Gravações extracelulares duplas no hipocampo de camundongos e córtex pré-frontal

Resumo

Este protocolo descreve o uso de um dispositivo de gravação personalizado e eletrodos para registrar potenciais de campo locais e investigar o fluxo de informações no hipocampo e no córtex pré-frontal do camundongo.

Resumo

A técnica de registro de potenciais de campo local (LFPs) é um método eletrofisiológico usado para medir a atividade elétrica de populações neuronais localizadas. Ele serve como uma ferramenta crucial na pesquisa cognitiva, particularmente em regiões do cérebro como o hipocampo e o córtex pré-frontal. As gravações LFP duplas entre essas áreas são de particular interesse, pois permitem a exploração da comunicação de sinais inter-regionais. No entanto, os métodos para realizar essas gravações raramente são descritos, e a maioria dos dispositivos de gravação comerciais são caros ou carecem de adaptabilidade para acomodar projetos experimentais específicos. Este estudo apresenta um protocolo abrangente para realizar gravações de LFP de eletrodo duplo no hipocampo de camundongos e no córtex pré-frontal para investigar os efeitos de drogas antipsicóticas e moduladores de canais de potássio nas propriedades de LFP nessas áreas. A técnica permite a medição das propriedades do LFP, incluindo espectros de potência dentro de cada região do cérebro e coerência entre os dois. Além disso, um dispositivo de gravação personalizado e de baixo custo foi desenvolvido para esses experimentos. Em resumo, este protocolo fornece um meio de registrar sinais com altas relações sinal-ruído em diferentes regiões do cérebro, facilitando a investigação da comunicação de informações inter-regionais dentro do cérebro.

Introdução

Os potenciais de campo local (LFPs) referem-se à atividade elétrica registrada no espaço extracelular, refletindo a atividade coletiva de um grupo localizado de neurônios. Eles exibem uma gama diversificada de frequências, abrangendo desde ondas lentas em 1 Hz até oscilações rápidas em 100 Hz ou 200 Hz. Bandas de frequência específicas têm sido associadas a funções cognitivas, como aprendizado, memória e tomada de decisão ^1,2. Alterações nas propriedades da LFP têm sido usadas como biomarcadores para vários distúrbios neurológicos, incluindo demência e esquizofrenia ^3,4. A análise dos registros de LFP pode oferecer informações valiosas sobre os mecanismos patológicos subjacentes associados a essas condições e possíveis estratégias terapêuticas.

A gravação LFP dupla é uma técnica usada para medir a atividade elétrica localizada dentro e entre duas regiões cerebrais específicas. Essa técnica oferece uma oportunidade valiosa para investigar a intrincada dinâmica neural e a comunicação de sinais que ocorrem dentro e entre regiões cerebrais distintas. Estudos anteriores revelaram que a detecção de alterações nas propriedades neuronais de regiões cerebrais individuais pode ser complexa, mas mudanças na comunicação cortical inter-regional podem ser observadas ^5,6. Portanto, a utilização da gravação LFP dupla oferece um meio potente para resolver esse problema.

A conectividade hipocampo-pré-frontal desempenha um papel crucial na modulação das funções cognitivas, e a disfunção tem sido associada a vários distúrbios neurológicos ^7,8. Gravações de eletrodos duplos dessas regiões podem fornecer informações sobre essas interações. Infelizmente, há informações limitadas disponíveis sobre métodos para realizar gravações LFP de eletrodo duplo entre essas áreas. Além disso, os dispositivos de gravação disponíveis comercialmente são geralmente caros e carecem de adaptabilidade a projetos experimentais específicos. O método convencional para registrar LFPs envolve o uso de um cabo blindado para conectar o dispositivo de gravação a eletrodos implantados no cérebro de um animal. No entanto, essa abordagem é suscetível a artefatos de movimento e ruído ambiental, impactando a qualidade e a confiabilidade dos sinais registrados.

Este protocolo descreve um procedimento abrangente para realizar gravações LFP de eletrodo duplo no hipocampo e córtex pré-frontal de camundongos, usando um headstage personalizado de baixo custo que pode ser colocado na cabeça do animal. Esses métodos permitem que os pesquisadores investiguem padrões oscilatórios específicos da região dentro de duas regiões cerebrais discretas e explorem a troca de informações inter-regionais e a conectividade entre essas áreas.

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Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal Florey (Universidade de Melbourne, nº 22-025UM) de acordo com o código australiano para o cuidado e uso de animais para fins científicos. Camundongos machos C57BL/6 (8 semanas), obtidos no Animal Resources Centre (Austrália), foram usados para o presente estudo.

1. Projeto e fabricação de headstage

NOTA: A placa PCB do headstage é uma placa compacta de quatro camadas de 14 mm x 12 mm projetada para ser colocada diretamente na cabeça do animal. Ele utiliza um chip amplificador comercial (consulte a Tabela de Materiais), e todos os arquivos de design e Gerber estão disponíveis online (link do GitHub: https://github.com/dechuansun/Intan-headstage/tree/main/pcbway).

1. Forneça as seguintes especificações ao fabricante: Espessura da placa: 0,6 mm; Rastreamento/espaçamento mínimo: 4 mils; Tamanho mínimo do furo: 0,2 mm.
2. Durante o processo de montagem do PCB, siga esta ordem:
   1. Solde o chip do amplificador na placa usando uma pistola de ar quente ajustada a 350 °C.
   2. Solde os componentes passivos.
   3. Solde o conector SPI e o conector do eletrodo (consulte a Tabela de Materiais).
3. Inspecione a solda sob um microscópio para garantia de qualidade. Prenda o conector SPI no lugar usando epóxi para maior estabilidade.
4. Use software de gravação de terceiros e uma placa de controle (consulte a Tabela de Materiais) para aquisição de sinal. Consulte o guia do usuário do software para obter instruções detalhadas.
5. O headstage projetado suporta 8 canais. No software, habilite os canais 8, 9, 12, 13, 20, 21, 22 e 23 para gravação.

2. Fabricação de eletrodos

1. Corte os fios de tungstênio revestidos com PFA (consulte a Tabela de Materiais) em comprimentos específicos para diferentes tipos de eletrodos: eletrodo do córtex pré-frontal (12 mm), eletrodo do hipocampo (10 mm) e eletrodo de aterramento (6 mm).
2. Corte o tubo de latão (consulte a Tabela de Materiais) em segmentos de 3 mm.
3. Remova 2 mm do revestimento na extremidade de cada fio usando um isqueiro e, em seguida, solde firmemente o fio do eletrodo ao tubo de latão. O tubo de latão tem um diâmetro interno de 0,45 mm e um diâmetro externo de 0,60 mm.
4. Para o eletrodo de aterramento, solde um parafuso de aço inoxidável M1.2 (consulte a Tabela de Materiais) ao eletrodo. Aplique fluxo à base de ácido fosfórico no parafuso para melhorar a soldagem. Após a soldagem, limpe o parafuso com álcool.
   NOTA: Use luvas para proteção durante o processo de soldagem.

3. Procedimento cirúrgico

1. Anestesiar o camundongo em uma câmara de anestesia com isoflurano a 3% e fluxo de oxigênio de 1 L/min.
2. Coloque o mouse anestesiado em uma almofada de aquecimento e prenda-o em uma estrutura estereotáxica (consulte a Tabela de Materiais).
3. Ajuste a taxa de manutenção do isoflurano para 2,5-3% e reduza o fluxo de oxigênio para 500 mL / min. Usando a pinça do dedo do pé, verifique se o animal ainda está sob anestesia profunda.
4. Injete carprofeno por via subcutânea a 0,5 mg/kg e aplique pomada para os olhos para proteção dos olhos.
5. Raspe e esterilize a cabeça do camundongo usando iodopovidona e etanol a 80%.
6. Faça uma incisão de 8 mm ao longo da linha média do couro cabeludo, removendo o tecido conjuntivo na área da incisão.
7. Aplique peróxido de hidrogênio para limpar a superfície do crânio, tomando cuidado para não tocar na pele ao redor.
8. Alinhe os pontos de referência bregma e lambda no mesmo nível para um posicionamento preciso do eletrodo (bregma e lambda são onde a sutura sagital cruza as suturas coronal e lambdoide).
9. Faça furos para eletrodo de referência/aterramento, parafusos de ancoragem (broca de 0,9 mm) e eletrodos ativos (broca de 0,3 mm) nas coordenadas especificadas.
10. Conecte o eletrodo feito sob medida (etapa 2) ao braço da estrutura estereotáxica e certifique-se de que esteja perpendicular ao cérebro.
11. Implante o eletrodo na área CA1 do hipocampo (AP - 1,8 mm, ML - 1,3 mm, DV - 1,4 mm).
    NOTA: AP, ântero-posterior; ML, mediolateral; DV, dorsoventral.
12. Repita o implante do eletrodo no córtex pré-frontal (AP - 2,0 mm, ML - 0,3 mm, DV - 1,7 mm).
13. Prenda os eletrodos com um adesivo poderoso e cimento dentário disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais).
14. Implante dois parafusos de ancoragem de 1,2 mm (AP - 1,8 mm, ML -1,6 mm) para evitar movimento.
15. Posicione o eletrodo de referência/terra em contato direto com a dura-máter, 2 mm posterior e 2 mm unilateral ao ponto de referência lambda.
16. Conecte o lado do tubo de latão dos eletrodos a um conector de soquete multicanal (consulte a Tabela de Materiais) com o eletrodo de aterramento no meio.
17. Use tubo termorretrátil de 0.8 mm na parte externa do pino do meio para isolamento.
18. Prenda os eletrodos, parafusos de ancoragem e conector com adesivo e cimento dentário.

4. Cuidados pós-operatórios

1. Para aliviar a dor pós-operatória, injete carprofeno na dose de 5-10 mg / kg por via subcutânea a cada 12-24 horas com base em uma avaliação da dor por um período de três dias.
2. Forneça ao animal um período de recuperação de uma semana antes de iniciar qualquer registro ou procedimento experimental.

5. Procedimento de registo

1. Manuseie o animal por 15 min, duas vezes ao dia, por três dias consecutivos.
2. Pegue os ratos fechando suavemente a mão ao redor deles sem aplicar pressão excessiva.
3. Coloque a placa do palco na cabeça do animal por 30 minutos uma vez por dia durante três dias consecutivos.
4. No dia da gravação, aclimatar o animal à sala de gravação por 30 min.
5. Coloque o animal em uma pequena câmara de gravação dentro de uma gaiola de Faraday para reduzir a interferência elétrica externa. Anexe o headstage personalizado para gravação.
6. Abra o software de gravação e selecione uma taxa de amostragem de 2.00 kHz. Desative todos os canais, exceto 13 e 20, selecionando cada canal e pressionando a barra de espaço.
7. Na janela de largura de banda do hardware, defina a largura de banda inferior para 2 Hz e a largura de banda superior para 100 Hz.
8. Na janela de filtragem de software, ajuste o filtro passa-baixa para 100 Hz e o filtro passa-alta para 2 Hz.
9. Escolha o caminho de armazenamento clicando em Selecionar nome do arquivo e, em seguida, clique em Gravar.
10. Comece cada sessão de gravação com um período de habituação de 10 minutos, seguido por uma gravação de EEG basal de 15 minutos.
11. Após a gravação inicial, administre o medicamento por injeção intraperitoneal e continue gravando por mais 30 minutos sem demora.
    NOTA: Consulte a seção Resultados para obter detalhes sobre os medicamentos usados.

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Resultados

Os resultados aqui mostrados demonstram os efeitos de vários fármacos nas propriedades dos potenciais de campo local (LFPs) testados em quatro coortes de camundongos machos C57BL/6 (n = 8 para cada coorte; idade: 8 semanas; peso: 24,0 ± 0,42 g). As drogas testadas incluíram o antipsicótico clozapina, os moduladores dos canais de potássio 4-aminopiridina (4-AP) e retigabina, bem como a solução salina do veículo controle.

Conforme mostrado na Figura 1, o ca...

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Discussão

O protocolo aqui apresentado descreve o procedimento para a construção de um headstage personalizado projetado especificamente para o registro simultâneo de potenciais de campo local duplo (LFPs) no hipocampo (HIP) e no córtex pré-frontal (PFC). As etapas detalhadas fornecidas neste protocolo oferecem informações suficientes para os pesquisadores examinarem minuciosamente a comunicação do sinal dentro de cada região e entre o HIP e o PFC.

O headstage projetado sob medida utiliza um c...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brass tube	Albion Alloys, USA	Inside diameter of 0.45 mm
Carprofen	Rimadyl, Pfizer Animal Health
Commercial amplifier chip	Intantech	RHD 2132
Control board	Intantech	RHD recording system
Dental cement	Paladur
Heat shrinks	Panduit	0.8 mm diameter
M1.2 stainless steel screw	Watch tools	Clock and watch screw
Multichannel socket connector	Harwin, AU	1.27 mm pitch, PCB socket
PFA-coated tungsten wires	A-M SYSTEMS, USA	Inside diameter of 150 µm
Phosphoric acid-based flux	Chip Quik	CQ4LF-0.5
Recording software	Intantech	RHX recording software
Stereotactic Frame	World Precision Instruments	Mouse stereotactic instrument
Super glue	UHU	Ultra fast