיהרו מוצרי PCR עם ערכת טיהור ג'ל.
   4. לעכל את מוצרי ה-PCR המטוהרים באמצעות אנזימי הגבלה לפי בחירתכם בהתאם להוראות היצרן.
2. שיבוט של החדרת DNA לפלסמיד מתאם
   הערה: החדרת מקטעי DNA לווקטור מתאם מבטלת את הצורך בתאים/וירוסים מסייעים כדי להגביר את יציבות וקטור RCAS(A)¹⁴. לקבלת פרטים נוספים, ראה ^7,8.
   1. תת-שכפול מקטעי DNA לתוך פלסמיד מתאם, Cla12NCO באמצעות תגובת קשירה דביקה. ערבבו את מקטעי ה-PCR עם אנזימי הגבלה ו-Cla12NCO ביחס של 2-5:1. ביצוע קשירה וטרנספורמציה של DNA באמצעות תאים מתאימים.
   2. בודדו DNA באמצעות ערכת בידוד DNA.
   3. רצף את הדנ"א כדי להבטיח דיוק.
3. שיבוט לווקטור הנגיפי RCAS(A)
   הערה: מקטעי DNA מוחדרים לרכב (RCAS(A) רטרו-וירוס) לצורך העברה יציבה של גן לתאים בעובר אפרוח מתפתח^14,15. לקבלת פרטים נוספים, ראה ^7,8,15.
   1. עיכלו את מקטע Cla12NCO-DNA של וקטור המכיל עניין עם ClaI (יחידה אחת לכל 1 מיקרוגרם של DNA) ובודדו את המקטעים.
   2. לשכפל את מקטעי הדנ"א לפלסמיד RCAS(A) ליניארי ClaI. השתמש באנזים ההגבלה SalI כדי להבחין באתר ClaI על פלסמיד RCAS(A).
   3. אשר את הכיוון הנכון של המקטעים שהוכנסו על המבנים על ידי עיכול עם אנזימי הגבלה ClaI ו- SalI.
   4. בודדו DNA באמצעות ערכת בידוד DNA.
   5. לקבוע את ריכוז ה- DNA.
4. טרנספקציה של תאי פיברובלסט עוברי אפרוח (CEF) וקציר RCAS(A)
   הערה: תאי אריזה של וירוסים, CEFs, משמשים להשגה/קצירת מדיה של תרבית תאים המכילה חלקיקים נגיפיים^15,16. לקבלת פרטים נוספים, ראה ^7,8,15.
   1. Transfect תאי CEF עם מבני DNA רטרו-ויראליים רקומביננטיים באמצעות סוכן transfection על פי הוראות היצרן.
   2. לבצע ניקוי מערבי של התאים הנגועים כדי לבחון את הביטוי שלהם של החלבון המעניין.
   3. כאשר התאים הנגועים מגיעים למפגש, התחילו לאסוף את התווך הסופרנאטנטי, לעבד/לסנן אותו כראוי (כדי להסיר פסולת תאית באמצעות מסנן 0.22μm), ואחסנו בטמפרטורה של -80°C עד לריכוז.
5. ריכוז וטירינג של מניות ויראליות
   הערה: יש לסנן את הכדוריות ואת כמויות המדיה הגדולות שמקורן בתאים המכילים את החלקיקים הנגיפיים. בנוסף, יש לבצע בדיקת טיטר נגיפי כדי לקבוע את חוזק הנגיף כנגד התאים המארחים. לקבלת פרטים נוספים, ראה 6,7,8,15.
   1. הפשירו את אמצעי התרבות המכילים את הוויריונים.
   2. סובב את מדיה התרבות ב 72,000 × גרם במשך 2 שעות ב 4 ° C.
   3. דקרו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה הוויראלית עם התווך השיורי (~50 μL) ואחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש, ב~10 μL ויראלי.
   4. עבור titering, באמצעות תאי QT-6 או CEF, transfecate את התאים עם דילול סדרתי של מלאי ויראלי.
   5. לאחר המפגש, לתקן את התאים באמצעות 4% פורמלדהיד.
   6. Immunostain עבור חלבוני gag נגיפי או תהליך עבור phosphatase אלקליין היסטוכימית כדי לקבל את titer, מוגדר כמו (יחידות יוצרות מושבה) CFU למיליליטר (CFU/mL).

איור 2: מכשירים והתקנה למיקרו-הזרקה של עדשת אפרוח . (A) P-30 מושך מיקרופיפטה אנכי ידני. (1) כניסה המראה משיכה של מיקרופיפטה מזכוכית. (ב) (2) אינקובטור ביצים. לדגור על ביצת תרנגולת במשך ~ 65-68 שעות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס כדי להגיע לשלב 18 (עם לומן מרכזי אטום וריק) להזרקת רטרו-וירוס. (C) הגדרת מיקרו-הזרקה. (3) ציוד תאורה, (4) Pico-Injector, (5) מיקרוסקופ ניתוח, (6) מיקרומניפולטור Drummond, (7) מחשב/מצלמה להדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. מיקרו-הזרקה של עדשת צ'יק

1. הכנת אספקה
   1. הכנת מיקרופיפטות זכוכית למיקרו-הזרקה¹⁷
      הערה: נימי זכוכית משמשים לייצור מיקרופיפטות זכוכית עם נקודת קצה וקוטר חיצוני (OD) של ~ 11 מיקרומטר למיקרו-הזרקה. ההגדרה מוצגת באיור 2A.
      1. חבר את נימי זכוכית הבורוסיליקט לאטבים המרופדים בגומי במושך המיקרופיפטה האנכי הידני.
      2. כוונו את טמפרטורת החום (חום 1) ל-950°C ובצעו משיכה מקדימה לקבלת נימי זכוכית דקים ורכים יותר.
      3. הגדר את טמפרטורת החום (חום 2) ל 790 ° C ובצע משיכה משנית כדי לייצר מיקרופיפטות סופיות.
      4. בעזרת מטחנת מיקרופיפטה, מחדדים את פתח החוד ל-OD של ~11 מיקרומטר.
      5. לניסויים עתידיים, שמרו את מיקרופיפטות הזכוכית במשטח הידוק ספוג בתוך צנצנת זכוכית.
   2. דגירה של ביציות מופרות עד לשלב ההתפתחות 18
      הערה: במהלך התפתחות העדשה, ב~65-68 שעות של התפתחות עוברית, העדשה נפרדת מהאקטודרם ויוצרת שלפוחית אטומה עם לומן מרכזי; הזרקה לתוך עדשה ריקה זו לומן ראשונים לביטוי מוגבל לתאי עדשה שגשוג ^7,8,18.
      1. דגרו על ביצי תרנגולות מופרות במשך ~65-68 שעות באינקובטור נדנדה לח של 37°C (איור 2B).
2. פתיחת ביצת התרנגולת
   הערה: שלב זה מתאר את הזיהוי והחשיפה של העובר למיקרו-הזרקה. לקבלת פרטים נוספים, ראה ^7,8.
   1. נגבו היטב את אזור העבודה עם 70% אתנול.
   2. מוציאים את הביצים מהאינקובטור, מרססים אותן בכבדות באתנול 70% ונותנים להן להתייבש באוויר.
   3. מניחים את הביצה, כאשר הקצה הגדול יותר של הביצה פונה כלפי מעלה, על מחזיק ביצים.
   4. באמצעות זוג מלקחיים חדי שיניים, יוצרים חור בקוטר ~2 ס"מ בקצה הגדול יותר של הביצה על-ידי הקשה זהירה על קליפת הביצה והסרת שברים מקליפת הביצה (איור 3A).
   5. באמצעות מיקרוסקופ מנתח, אתר את העובר.
   6. לאחר איתור עדשת העובר והאפרוח, השתמשו במיקרוסקופ המנתח ובמלקחיים ובמספריים לניתוח עדין כדי לחתוך את קרום מי השפיר המכסה מיד את החלק העליון של העובר (איור 3B).
      הערה: אין לחתוך רחב מדי (רק מספיק כדי לחשוף את העובר ~ 0.5 ס"מ x 0.5 ס"מ), אחרת העוברים עלולים לשקוע לתוך מסת החלמון; כמו כן, הימנעו מלגעת בכלי הדם, במידת האפשר.
   7. מכסים את פתח הביצה בצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ כהכנה לשלבים הבאים.
3. מיקרו-הזרקה של מלאי ויראלי מרוכז
   הערה: חלקיקים נגיפיים המכילים מקטעי DNA של חלבון מטרה לצורך התמרה מוחדרים לתאים בתוך לומן העדשה. ההגדרה מוצגת באיור 2C. לקבלת פרטים נוספים, ראה ^6,7,8.
   1. הפשירו את מניות המניות הוויראליות על הקרח.
   2. להדמיה של המלאי הנגיפי במהלך ההזרקה, לדלל 1 μL של 10x ירוק מהיר לתוך בקבוקון אחד של מלאי ויראלי המכיל 10 μL.
   3. כדי להבטיח שאין גושים גדולים של חומר בלתי מומס שעלולים לסתום את מיקרופיפטת הזכוכית, צנטריפוגו את התמיסות למשך 10 שניות ב-10,000 × גרם ב-4°C כדי לפלוט "גושים גדולים" ולהעביר את הסופרנאטנטים לצינורות חדשים, כל זאת תוך שמירה על התמיסות על קרח.
   4. על צלחת תרבית בגודל 35 מ"מ x 10 מ"מ, מניחים פרפילם מעבדה מתוח ומוסיפים 1 μL של מלח סטרילי (PBS) על גבי הסרט (לא מעוקר, כאשר הצד המכוסה נחשב "נקי").
   5. חבר מיקרופיפט זכוכית מוכן למזרק פיקו אוטומטי.
   6. לחץ על מצב המילוי כדי למלא את המלח הסטרילי (PBS) לתוך מיקרופיפטה זכוכית, ולאחר מכן השתמש במצב הזרקה כדי לבדוק את 1 μL המוקצה של נוזל.
   7. הניחו פרפילם מעבדה מתוח שני על פני צלחת תרבית תאים חדשה בגודל 35 מ"מ x 10 מ"מ והוסיפו 1 μL של מלאי נגיפים מוכתמים בירוק מהיר על גבי הסרט.
   8. הורידו את קצה המיקרופיפטה למלאי הנגיפי ולחצו על דגם המילוי כדי למלא את מיקרופיפטת הזכוכית ב~1 μL של מלאי נגיפי.
      הערה: כדי למנוע התייבשות, שים את קצה המיקרופיפטה המלאה במי מלח סטריליים (PBS) בכל פעם שיש הפסקה בהליך.
   9. הורידו את מיקרופיפטת הזכוכית המלאה, המחוברת למזרק אוטומטי, לאזור המטרה של לומן עדשת העובר בעזרת מיקרוסקופ מנתח.
   10. כוונן את מקור האור כדי להבטיח הדמיה ברורה של קווי המתאר של שלפוחית העדשה.
       הערה: לומן העדשה הימנית (פונה כלפי מעלה) משמש בדרך כלל להזרקה והשמאלית (פונה כלפי מטה) נשמרת שלמה כבקרה נגדית.
   11. ברגע שאתם בטוחים שמיקום המיקרופיפטה נמצא במיקום הנכון בתוך לומן העדשה, הזריקו 5-40 nL של הזן הנגיפי (איור 3C).
       הערה: תרגול הוא הכרחי מאוד עבור מיקום הזרקה אופטימלי.
   12. המתן ~ 45 שניות ולאחר מכן הסר בעדינות את מיקרופיפטת הזכוכית.
   13. בדוק את המיקרו-הזרקה המוצלחת לתוך לומן העדשה באמצעות המיקרוסקופ המנתח על ידי בדיקת צבע ירוק מהיר שאמור להישאר בלומן הריק של העדשה ללא כל דליפה.
   14. לאחר הליך ההזרקה, אוטמים את פתח קליפת הביצה בסרט סקוטש.
   15. יש להחזיר את העובר לאינקובטור הלח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ללא כל תנועה סיבובית, עד להגעה לגיל העוברי הרצוי לדיסקציה של העדשה.

איור 3: הכנת אפרוח במיקרו-הזרקה וסכמטית . (א) פתיחת ביצת תרנגולת. (B) חיתוך קרום מי השפיר. (C) סכימת מיקרו-הזרקה של עדשת עוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות

לאחר קביעת חלבון מטרה ספציפי וזיהוי רצפי הגנים הקשורים, הגישה הניסויית הכוללת כוללת שיבוט של רצפי הגן לווקטור RCAS(A) רטרו-ויראלי על ידי השיבוט הראשוני לווקטור מתאם, ואחריו וקטור נגיפי. שנית, חלקיקים נגיפיים בעלי טיטר גבוה מוכנים באמצעות תאי אריזה כדי לקצור ולרכז את הנגיפים. שני הצעדים העיקר?...

Discussion

מודל ניסיוני זה מציע הזדמנות לבטא את העניין של החלבונים בעדשה השלמה, מה שמוביל לחקר הרלוונטיות התפקודית של חלבונים אלה במבנה העדשה ובתפקודה. מודל המיקרו-הזרקה של אפרוח עוברי מבוסס בחלקו על עבודתו של Fekete et. ^al.6 ופותח עוד יותר על ידי Jiang et. ^al.8 ושימש כאמצעי להחדרת פלסמ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Filter	Corning	431118	For removing cellular debris from media
35 mm x 10 mm Culture Dish	FisherScientific	50-202-030	For using during microinjection
Centrifuge	Fisherbrand	13-100-676	Spinning down solution
Constructs	GENEWIZ	-	For generation of constructs
Dissecting microscope	AmScope	SM-4TZ-144A	Visualization of lens for microinjection
DNA PCR primers	Integrated DNA Technologies	-	Generation of primers: Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were  obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively
Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter Injector	Drummond Scientific	3-000-204	Microinjection Pipet
Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator	AmScope	LED-50WY	Lighting for visualization
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen		For cell culture
Egg Holder	-	-	Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height
Egg Incubator	GQF Manufacturing Company Inc.	1502	For incubation of fertilized eggs
Fast Green	Fisher scientific	F99-10	For visualization of viral stock injection
Fertilized white leghorn chicken eggs	Texas A&M University	N/A	Animal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone Laboratories		For cell culture
Fluorescein-conjugated anti-mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-095-003	For anti-FLAG  1:500
Forceps	FisherScientific	22-327379	For moving things around and isolation
Glass capillaries	Sutter Instruments	B100-75-10	Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length)
Lipofectamine	Invitrogen	L3000001	For transfection
Manual vertical micropipette puller	Sutter Instruments	P-30	To obtain glass micropipette of the correct size
Microcentrifuge Tubes	FisherScientific	02-682-004	Dissolving solution
Microscope	Keyence	BZ-X710	For imaging staining
Parafilm	FisherScientific	03-448-254	Placing solution
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen		For cell culture
Pico-Injector	Harvard Apparatus	PLI-100	For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time
rabbit anti-chick AQP0	Self generated	-	Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363.
rabbit anti-FLAG antibody	Rockland Immunichemicals	600-401-383	For staining FLAG
Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	111-295-003	For anti-AQP0  1:500
Sponge clamping pad	Sutter Instruments	BX10	For storage of glass micropipette