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요약

이 프로토콜 논문은 렌즈 발달 중 단백질의 in situ 기능 및 발현을 연구하기 위한 도구로서 RCAS(A) 레트로바이러스의 배아 닭 수정체 미세 주입 방법론을 설명합니다.

초록

배아 닭(Gallus domesticus)은 인간의 수정체와 높은 수준의 유사성을 감안할 때 수정체 발달 및 생리학 연구를 위한 잘 확립된 동물 모델입니다. RCAS(A)는 분열하는 세포를 감염시키는 복제가 가능한 닭 레트로바이러스로, 초기 발달 단계에서 수정체 소포의 빈 내강에 미세 주입하여 수정체 발달 중 야생형 및 돌연변이 단백질의 in situ 발현 및 기능을 연구하는 강력한 도구 역할을 합니다. 형질전환 모델 및 체외 배양과 같은 다른 접근법과 비교했을 때, RCAS(A) 복제가 가능한 조류 레트로바이러스를 사용하면 병아리 배아에서 외 인성 단백질을 발현하는 매우 효과적이고 신속하며 맞춤형 시스템을 제공할 수 있습니다. 특히, 표적 유전자 전달은 조직 특이적 프로모터(tissue-specific promoter) 없이 증식성 수정체 섬유 세포(proliferative lens fiber cell)로 제한될 수 있습니다. 이 글에서는 재조합 레트로바이러스 RCAS(A) 제제에 필요한 단계를 간략하게 살펴보고, 미세주입 절차에 대한 상세하고 포괄적인 개요를 제공하며, 이 기법의 샘플 결과를 제공합니다.

서문

이 프로토콜의 목표는 RCAS(A)(복제 가능한 조류 육종/백혈병 레트로바이러스 A)의 배아 닭 렌즈 미세 주입 방법론을 설명하는 것입니다. 배아 닭 수정체에서 효과적인 레트로바이러스 전달은 정상 수정체 생리학, 병리학적 조건 및 발달에서 수정체 단백질의 분자 메커니즘 및 구조-기능에 대한 생체 내 연구를 위한 유망한 도구임이 입증되었습니다. 또한, 이 실험 모델은 인간 선천성 백내장과 같은 질환에 대한 치료 표적 식별 및 약물 스크리닝에 사용될 수 있습니다. 전체적으로, 이 프로토콜은 수정체 단백질 연구를 위한 맞춤형 플랫폼 개발에 필요한 단계를 제시하는 것을 목표로 합니다.

배아 병아리(Gallus domesticus)는 수정체 구조와 기능이 인간의 수정체와 유사하기 때문에 수정체 발달 및 생리학 연구를 위한 잘 확립된 동물 모델입니다 1,2,3,4. RCAS(A) 복제가 가능한 조류 레트로바이러스의 사용은 병아리 배아에서 외인성 단백질을 발현하는 매우 효과적이고 신속하며 맞춤형 시스템으로 간주되어 왔습니다. 특히, 빈 수정체 내강의 존재가 증식성 수정체 섬유 세포 내에서 외인성 단백질의 발현을 위해 제한된 부위에 제자리 RCAS(A) 미세주입을 허용하는 고유한 배아 발달 시간 프레임을 사용하여 조직 특이적 프로모터를 필요 없이 증식성 수정체 섬유 세포로 표적 유전자 전달을 제한하는 고유한 능력을 가지고있습니다 5, 6,7,8 참조.

여기에 자세히 설명된 병아리 배아 미세 주입 절차는 원래 부분적으로 Fekete et의 작업을 기반으로 합니다. al.6 및 Jiang et. al.8 및 배아 병아리 1,9,10,11,12,13의 수정체에 바이러스 및 비바이러스 플라스미드를 모두 도입하는 수단으로 활용되었습니다. 전반적으로, 이전 연구는 수정체 발달, 분화, 세포 통신 및 질병 진행을 연구하고 백내장과 같은 수정체 병리학적 상태에 대한 치료 표적을 발견하고 테스트하기 위해 이 방법론을 활용할 수 있는 잠재력을 보여줍니다.

프로토콜

본 연구는 동물복지법 및 동물복지 시행 규정의 '실험동물 관리 및 이용 지침서'의 원칙에 따라 수행되었다. 모든 동물 시술은 샌안토니오에 있는 텍사스 대학교 보건 과학 센터의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 프로토콜에 대한 개요는 그림 1을 참조하십시오. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 시약 및 기기에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

figure-protocol-352
그림 1: 실험 개요. 1 . 프로토콜의 첫 번째 단계는 특정 표적 단백질의 결정, 관련 유전자 서열의 식별 및 DNA 단편 생성입니다. 2 . 접합기 벡터로의 초기 클로닝에 의한 레트로바이러스 벡터로의 유전자 서열 클로닝, 3. 바이러스 벡터에 뒤따름 . 4 . 패키징 셀을 사용하여 수확 및 농축하는 고역가 바이러스 입자의 준비. 5 . 이 프로토콜의 마지막 단계이자 초점은 RCAS(A) 바이러스 입자를 렌즈 내강에 미세주입하는 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 고역가 재조합 레트로바이러스의 제조

  1. 표적 단백질 DNA 단편을 만들기 위한 중합효소연쇄반응(PCR)
    NOTE: 이 섹션은 표적 수정체 단백질에 해당하는 DNA 염기서열을 증폭하는 것을 목표로 합니다. 자세한 내용은 7,8을 참조하십시오.
    1. 관심 단백질에 해당하는 PCR용 프라이머를 설계하고, FLAG 에피토프 서열(5'-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3'), 정지 코돈 및 CLa12NCO의 폴리링커 영역 내부에 존재하는 제한 효소 부위(즉, EcoRI)를 포함하거나 포함하지 않고 카르복실 말단-프레임 내 DNA 단편을 적절한 제한 효소에 대한 서열과 함께 이전에 발표된 프로토콜에 기재된 사양에 따라 1, 7,8,10,11입니다.
    2. PCR 반응10을 수행합니다. 설계된 프라이머의 센스 및 안티센스 100pmol을 0.5μg의 커넥신 cDNA(예: Cx50, Cx43 또는 키메라 Cx50*43L 조합)와 결합하여 선택한 PCR 반응 완충액에 결합합니다. 94°C에서 1분, 58°C에서 1분, 72°C에서 각각 1분으로 구성된 30사이클을 수행한 다음 10°C에서 72분 동안 최종 연장을 수행합니다.
    3. 겔 정제 키트로 PCR 산물을 분리하고 정제합니다.
    4. 정제된 PCR 산물을 제조사의 지침에 따라 선택한 제한 효소를 사용하여 분해합니다.
  2. 어댑터 플라스미드에 DNA 삽입물 클로닝
    참고: DNA 단편을 어댑터 벡터에 삽입하면 RCAS(A) 벡터 안정성을 증가시키기 위해 도우미 세포/바이러스가 필요하지 않습니다14. 자세한 내용은 7,8을 참조하십시오.
    1. Subclone DNA 단편을 끈적 끈적한 말단 연결 반응을 사용하여 어댑터 플라스미드, Cla12NCO로 만듭니다. PCR 단편을 제한효소 및 Cla12NCO와 2-5:1 비율로 혼합합니다. 유능한 세포를 사용하여 결찰 및 DNA 형질전환을 수행합니다.
    2. DNA 분리 키트를 사용하여 DNA를 분리합니다.
    3. 정확성을 보장하기 위해 DNA 염기서열을 분석합니다.
  3. RCAS(A) 바이러스 벡터로 클로닝
    참고: DNA 단편은 발달 중인 병아리 배아14,15의 세포로 유전자의 안정적인 형질도입을 위해 차량(RCAS(A) 레트로바이러스)에 삽입됩니다. 자세한 내용은 7,8,15를 참조하십시오.
    1. 관심 함유 벡터의 Cla12NCO-DNA 단편을 ClaI(DNA 1μg당 1단위)으로 절단하고 단편을 겔 분리합니다.
    2. DNA 단편을 ClaI-선형화된 RCAS(A) 플라스미드로 서브클로닝합니다. 제한효소 SalI을 사용하여 RCAS(A) 플라스미드의 ClaI 부위를 구별합니다.
    3. ClaI 및 SalI 제한 효소를 사용한 분해에 의해 작제물에 삽입된 단편의 올바른 방향을 확인합니다.
    4. DNA 분리 키트를 사용하여 DNA를 분리합니다.
    5. DNA 농도를 결정합니다.
  4. 병아리 배아 섬유아세포(CEF) 세포의 형질주입 및 RCAS(A) 수확
    참고: 바이러스 패키징 셀(CEF)은 바이러스 입자15,16을 포함하는 세포 배양 배지를 얻거나 수확하는 데 사용됩니다. 자세한 내용은 7,8,15를 참조하십시오.
    1. 제조업체의 지침에 따라 transfection제를 사용하여 재조합 레트로바이러스 DNA 구조체로 CEF 세포를 transfection합니다.
    2. transfection된 세포의 western blotting을 수행하여 관심 단백질의 발현을 검사합니다.
    3. transfection된 세포가 밀도에 도달하면 상층액 배지를 수집하여 적절하게 처리/여과하고(0.22μm 필터를 사용하여 세포 파편을 제거하기 위해) 농축할 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관합니다.
  5. 바이러스 주식의 농도 및 적정
    참고: 바이러스 입자가 포함된 세포에서 파생된 펠릿 및 대량의 배지는 여과해야 합니다. 또한 숙주 세포에 대한 바이러스의 강도를 확인하기 위해 바이러스 역가 분석을 수행해야 합니다. 자세한 내용은 6,7,8,15를 참조하십시오.
    1. 비리온이 들어있는 배양 배지를 해동합니다.
    2. 72,000× g 의 배양 배지를 4°C에서 2시간 동안 회전시킵니다.
    3. 상층액을 디캔팅하고 바이러스 펠릿을 잔류(~50μL) 배지로 재현탁시키고 사용할 때까지 -80°C에서 ~10μL 바이러스 스톡에 보관합니다.
    4. 역가를 위해 QT-6 또는 CEF 세포를 사용하여 바이러스 스톡을 연속적으로 희석하여 세포를 transfection합니다.
    5. 합류 후 4% 포름알데히드를 사용하여 세포를 고정합니다.
    6. 바이러스 개그 단백질에 대한 면역염색 또는 알칼리성 인산가수분해효소를 조직화학적으로 처리하여 역가를 얻고, 밀리리터당 (콜로니 형성 단위) CFU(CFU/mL)로 정의됩니다.

figure-protocol-4393
그림 2: chick lens microinjection을 위한 기기 및 설정 . (A) P-30 수동 수직 미세 전극 마이크로 피펫 풀러. (1) 유리 마이크로피펫을 당기는 모습을 보여주는 삽입물. (B) (2) 계란 부화기. 65°C 인큐베이터에서 ~68-37시간 동안 닭고기 달걀을 배양하여 레트로바이러스 주입을 위해 18단계(밀봉되고 빈 중앙 내강 포함)에 도달합니다. (C) 미세 주입 설정. (3) 조명 장비, (4) 피코 인젝터, (5) 해부 현미경, (6) 드러먼드 마이크로 매니퓰레이터, (7) 시각화용 컴퓨터/카메라. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 병아리 렌즈 미세주입

  1. 소모품 준비
    1. 미세주입을 위한 유리 마이크로피펫의 제조17
      참고: 유리 모세관은 미세주입을 위해 팁 포인트와 외경(OD)이 ~11μm인 유리 마이크로피펫을 만드는 데 사용됩니다. 설정은 그림 2A에 나와 있습니다.
      1. 붕규산 유리 모세관을 수동 수직 마이크로피펫 풀러의 고무 완충 클립에 부착합니다.
      2. 가열 온도(HEAT 1)를 950°C로 설정하고 프리풀링을 수행하여 더 얇고 부드러운 유리 모세관을 얻습니다.
      3. 가열 온도(HEAT 2)를 790°C로 설정하고 2차 당김을 수행하여 최종 마이크로피펫을 생성합니다.
      4. 마이크로피펫 그라인더를 사용하여 팁 개구부를 ~11μm의 OD로 날카롭게 합니다.
      5. 향후 실험을 위해 유리 마이크로피펫을 유리병 안의 스폰지 클램핑 패드에 보관하십시오.
    2. 발달 단계까지 수정란의 부화 18
      참고: 수정체 발달 중 배아 발달 ~65-68시간에 수정체는 외배엽에서 분리되어 중앙 내강이 있는 밀봉된 소포를 형성합니다. 이 빈 수정체에 주입하면 증식성 수정체 세포에 대한 발현이 제한되는 루멘 프라임이 7,8,18.
      1. 65°C 가습 로킹 인큐베이터에서 ~68-37시간 동안 수정된 닭고기 계란을 배양합니다(그림 2B).
  2. 닭고기 달걀 개봉
    알림: 이 단계에서는 미세 주입을 위한 배아의 식별 및 노출에 대해 설명합니다. 자세한 내용은 7,8을 참조하십시오.
    1. 70% 에탄올로 작업 영역을 철저히 닦으십시오.
    2. 인큐베이터에서 계란을 꺼내 70% 에탄올을 강하게 뿌린 다음 자연 건조시킵니다.
    3. 달걀의 큰 쪽 끝이 위를 향하도록 달걀을 달걀 홀더에 놓습니다.
    4. 한 쌍의 날카로운 이빨이 있는 집게를 사용하여 달걀 껍질을 조심스럽게 두드리고 달걀 껍질 조각을 제거하여 달걀의 더 큰 쪽 끝에 ~2cm 직경의 구멍을 만듭니다(그림 3A).
    5. 해부 현미경을 사용하여 배아를 찾습니다.
    6. 배아와 병아리 수정체를 찾으면 해부 현미경과 미세 해부 겸자 및 가위를 사용하여 배아 상단을 바로 덮고 있는 양막을 잘라냅니다(그림 3B).
      알림: 너무 넓게 자르지 마십시오(배아가 ~0.5cm x 0.5cm가 노출될 정도만) 그렇지 않으면 배아가 난황 덩어리 속으로 가라앉을 수 있습니다. 또한 가능하면 혈관을 만지지 마십시오.
    7. 다음 단계를 준비하기 위해 60mm 페트리 접시로 달걀 입구를 덮습니다.
  3. 농축된 바이러스 스톡의 미세 주입
    참고: transduction을 위한 표적 단백질 DNA 단편을 포함하는 바이러스 입자는 렌즈 내강 내부의 세포에 삽입됩니다. 설정은 그림 2C에 나와 있습니다. 자세한 내용은 6,7,8을 참조하십시오.
    1. 바이러스 성 주식 주식을 얼음 위에서 해동하십시오.
    2. 주입 중 바이러스 스톡을 시각화하기 위해 10x Fast green 1μL를 10μL가 포함된 바이러스 스톡 바이알 1개에 희석합니다.
    3. 유리 마이크로피펫을 막을 수 있는 용해되지 않은 물질의 큰 덩어리가 없도록 하려면 용액을 얼음 위에 유지하면서 4°C에서 10,000× g 에서 10초 동안 원심분리하여 "큰 덩어리"를 펠릿화하고 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.
    4. 35mm x 10mm 배양 접시에 늘어난 실험실 파라필름을 놓고 필름 위에 1μL의 멸균 식염수(PBS)를 추가합니다(멸균되지 않음, 덮인 면이 "깨끗한" 것으로 간주됨).
    5. 준비된 유리 마이크로피펫을 자동 피코 주입기에 연결합니다.
    6. 충전 모드를 눌러 멸균 식염수(PBS)를 유리 마이크로피펫에 채운 다음 주입 모드를 사용하여 할당된 1μL의 액체를 테스트합니다.
    7. 새로운 35mm x 10mm 세포 배양 접시의 표면에 두 번째 늘어난 실험실 파라필름을 놓고 필름 위에 1μL의 Fast green-stained viral stock을 추가합니다.
    8. 마이크로피펫의 끝을 바이러스 스톡으로 내리고 충전 모델을 눌러 유리 마이크로피펫에 ~1μL의 바이러스 스톡을 채웁니다.
      알림: 건조를 방지하려면 절차가 일시 중지될 때마다 채워진 마이크로피펫의 끝을 멸균 식염수(PBS)에 넣으십시오.
    9. 자동 주입기에 연결된 충전된 유리 마이크로피펫을 해부 현미경의 도움을 받아 배아 수정체 내강의 대상 영역으로 내립니다.
    10. 렌즈 소포의 윤곽을 명확하게 시각화할 수 있도록 광원을 조정합니다.
      알림: 오른쪽 렌즈의 루멘(위를 향함)은 일반적으로 주입에 사용되며 왼쪽(아래를 향함)은 반대측 대조군으로 그대로 유지됩니다.
    11. 마이크로피펫의 위치가 렌즈 내강 내부의 올바른 위치에 있는지 확인한 후 5-40nL의 바이러스 스톡을 주입합니다(그림 3C).
      알림: 최적의 주입 배치를 위해서는 연습이 매우 필요합니다.
    12. ~45초 동안 기다린 다음 유리 마이크로피펫을 부드럽게 제거합니다.
    13. 누출 없이 렌즈의 빈 루멘에 남아 있어야 하는 Fast Green 염료를 검사하여 해부 현미경을 사용하여 렌즈 루멘에 성공적으로 미세 주입되었는지 확인합니다.
    14. 주입 절차 후 달걀 껍질 입구를 스카치 테이프로 밀봉합니다.
    15. 수정체 박리를 위해 원하는 배아 연령에 도달할 때까지 회전 동작 없이 배아를 37°C 가습 인큐베이터로 되돌립니다.

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그림 3: 미세주입 병아리 준비 및 개략도 . (A) 닭고기 달걀 열기. (B) 양막의 절단. (C) 치킨 렌즈 루멘 미세주입 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

특정 표적 단백질을 결정하고 관련 유전자 서열을 식별한 후, 전반적인 실험 접근법은 어댑터 벡터로의 초기 클로닝에 의해 유전자 서열을 레트로바이러스 RCAS(A) 벡터로 클로닝한 후 바이러스 벡터를 클로닝하는 것을 포함합니다. 둘째, 고역가 바이러스 입자는 비리온을 채취하고 농축하기 위해 포장 세포를 사용하여 준비됩니다. 이 처음 두 가지 주요 단계는 대체로 설명되었으며 대표적인 결과...

토론

이 실험 모델은 온전한 수정체에서 관심 있는 단백질을 발현할 수 있는 기회를 제공하여 렌즈 구조 및 기능에서 이러한 단백질의 기능적 관련성을 연구할 수 있습니다. 배아 병아리 미세주입 모델은 부분적으로 Fekete 등의 연구를 기반으로 합니다. al.6 및 Jiang et에 의해 더욱 개발되었습니다. al.8 및 바이러스 플라스미드 및 작용제, 작은 간섭 RNA(siRNA) 및 펩타이?...

공개

저자는 이 연구가 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 수행되었음을 선언합니다.

감사의 말

이 연구는 미국 국립보건원(NIH) 보조금: RO1 EY012085(J.X.J) 및 F32DK134051(F.M.A.)와 웰치 재단 보조금: AQ-1507(J.X.J.)의 지원을 받았습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 피규어는 부분적으로 Biorender.com 로 만들어졌습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm FilterCorning431118For removing cellular debris from media
35 mm x 10 mm Culture DishFisherScientific50-202-030For using during microinjection
CentrifugeFisherbrand13-100-676Spinning down solution
ConstructsGENEWIZ-For generation of constructs
Dissecting microscopeAmScopeSM-4TZ-144AVisualization of lens for microinjection
DNA PCR primersIntegrated DNA Technologies-Generation of primers:

Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC

ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were  obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively

Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC

ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively
Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter InjectorDrummond Scientific3-000-204Microinjection Pipet
Dual Gooseneck Lights Microscope IlluminatorAmScopeLED-50WYLighting for visualization
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)InvitrogenFor cell culture
Egg Holder--Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height
Egg IncubatorGQF Manufacturing Company Inc.1502For incubation of fertilized eggs
Fast GreenFisher scientificF99-10For visualization of viral stock injection
Fertilized white leghorn chicken eggsTexas A&M UniversityN/AAnimal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)
Fetal Bovine Serum (FBS)Hyclone LaboratoriesFor cell culture
Fluorescein-conjugated anti-mouse IgGJackson ImmunoResearch115-095-003For anti-FLAG  1:500
ForcepsFisherScientific22-327379For moving things around and isolation
Glass capillariesSutter InstrumentsB100-75-10Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length)
LipofectamineInvitrogenL3000001For transfection
Manual vertical micropipette pullerSutter InstrumentsP-30To obtain glass micropipette of the correct size
Microcentrifuge TubesFisherScientific02-682-004Dissolving solution
MicroscopeKeyenceBZ-X710For imaging staining
ParafilmFisherScientific03-448-254Placing solution
Penicillin/StreptomycinInvitrogenFor cell culture
Pico-InjectorHarvard ApparatusPLI-100For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time
rabbit anti-chick AQP0Self generated-Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363.
rabbit anti-FLAG antibodyRockland Immunichemicals600-401-383For staining FLAG
Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch111-295-003For anti-AQP0  1:500
Sponge clamping padSutter InstrumentsBX10For storage of glass micropipette

참고문헌

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