マウス海馬と前頭前野における二重細胞外記録

要約

このプロトコルは、局所電界電位を記録し、マウス海馬および前頭前野における情報の流れを調査するためのカスタム設計の記録装置および電極の使用を概説する。

要約

局所電位(LFP)を記録する技術は、局所的なニューロン集団の電気的活動を測定するために使用される電気生理学的方法です。これは、特に海馬や前頭前野などの脳領域における認知研究において重要なツールとして機能します。これらの領域間のデュアルLFP記録は、地域間信号通信の調査を可能にするため、特に興味深いものです。しかし、これらの記録を行う方法はめったに記載されておらず、ほとんどの市販の記録装置は高価であるか、特定の実験計画に対応するための適応性に欠けています。この研究は、マウス海馬と前頭前野で二重電極LFP記録を実行するための包括的なプロトコルを提示し、これらの領域のLFP特性に対する抗精神病薬とカリウムチャネルモジュレーターの効果を調査します。この技術により、各脳領域内のパワースペクトルや2つの領域間のコヒーレンスなど、LFP特性の測定が可能になります。さらに、これらの実験のために、低コストのカスタム設計の記録装置が開発されました。要約すると、このプロトコルは、異なる脳領域において高い信号対雑音比を有する信号を記録する手段を提供し、脳内の地域間情報通信の調査を容易にする。

概要

局所電界電位(LFP)は、細胞外空間から記録された電気的活動を指し、局所的なニューロン群の集合的な活動を反映しています。それらは、1Hzの低速波から100Hzまたは200Hzの高速振動まで、さまざまな周波数範囲を示し、特定の周波数帯域は、学習、記憶、意思決定などの認知機能に関連しています^1,2。LFP特性の変化は、認知症や統合失調症などのさまざまな神経疾患のバイオマーカーとして使用されています^3,4。LFP記録を分析することで、これらの状態に関連する根本的な病理学的メカニズムと潜在的な治療戦略に関する貴重な洞察を得ることができます。

デュアルLFP記録は、2つの特定の脳領域内および2つの特定の脳領域間の局所的な電気的活動を測定するために使用される技術です。この手法は、異なる脳領域内および異なる脳領域間で発生する複雑な神経ダイナミクスと信号伝達を調査する貴重な機会を提供します。以前の研究では、個々の脳領域のニューロン特性の変化を検出することは複雑である可能性があることが明らかになりましたが、領域間皮質コミュニケーションの変化は観察できます^5,6。したがって、デュアルLFP記録の利用は、この問題に対処するための強力な手段を提供します。

海馬と前頭前野の接続性は、認知機能の調節に重要な役割を果たしており、機能障害はさまざまな神経障害と関連しています^7,8。これらの領域の二重電極記録は、これらの相互作用に関する情報を提供することができます。残念ながら、これらの領域間で二重電極LFP記録を実行する方法に関する利用可能な情報は限られています。さらに、市販の記録装置は一般的に高価であり、特定の実験計画への適応性に欠けています。従来のLFPの記録方法は、動物の脳に埋め込まれた電極にシールドケーブルを使用して記録装置を接続するというものでした。ただし、このアプローチはモーションアーチファクトや環境ノイズの影響を受けやすく、記録された信号の品質と信頼性に影響を与えます。

このプロトコルは、動物の頭に配置できる低コストのカスタム設計のヘッドステージを使用して、マウスの海馬および前頭前野で二重電極LFP記録を実行するための包括的な手順を記述します。これらの方法により、研究者は2つの別々の脳領域内の領域固有の振動パターンを調査し、これらの領域間の領域間の情報交換と接続性を探ることができます。

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プロトコル

この研究は、科学的目的での動物の世話と使用に関するオーストラリアのコードに従って、フローリー動物倫理委員会(メルボルン大学、No.22-025UM)によって承認されました。本研究では、動物資源センター(オーストラリア)から入手したC57BL/6雄マウス(8週間)を使用しました。

1.ヘッドステージの設計と製造

注:ヘッドステージPCBボードは、動物の頭に直接配置するように設計されたコンパクトな14 mm x 12 mmの4層ボードです。市販のアンプチップ( 資料表を参照)を利用しており、すべての設計ファイルとガーバーファイルはオンラインで入手できます(GitHubリンク:https://github.com/dechuansun/Intan-headstage/tree/main/pcbway)。

1. 次の仕様をメーカーに提供します:ボードの厚さ:0.6 mm;最小トラッキング/間隔:4ミル;最小穴サイズ:0.2mm。
2. PCBアセンブリプロセス中は、次の順序に従います。
   1. 350°Cに設定された熱風ガンを使用して、アンプチップをボードにはんだ付けします。
   2. 受動部品をはんだ付けします。
   3. SPIコネクタと電極コネクタをはんだ付けします( 材料の表を参照)。
3. 品質保証のために顕微鏡ではんだ付けを検査します。安定性を高めるために、エポキシを使用してSPIコネクタを所定の位置に固定します。
4. 信号集録には、他社製の記録ソフトウェアと制御ボード( 「材料の表」を参照)を使用します。詳細な手順については、ソフトウェアのユーザーガイドを参照してください。
5. 設計されたヘッドステージは8チャンネルをサポートします。ソフトウェアで、チャンネル8、9、12、13、20、21、22、および23を録音用に有効にします。

2. 電極の作製

1. PFA被覆タングステン線( 材料表を参照)を、前頭前野電極(12 mm)、海馬電極(10 mm)、および接地電極(6 mm)など、さまざまな電極タイプに対して特定の長さに切断します。
2. 真鍮管( 材料の表を参照)を3mmのセグメントに切断します。
3. ライターを使用して各ワイヤの端にあるコーティングの2 mmを取り除き、電極ワイヤを真鍮管にしっかりとはんだ付けします。真鍮管の内径は0.45mm、外径は0.60mmです。
4. 接地電極の場合は、M1.2ステンレス鋼ネジ( 材料の表を参照)を電極にはんだ付けします。リン酸系フラックスをねじに塗布し、はんだ付けを強化します。はんだ付け後、アルコールを使用してネジを清掃します。
   注意: はんだ付けプロセス中の保護のために手袋を着用してください。

3.外科的処置

1. 3%イソフルランと1 L / minの酸素流量を備えた麻酔室でマウスを麻酔します。
2. 麻酔をかけたマウスを加熱パッドの上に置き、固定装置フレームに固定します( 材料の表を参照)。
3. イソフルランの維持率を2.5〜3%に調整し、酸素流量を500mL / minに減らします。つま先のつま先を使用して、動物がまだ深い麻酔下にあるかどうかを確認します。
4. カルプロフェンを0.5 mg / kgで皮下注射し、目の軟膏を塗布して目を保護します。.
5. ポビドンヨードと80%エタノールを使用してマウスの頭を剃り、滅菌します。
6. 頭皮の正中線に沿って8mmの切開を行い、切開部の結合組織を除去します。
7. 過酸化水素を塗布して頭蓋骨の表面をきれいにし、周囲の皮膚に触れないように注意してください。
8. 正確な電極配置のために、ブレグマとラムダのランドマークを同じレベルに合わせます(ブレグマとラムダは、矢状縫合糸が冠状縫合糸とラムドイド縫合糸と交差する場所です)。
9. 基準電極/接地電極、アンカーネジ(0.9mmドリルバリ)、アクティブ電極(0.3mmドリルバリ)用の穴を指定座標にドリル穴を開けます。
10. カスタムメイドの電極(ステップ2)を脳定位固定装置フレームアームに取り付け、脳に対して垂直であることを確認します。
11. 海馬CA1領域(AP-1.8 mm、ML-1.3 mm、DV-1.4 mm)に電極を埋め込みます。
    注:AP、前後;ML、中外側;DV、背腹側。
12. 前頭前野への電極移植を繰り返す(AP-2.0mm、ML-0.3mm、DV-1.7mm)。
13. 市販の強力な接着剤と歯科用セメントで電極を固定します( 材料の表を参照)。
14. 1.2mmのアンカーネジを2本(AP-1.8mm、ML-1.6mm)を埋め込み、動きを防ぎます。
15. 基準/接地電極を硬膜に直接接触させ、ラムダランドマークの後方2 mmと片側2 mmに配置します。
16. 電極の真鍮管側をマルチチャンネルソケットコネクタ( 材料の表を参照)に接続し、接地電極を中央に置きます。
17. 分離のために、ミドルピンの外側に0.8mmの熱収縮チューブを使用します。
18. 電極、アンカーネジ、コネクタを接着剤と歯科用セメントで固定します。

4.術後ケア

1. 術後の痛みを軽減するために、3日間の痛みの評価に基づいて、12〜24時間ごとに5〜10 mg / kgの用量でカルプロフェンを皮下注射します。.
2. 記録または実験手順を開始する前に、動物に1週間の回復期間を与えてください。

5. 記録手順

1. 動物を15分間、1日2回、3日間連続して取り扱います。
2. マウスに過度の圧力をかけずに、マウスの周りの手をそっと閉じて、マウスを持ち上げます。
3. ヘッドステージボードを動物の頭に30分間、1日1回、3日間連続して置きます。
4. 録音当日は、動物を録音室に30分間順応させます。
5. 動物をファラデーケージ内の小さな記録室に入れて、外部からの電気的干渉を減らします。録音用のカスタムヘッドステージを取り付けます。
6. 録音ソフトウェアを開き、2.00kHzのサンプリングレートを選択します。13 と 20 以外のすべてのチャンネルを無効にするには、各チャンネルを選択して スペースバーを押します。
7. ハードウェア帯域幅ウィンドウで、下限帯域幅を 2 Hz に、上限帯域幅を 100 Hz に設定します。
8. ソフトウェア フィルタリング ウィンドウで、ローパス フィルターを 100 Hz に、ハイパス フィルターを 2 Hz に調整します。
9. [ファイル名の選択] をクリックして保存パスを選択し、[レコード] をクリックします。
10. 各記録セッションを 10 分間の慣れ期間で開始し、その後 15 分間のベースライン EEG 記録を行います。
11. ベースライン記録後、腹腔内注射 で 薬物を投与し、遅滞なくさらに30分間記録を続けます。.
    注:使用した薬物の詳細については、結果のセクションを参照してください。

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結果

ここに示す結果は、C57BL/6雄マウスの4つのコホート(各コホートでn = 8、年齢:8週、体重:24.0 ± 0.42g)でテストされた局所電界電位(LFP)特性に対するいくつかの薬物の効果を示しています。試験された薬物には、抗精神病薬のクロザピン、カリウムチャネルモジュレーターの4-アミノピリジン(4-AP)、レチガビン、および対照ビヒクル生理食塩水が含まれていました。

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ディスカッション

ここで紹介するプロトコルは、海馬(HIP)と前頭前野(PFC)の二重局所電界電位(LFP)を同時に記録するために特別に設計されたカスタマイズされたヘッドステージを構築するための手順を概説しています。このプロトコルで提供される詳細な手順は、研究者が各領域内およびHIPとPFC間の信号通信を徹底的に調べるのに十分な情報を提供します。

カスタム設計のヘッドステージ?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brass tube	Albion Alloys, USA	Inside diameter of 0.45 mm
Carprofen	Rimadyl, Pfizer Animal Health
Commercial amplifier chip	Intantech	RHD 2132
Control board	Intantech	RHD recording system
Dental cement	Paladur
Heat shrinks	Panduit	0.8 mm diameter
M1.2 stainless steel screw	Watch tools	Clock and watch screw
Multichannel socket connector	Harwin, AU	1.27 mm pitch, PCB socket
PFA-coated tungsten wires	A-M SYSTEMS, USA	Inside diameter of 150 µm
Phosphoric acid-based flux	Chip Quik	CQ4LF-0.5
Recording software	Intantech	RHX recording software
Stereotactic Frame	World Precision Instruments	Mouse stereotactic instrument
Super glue	UHU	Ultra fast