הקלטות חוץ-תאיות כפולות בהיפוקמפוס העכבר ובקליפת המוח הקדם-מצחית

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במכשיר הקלטה מותאם אישית ובאלקטרודות כדי להקליט פוטנציאלים של שדות מקומיים ולחקור את זרימת המידע בהיפוקמפוס העכבר ובקליפת המוח הקדם-מצחית.

Abstract

הטכניקה של רישום פוטנציאלי שדה מקומי (LFPs) היא שיטה אלקטרופיזיולוגית המשמשת למדידת הפעילות החשמלית של אוכלוסיות נוירונים מקומיות. הוא משמש ככלי חיוני במחקר קוגניטיבי, במיוחד באזורים במוח כמו ההיפוקמפוס וקליפת המוח הקדם-מצחית. הקלטות LFP כפולות בין אזורים אלה מעניינות במיוחד מכיוון שהן מאפשרות לחקור תקשורת אותות בין-אזורית. עם זאת, שיטות לביצוע הקלטות אלה מתוארות רק לעתים רחוקות, ורוב מכשירי ההקלטה המסחריים יקרים או חסרי יכולת הסתגלות כדי להתאים לעיצובים ניסיוניים ספציפיים. מחקר זה מציג פרוטוקול מקיף לביצוע רישומי LFP כפולי אלקטרודות בהיפוקמפוס העכבר ובקליפת המוח הקדם-מצחית כדי לחקור את ההשפעות של תרופות אנטי-פסיכוטיות ומודולטורים של תעלות אשלגן על תכונות LFP באזורים אלה. הטכניקה מאפשרת מדידה של תכונות LFP, כולל ספקטרום כוח בתוך כל אזור במוח וקוהרנטיות בין השניים. בנוסף, פותח מכשיר הקלטה בעלות נמוכה ומותאם אישית עבור ניסויים אלה. לסיכום, פרוטוקול זה מספק אמצעי להקליט אותות עם יחסי אות לרעש גבוהים באזורים שונים במוח, מה שמקל על חקירת תקשורת מידע בין-אזורית בתוך המוח.

Introduction

פוטנציאלי שדה מקומיים (LFPs) מתייחסים לפעילות החשמלית שנרשמה מהמרחב החוץ-תאי, ומשקפים את הפעילות הקולקטיבית של קבוצה מקומית של נוירונים. הם מציגים מגוון רחב של תדרים, החל מגלים איטיים ב-1 הרץ ועד תנודות מהירות ב-100 הרץ או 200 הרץ. פסי תדרים ספציפיים נקשרו לתפקודים קוגניטיביים כגון למידה, זיכרון וקבלת החלטות ^1,2. שינויים בתכונות LFP שימשו כסמנים ביולוגיים להפרעות נוירולוגיות שונות, כולל דמנציה וסכיזופרניה ^3,4. ניתוח הקלטות LFP יכול להציע תובנות חשובות לגבי המנגנונים הפתולוגיים הבסיסיים הקשורים למצבים אלה ואסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות.

רישום LFP כפול הוא טכניקה המשמשת למדידת פעילות חשמלית מקומית בתוך ובין שני אזורי מוח ספציפיים. טכניקה זו מספקת הזדמנות רבת ערך לחקור את הדינמיקה העצבית המורכבת ואת תקשורת האותות המתרחשת בתוך ובין אזורי מוח שונים. מחקרים קודמים גילו כי זיהוי שינויים בתכונות העצביות של אזורי מוח בודדים יכול להיות מורכב, אך שינויים בתקשורת קליפת המוח הבין-אזורית ניתן לראות ^5,6. לכן, השימוש בהקלטת LFP כפולה מציע אמצעי רב עוצמה לטיפול בבעיה זו.

קישוריות היפוקמפוסית-קדם-מצחית ממלאת תפקיד מכריע בוויסות תפקודים קוגניטיביים, ותפקוד לקוי נקשר להפרעות נוירולוגיות שונות ^7,8. הקלטות אלקטרודות כפולות של אזורים אלה יכולות לספק מידע על אינטראקציות אלה. למרבה הצער, קיים מידע מוגבל זמין על שיטות לביצוע רישומי אלקטרודה כפולה LFP בין אזורים אלה. יתר על כן, מכשירי הקלטה הזמינים מסחרית הם בדרך כלל יקרים וחסרי יכולת הסתגלות לעיצובים ניסיוניים ספציפיים. השיטה המקובלת להקלטת LFPs כוללת שימוש בכבל מסוכך לחיבור מכשיר ההקלטה לאלקטרודות שהושתלו במוחו של בעל חיים. עם זאת, גישה זו רגישה לתנועה ולרעשים סביבתיים, ומשפיעה על האיכות והאמינות של האותות המוקלטים.

פרוטוקול זה מתאר הליך מקיף לביצוע הקלטות LFP כפולות אלקטרודות בהיפוקמפוס העכבר ובקליפת המוח הקדם-מצחית, באמצעות במת ראש מותאמת אישית בעלות נמוכה שניתן להניח על ראשה של החיה. שיטות אלה מאפשרות לחוקרים לחקור דפוסי תנודה ספציפיים לאזור בתוך שני אזורים מוחיים נפרדים ולחקור חילופי מידע בין-אזוריים וקישוריות בין אזורים אלה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים פלורי (אוניברסיטת מלבורן, מס '22-025UM) בהתאם לקוד האוסטרלי לטיפול ושימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות. C57BL/6 עכברים זכרים (8 שבועות), שהתקבלו ממרכז משאבי בעלי חיים (אוסטרליה), שימשו במחקר הנוכחי.

1. עיצוב וייצור במת ראש

הערה: לוח המעגלים המודפסים של שלב הראש הוא לוח ארבע שכבות קומפקטי בגודל 14 מ"מ x 12 מ"מ המיועד להצבה ישירות על ראש החיה. הוא משתמש בשבב מגבר מסחרי (ראה טבלת חומרים), וכל קבצי העיצוב ו- Gerber זמינים באינטרנט (קישור GitHub: https://github.com/dechuansun/Intan-headstage/tree/main/pcbway).

1. ספק את המפרטים הבאים ליצרן: עובי לוח: 0.6 מ"מ; מעקב/ריווח מינימלי: 4 מיל; גודל חור מינימלי: 0.2 מ"מ.
2. במהלך תהליך הרכבת המעגלים המודפסים, בצע את הסדר הבא:
   1. הלחמת את שבב המגבר על הלוח באמצעות אקדח אוויר חם להגדיר ב 350 ° C.
   2. לרתך את הרכיבים הפסיביים.
   3. הלחמת את מחבר SPI ואת מחבר האלקטרודה (ראה טבלת חומרים).
3. בדקו את ההלחמה תחת מיקרוסקופ להבטחת איכות. אבטח את מחבר SPI במקומו באמצעות אפוקסי ליציבות נוספת.
4. השתמש בתוכנת הקלטה של צד שלישי ובלוח בקרה (ראה טבלת חומרים) לרכישת אותות. עיין במדריך למשתמש של התוכנה לקבלת הוראות מפורטות.
5. במת הראש המעוצבת תומכת ב-8 ערוצים. בתוכנה, הפעל את ערוצים 8, 9, 12, 13, 20, 21, 22 ו- 23 להקלטה.

2. ייצור אלקטרודות

1. חתכו חוטי טונגסטן מצופים PFA (ראו טבלת חומרים) לאורכים ספציפיים עבור סוגי אלקטרודות שונים: אלקטרודת קליפת המוח הקדם-מצחית (12 מ"מ), אלקטרודת היפוקמפוס (10 מ"מ) ואלקטרודת הארקה (6 מ"מ).
2. חותכים את צינור הפליז (ראו טבלת חומרים) למקטעים בקוטר 3 מ"מ.
3. הסירו 2 מ"מ מהציפוי בקצה כל חוט באמצעות מצית, ולאחר מכן הלחכו היטב את חוט האלקטרודה לצינור הפליז. לצינור הפליז קוטר פנימי של 0.45 מ"מ וקוטר חיצוני של 0.60 מ"מ.
4. עבור אלקטרודת הארקה, הלחמת בורג נירוסטה M1.2 (ראה טבלת חומרים) לאלקטרודה. יש למרוח שטף על בסיס חומצה זרחתית על הבורג כדי לשפר את ההלחמה. לאחר ההלחמה, נקו את הבורג באמצעות אלכוהול.
   הערה: יש ללבוש כפפות להגנה במהלך תהליך ההלחמה.

3. הליך כירורגי

1. מרדימים את העכבר בתא הרדמה עם 3% איזופלורן וזרימת חמצן של ליטר אחד לדקה.
2. הניחו את העכבר המורדם על כרית חימום ואבטחו אותו במסגרת סטריאוטקסית (ראו טבלת חומרים).
3. התאם את קצב התחזוקה של איזופלורן ל 2.5-3% והפחת את זרימת החמצן ל -500 מ"ל / דקה. באמצעות צביטת הבוהן, ודא אם בעל החיים עדיין תחת הרדמה עמוקה.
4. תת עורית להזריק carprofen ב 0.5 מ"ג / ק"ג ולמרוח משחת עיניים להגנה על העין.
5. לגלח ולעקר את ראש העכבר באמצעות פובידון-יוד ו 80% אתנול.
6. בצע חתך 8 מ"מ לאורך קו האמצע של הקרקפת, הסרת רקמת חיבור באזור החתך.
7. החל מי חמצן כדי לנקות את פני השטח של הגולגולת, להיות זהיר לא לגעת בעור שמסביב.
8. יישרו את ציוני הדרך של ברגמה ולמבדה לאותה רמה לקבלת מיקום אלקטרודות מדויק (ברגמה ולמבדה הם המקום שבו התפר הסגיטלי מצטלב בין התפרים הקורונליים והלמבדואידים).
9. חורי קידוח עבור אלקטרודת ייחוס/הארקה, ברגי עיגון (בור קידוח 0.9 מ"מ) ואלקטרודות פעילות (בור קידוח 0.3 מ"מ) בקואורדינטות שצוינו.
10. חבר את האלקטרודה המותאמת אישית (שלב 2) לזרוע המסגרת הסטריאוטקסית וודא שהיא ניצבת למוח.
11. השתיל את האלקטרודה באזור CA1 בהיפוקמפוס (AP - 1.8 מ"מ, ML - 1.3 מ"מ, DV - 1.4 מ"מ).
    הערה: AP, anteroposterior; ML, בינוני; DV, dorsoventral.
12. השתלת אלקטרודות חוזרת בקליפת המוח הקדם-מצחית (AP - 2.0 מ"מ, ML - 0.3 מ"מ, DV - 1.7 מ"מ).
13. אבטחו אלקטרודות עם דבק עוצמתי ומלט דנטלי זמין מסחרית (ראו טבלת חומרים).
14. השתל שני ברגי עיגון בקוטר 1.2 מ"מ (AP - 1.8 מ"מ, ML -1.6 מ"מ) למניעת תזוזה.
15. מקם את אלקטרודת הייחוס/הארקה במגע ישיר עם הדורה מאטר, 2 מ"מ אחורי ו-2 מ"מ חד צדדי לנקודת ציון הלמדא.
16. חבר את צד צינור הפליז של האלקטרודות למחבר שקע רב-ערוצי (ראה טבלת חומרים) עם אלקטרודת הארקה באמצע.
17. השתמש בצינורות כיווץ חום 0.8 מ"מ בחלק החיצוני של הסיכה האמצעית לבידוד.
18. אבטח את האלקטרודות, ברגי העוגן והמחבר באמצעות דבק וצמנט דנטלי.

4. טיפול לאחר הניתוח

1. כדי להקל על כאבים לאחר הניתוח, יש להזריק קרפרופן במינון של 5-10 מ"ג/ק"ג תת עורית כל 12-24 שעות בהתבסס על הערכת כאב לתקופה של שלושה ימים.
2. ספק לבעל החיים תקופת החלמה של שבוע לפני תחילת כל הליך הקלטה או ניסוי.

5. הליך הקלטה

1. טפל בבעל החיים במשך 15 דקות, פעמיים ביום, במשך שלושה ימים רצופים.
2. הרימו את העכברים על ידי סגירה עדינה של היד סביבם מבלי להפעיל לחץ מוגזם.
3. הניחו את לוח הבמה על ראשו של בעל החיים למשך 30 דקות פעם ביום במשך שלושה ימים רצופים.
4. ביום ההקלטה יש להרגיל את החיה לחדר ההקלטות למשך 30 דקות.
5. הניחו את בעל החיים בתא הקלטה קטן בתוך כלוב פאראדיי כדי להפחית הפרעות חשמליות חיצוניות. צרף את במת הראש המותאמת אישית להקלטה.
6. פתח את תוכנת ההקלטה ובחר קצב דגימה של 2.00 קילוהרץ. השבת את כל הערוצים, למעט 13 ו- 20, על-ידי בחירת כל ערוץ והקשה על מקש הרווח.
7. בחלון רוחב הפס של החומרה, הגדר את רוחב הפס התחתון ל- 2 הרץ ואת רוחב הפס העליון ל- 100 הרץ.
8. בחלון סינון התוכנה, התאם את מסנן המעבר הנמוך ל- 100 הרץ ואת מסנן המעבר הגבוה ל- 2 הרץ.
9. בחר את נתיב האחסון על-ידי לחיצה על בחר שם קובץ ולאחר מכן לחץ על רשומה.
10. התחל כל סשן הקלטה עם תקופת הרגלה של 10 דקות ואחריה הקלטת EEG בסיסית של 15 דקות.
11. לאחר ההקלטה הבסיסית, יש לתת את התרופה באמצעות הזרקה תוך צפקית ולהמשיך בהקלטה במשך 30 דקות נוספות ללא דיחוי.
    הערה: עיין בסעיף התוצאות לקבלת פרטים על התרופות שבהן נעשה שימוש.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

התוצאות המוצגות כאן מדגימות את ההשפעות של מספר תרופות על תכונות פוטנציאלי שדה מקומי (LFPs) שנבדקו בארבע קבוצות של עכברים זכרים C57BL/6 (n = 8 עבור כל עוקבה; גיל: 8 שבועות; משקל: 24.0 ± 0.42 גרם). התרופות שנבדקו כללו את התרופה האנטי פסיכוטית קלוזאפין, מודולטורים של תעלת אשלגן 4-אמינופירידין (4-AP) ורטיגבין, כ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את ההליך לבניית במת ראש מותאמת אישית שתוכננה במיוחד להקלטה סימולטנית של פוטנציאלי שדה מקומיים כפולים (LFPs) בהיפוקמפוס (HIP) ובקליפת המוח הקדם-מצחית (PFC). השלבים המפורטים המפורטים בפרוטוקול זה מציעים מידע מספיק לחוקרים כדי לבחון ביסודיות את תקשורת האותות הן בתוך כל אז?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brass tube	Albion Alloys, USA	Inside diameter of 0.45 mm
Carprofen	Rimadyl, Pfizer Animal Health
Commercial amplifier chip	Intantech	RHD 2132
Control board	Intantech	RHD recording system
Dental cement	Paladur
Heat shrinks	Panduit	0.8 mm diameter
M1.2 stainless steel screw	Watch tools	Clock and watch screw
Multichannel socket connector	Harwin, AU	1.27 mm pitch, PCB socket
PFA-coated tungsten wires	A-M SYSTEMS, USA	Inside diameter of 150 µm
Phosphoric acid-based flux	Chip Quik	CQ4LF-0.5
Recording software	Intantech	RHX recording software
Stereotactic Frame	World Precision Instruments	Mouse stereotactic instrument
Super glue	UHU	Ultra fast