מודלים תלת מימדיים של תרביות תאים לחקר מחסום האפיתל בדלקת ושט אאוזינופילית

Summary

כאן, פרוטוקול לתרבית אורגנואידים של הוושט האנושי ותרבות ממשק אוויר-נוזל מסופק. ניתן להשתמש בתרבית ממשק אוויר-נוזל של אורגנואידים בוושט כדי לחקור את ההשפעה של ציטוקינים על מחסום אפיתל הוושט.

Abstract

אפיתל הקשקש של הוושט חשוף ישירות לסביבה, מול אנטיגנים זרים ברציפות, כולל אנטיגנים מזון וחיידקים. שמירה על שלמות מחסום האפיתל היא קריטית למניעת זיהומים ולמניעת דלקת הנגרמת על ידי אנטיגנים לא מזיקים שמקורם במזון. מאמר זה מספק פרוטוקולים פשוטים ליצירת אורגנואידים אנושיים בוושט ותרביות ממשק אוויר-נוזל מביופסיות של מטופלים כדי לחקור את תא האפיתל של הוושט בהקשר של הומאוסטזיס רקמות ומחלות. פרוטוקולים אלה היוו אבני דרך מדעיות משמעותיות בעשור האחרון, המתארים מבנים תלת-ממדיים דמויי איברים מתאים ראשוניים שמקורם בחולה, אורגנואידים ותרביות ממשק אוויר-נוזל. הם מציעים את האפשרות לחקור את תפקודם של ציטוקינים ספציפיים, גורמי גדילה ומסלולי איתות באפיתל הוושט במסגרת תלת ממדית תוך שמירה על התכונות הפנוטיפיות והגנטיות של התורם. אורגנואידים מספקים מידע על מיקרו-ארכיטקטורה של רקמות על ידי הערכת התעתיק והפרוטאום לאחר גירוי ציטוקינים. לעומת זאת, תרביות ממשק אוויר-נוזל מאפשרות להעריך את שלמות מחסום האפיתל באמצעות עמידות טרנסאפיתל (TEER) או מדידות שטף מקרומולקולות. שילוב של אורגנואידים אלה ותרביות ממשק אוויר-נוזל הוא כלי רב עוצמה לקידום המחקר במצבי מחסום אפיתל לקוי בוושט.

Introduction

דלקת בוושט פוגעת בשלמות מחסום האפיתל ^1,2,3,4,5, כפי שנצפה בדלקת ושט אאוזינופילית (EoE), מחלה דלקתית כרונית הנשלטת על ידי Th2 בוושט⁶. EoE תואר לראשונה בשנות ה-90^{של המאה} ה-20 ^7,8 והוא מושרה בעיקר על ידי אנטיגנים של מזון ^{9,10,11,12,13}. הסימפטומים השכיחים ביותר של EoE באוכלוסייה הבוגרת הם דיספגיה ופגיעה במזון¹⁴. אצל ילדים, EoE מתבטא בדרך כלל בכישלון לשגשג, סירוב מזון, הקאות וכאבי בטן¹⁵. מחקרי אסוציאציה רחבת גנום (GWAS) זיהו גנים בסיכון EoE המעורבים בשלמות מחסום האפיתל, והעבירו את האפיתל למוקד מחקר EoE 16,17,18. תעתיק EoE גילה עוד כי תהליך התמיינות לקוי והיפרפלזיה תגובתית של אזור הבסיס גורמים לתפקוד המחסום הנפגע של אפיתל הוושט 3,5,19,20,21,22. ההבנה המוקדמת של EoE כמחלה בתיווך Th2⁶ הובילה לגילוי IL-13 כמתווך נהיגה על ידי הפרעה לשלמות האפיתל 3,4,21,23. מערכות ניסיוניות המאפשרות דיסקציה של השפעות בתיווך ציטוקינים על שלמות האפיתל מפגיעה במחסום הפנימי באמצעות נטייה גנטית מספקות את האפשרות לחקור את יחסי הגומלין המורכבים בין תאי מערכת החיסון לבין האפיתל ב-EoE. אורגנואידים של הוושט האנושי ותרביות ממשק אוויר-נוזל (ALI) הוצעו ככלים רבי ערך לניתוח התוצאות של גירוי ציטוקינים על שלמות האפיתל⁵.

הפרוטוקול הראשון ליצירת אורגנואידים של ושט שמקורם בתאי גזע בוגרים ספציפיים לרקמה (ASC) נקבע חמש שנים לאחר הדוחות הראשונים שפורסמו של אורגנואידי מעיים בשנת 2009 באמצעות LGR5⁺ ASCs במעי המשחזרים את תא האפיתל של המעי הדק²⁴. DeWard et al. היו חלוצים ביצירת אורגנואידים מתאי אפיתל של הוושט²⁵. בשנת 2018, Kasagi et al. יצרו אורגנואידים אנושיים של הוושט מקו תאי אפיתל קשקשי של הוושט האנושי EPC2-hTERT ותאים ראשוניים שמקורם במטופל²⁶. באותה שנה, Zhang et al. יצרו בהצלחה אורגנואידים של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) שמקורם בוושט. הם תיארו את המשמעות של עיכוב TGFβ וחלבון מורפוגנטי עצם (BMP) להתפתחות תאי אב של הוושט (EPC) ואת התפקיד המכריע של איתות Notch בהתמיינות של אפיתל קשקשי מרובד^26,27. טריזנו ועמיתיו השלימו ממצאים אלה על ידי זיהוי Sox2 כמעכב Wnt המכוון את הגורל ההתפתחותי לקראת התמיינות הוושט²⁸. השכלולים הבאים של פרוטוקולים, הרכב בינוני ותנאי תרבית הגדילו את קצב היווצרות האורגנואידים והפכו את תת-התרבות והשחזור של אורגנואידים לאחר שימור בהקפאה לאפשריים 26,29,30,31,32. למרות שאורגנואידים אלה הם כלים רבי עוצמה לחקר ארכיטקטורת רקמות וביטוי של גני מטרה פוטנציאליים לאחר גירוי עם ציטוקינים, אורגנואידים של הוושט לא יציעו את האפשרות למדוד עמידות טרנסאפיתל (TEER) או שטף מקרומולקולות כאמצעים ישירים לשלמות המחסום. כפי שתואר קודם לכן על ידי שריל ועמיתיו²², תרביות ALI המדגימות התמיינות אפיתל⁴ מאפשרות הערכות ישירות של שלמות האפיתל. שילוב אורגנואידים שמקורם במטופל ותרביות ALI הוא כלי רב עוצמה לחקר ארכיטקטורת רקמות ותקינות מחסום אפיתל ב- EoE.

להלן נהלים עם הוראות לבידוד תאים ברי קיימא מביופסיות הוושט והקמת תרביות אורגנואידים ותרביות ALI של הוושט שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את ההשפעות של ציטוקינים על שלמות המחסום.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הנהלים אושרו על ידי ועדת האתיקה של צפון מערב ומרכז שווייץ (EKNZ; מזהה פרויקט 2019-00273). כל החולים נתנו הסכמה מדעת בכתב לשימוש ניסיוני בביופסיות לפני הבדיקה האנדוסקופית. הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. בידוד תאים לאורגנואידים של הוושט שמקורם במטופל

הערה: רשימה של המרכיבים הבינוניים לגידול אורגנואידים של הוושט האנושי מובאת בטבלה 1.

1. להשיג את הביופסיות.
   הערה: במחקר הנוכחי, שתי ביופסיות ממקטע אחד של הוושט מתקבלות במהלך esophagogastroduodenoscopy עם מלקחיים ביופסיה באמצעות גסטרוסקופ עם ערוץ עבודה 2.8 מ"מ.
2. להעביר את הביופסיות למדיום ללא סרום קרטינוציטים זמין מסחרית (KSFM; Ca^{2 +} 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 מיקרוגרם/מ"ל BPE).
   הערה: ניתן לאחסן ביופסיות על קרח למשך מספר שעות עד לשימוש.
3. החלף את מדיום KSFM ב- 1 מ"ל של Dispase I (10 U / mL) ודגור על הביופסיות במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
4. צנטריפוגה את הביופסיות בטמפרטורת החדר ב 300 x גרם במשך 2 דקות.
5. יש לשאוף את הדיספאז באמצעות פיפטה של 1000 μL מבלי לגעת בביופסיות ובגלולת פסולת התא.
6. שטפו את הביופסיות במי מלח חוצצי פוספט (DPBS) במינון 1 מ"ל של Dulbecco.
7. צנטריפוגה את הביופסיות בטמפרטורת החדר ב 300 x גרם במשך 2 דקות.
8. שאפו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה של 1000 מיקרוליטר.
9. לדגור על הביופסיות עם 500 μL של טריפסין-EDTA (0.05%) ב 37 ° C במשך 10 דקות תוך רעד ב 800 סל"ד.
10. בצע הפרעה מכנית על ידי צנרת חוזרת ונשנית למעלה ולמטה עד לקבלת מתלה חד-תאי.
11. סנן את התאים דרך מסננת תאים בגודל 70 מיקרומטר באמצעות ראש בוכנה גומי של מזרק שחפת.
12. לשטוף את המסננת עם 2-4 מ"ל של מעכב טריפסין סויה (250 מיקרוגרם / מ"ל).
13. סנן את התאים דרך מסננת תאים בגודל 35 מיקרומטר עם מכסה הצמדה על צינור פוליסטירן בעל תחתית עגולה של 5 מ"ל.
14. העבר את התמיסה התאית הבודדת לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
15. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
16. שאפו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה של 1000 מיקרוליטר.
17. להשעות את התאים ב 100 μL של מדיום KSFM.
18. מערבבים 10 μL של כחול טריפאן עם 10 μL של השעיית תאים.
19. ספור את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי.

2. תרבית אורגנואידים שמקורה במטופל

1. הוסף 1-2 מ"ל של KSFM לתרחיף התא לאחר הספירה.
2. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
3. שאפו את הסופרנאטנט עם פיפטה של 1000 מיקרוליטר מבלי להפריע לכדורית התא.
4. יש להשהות מחדש את גלולת התא במטריצת הידרוג'ל של תמצית קרום מרתף (BME) (40 מיקרוליטר BME לכל 20,000 תאים).
   הערה: לאחר הוספת ה-BME, יש לשמור את התאים על קרח כדי למנוע התמצקות מוקדמת של ה-BME.
5. חותכים קצה פיפטה של 200 μL כדי לשאוף את תערובת התרחיף הצמיגי של תאי BME.
6. טופס טיפות 40 μL בלוח תרבית תאי תרחיף שחומם מראש (37 מעלות צלזיוס).
7. לדגור על הצלחת ללא מדיום במשך 20-30 דקות ב 37 ° C כדי להבטיח התמצקות של טיפות BME.
8. הוסיפו מדיום KSFM-C שחומם מראש בתוספת 10 מיקרומטר של Y27632 (מעכב סלעים) ליומיים הראשונים של התרבית.
9. החלף את המדיום בתווך KSFM-C חדש (ללא Y27632 ו +/- ציטוקין מעניין) כל יומיים.
10. שאפו את המדיום וגרדו טיפות עם קצה הפיפט תוך הוספה רציפה של 1 מ"ל של דיספז II (1.5 U/mL) לבאר.
11. מעבירים את תערובת BME-dispase לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל ודגרים עליה במשך 20 דקות ב-37°C באמבט מים רועד כדי לעכל את ה-BME.
12. צנטריפוגה ב 250 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C ולשאוף את Dispase II.
13. המשך על פי הפרוטוקול של קריאת הריבית (למשל, בידוד RNA, בידוד חלבונים, או קיבוע עם 4% PFA עבור היסטולוגיה).

3. בידוד תאים עבור תרביות ממשק אוויר-נוזל (ALI) שמקורן במטופל

1. להשיג את הביופסיות. במהלך esophagogastroduodenoscopy באמצעות גסטרוסקופ עם ערוץ עבודה 2.8 מ"מ, שתי ביופסיות נלקחות מקטע אחד הוושט עם מלקחיים ביופסיה.
2. הניחו את הביופסיות בתווך ללא סרום קרטינוציטים זמין מסחרית (KSFM; Ca²⁺ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) ולאחסן על קרח במשך מספר שעות עד לשימוש.
3. החלף KSFM עם 1 מ"ל של Dispase (10 U / mL). לאחר מכן, יש לדגור על הביופסיות למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
4. צנטריפוגה את הביופסיות בטמפרטורת החדר ב 300 x גרם במשך 2 דקות.
5. הסר את הדיספאז באמצעות פיפטה של 1000 μL מבלי לגעת בביופסיות ובגלולת פסולת התא.
6. לשטוף את הביופסיות עם 1 מ"ל של DPBS.
7. בטמפרטורת החדר, סובבו את הביופסיות ב 300 x גרם במשך 2 דקות.
8. שאפו את הסופרנאטנט עם פיפטה של 1000 מיקרוליטר.
9. יש לדגור על הביופסיות ב-500 מיקרוליטר של טריפסין-EDTA (0.05%) ב-37°C למשך 10 דקות ולערבב ברציפות ב-800 סל"ד במהלך הדגירה.
10. יש לשבש את הביופסיות באופן מכני באמצעות פיפטינג חוזר ונשנה מעלה ומטה עד לקבלת תרחיף חד-תאי.
11. מעבירים את התאים המנותקים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר עם ראש בוכנה גומי ממזרק שחפת ואוספים את התאים בצינור חרוטי של 50 מ"ל.
12. שטפו את המסננת עם 2-4 מ"ל של מעכב טריפסין סויה (250 מיקרוגרם / מ"ל) כדי להסיר את התאים הנותרים מהמסננת.
13. סנן את התאים עם מכסה הצמדה של מסננת תאים בגודל 35 מיקרומטר לתוך צינור פוליסטירן תחתון עגול של 5 מ"ל.
14. העברת תאים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
15. צנטריפוגה ב-300 x גרם ב-4°C למשך 5 דקות.
16. מוציאים את הסופרנאטנט עם פיפטה של 1,000 מיקרוליטר.
17. השהה מחדש את גלולת התא ב 4 מ"ל של KSFM בינוני (Ca^{2 +} 0.09 mM), כולל 10 מיקרומטר Y27632.
18. מעבירים את התאים לצלוחית תרבית תאי T25.
19. כדי להרחיב את הקרטינוציטים הראשוניים, תרבית את התאים עד 60%-80% מפגש במשך כשבוע אחד.
    הערה: מעבר (P)0 יוצר קונגלומרטים של תאים דמויי איון ואינו חד-שכבתי. קרטינוציטים ראשוניים יוצרים חד-שכבות מ-P1 ואילך.
20. מעבר במפגש של 60%-80% וזרע מחדש P1 בצלוחיות תרבית תאים 2-3 T25 או 1-2 T75.
21. מעבר P1 שוב כאשר קרטינוציטים יוצרים שכבה אחת עם מפגש של 60%-80%.

4. תרבית ממשק אוויר-נוזל (ALI) הנגזר מהמטופל

1. זרעו קרטינוציטים ראשוניים P2 על תוספות טרנסוול לתרבית ALI.
   הערה: זרעו 400,000 תאים ב-12 תוספות באר (200,000 קרטינוציטים ל-0.6 ס"מ²) ב-500 מיקרוליטר של KSFM (Ca²⁺ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 מיקרוגרם/מ"ל BPE).
   1. זרעו 150,000 תאים ב-24 תוספות באר (155,000 קרטינוציטים ל-0.5 ס"מ²) ב-100 מיקרוליטר של KSFM (Ca²⁺ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 מיקרוגרם/מ"ל BPE).
   2. לחלופין, יש להקפיא בתווך KSFM (Ca²⁺ 0.09 mM + 10% DMSO) בטמפרטורה של -80°C למשך 24 שעות ולאחר מכן להעביר את התאים הקפואים לחנקן נוזלי לשימוש מאוחר יותר.
      הערה: בעת שימוש בבקבוקונים קפואים, יש לעבור פעם נוספת לאחר ההפשרה לפני השימוש בתאים לתרבית ALI.
2. מוסיפים מדיום לבאר התחתונה מתחת לתוספת של צלחת תרבית הטרנסוול.
   הערה: עבור 12 לוחות באר: 1.5 מ"ל של KSFM (Ca^{2 +} 0.09 mM, 1 ng / mL EGF, 50 מיקרוגרם / מ"ל BPE). עבור 24 צלחות באר: 600 μL של KSFM (Ca^{2 +} 0.09 mM, 1 ng / mL EGF, 50 μg / mL BPE).
3. החלף את KSFM עם סידן בינוני עד גבוה (Ca²⁺ 1.8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) לאחר יומיים.
4. החליפו את מדיום KSFM עתיר הסידן כל יומיים עד ליום 7.
5. בצעו רכבת אווירית ביום השביעי על ידי שאיפת התווך מהחדר העליון והחלפת התווך בתא התחתון בסידן KSFM גבוה (Ca²⁺ 1.8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) המכיל 10 ng/mL KGF (=FGF7), 75 מיקרוגרם/מ"ל חומצה אסקורבית (AA).
   1. אופציונלי: להוסיף ציטוקין מעניין בריכוז הרצוי למדיום.
6. החליפו את המדיום כל יומיים עד היום ה-14.

5. מדידת התנגדות חשמלית טרנסאפיתל (TEER)

1. לעקר את האלקטרודה של מד TEER על ידי טבילתו בבאר של צלחת 24 באר עם 5% hypochlorite נתרן במשך 10-15 דקות.
2. שטפו את 5% נתרן היפוכלוריט על ידי טבילת האלקטרודה לתוך 4 בארות עוקבות עם ddH_{סטרילי 2}O ולתת לאלקטרודה להתייבש באוויר.
3. הגדר את החסר על ידי הצבת אלקטרודה אחת בבאר ואת האלקטרודה השנייה לתוך הכנס transwell, למלא אותו עם PBS, ולמדוד את TEER.
   הערה: נפחים מומלצים למדידות TEER: עבור 12 פלטות באר (1900 μL בבאר ו- 900 μL בעלון). עבור 24 צלחת באר (750-1000 μL בבאר ו 250 μL בהכנסה).
4. החלף את המדיום של תרביות ALI ב- PBS סטרילי בטמפרטורת החדר.
   הערה: הסר את המדיום מהבאר התחתונה, ובשלב שני, מתוספת הטרנסוול. באופן דומה, הוסף PBS תחילה לאינסרט ולאחר מכן לבאר התחתונה כדי למנוע ניתוק של תרבית ALI מקרום הטרנסוול.
5. מקמו את אלקטרודות מד TEER בבארות הניסוי עם תרביות ALI ובצעו את מדידת TEER¹.
   הערה: בצע מדידות TEER כל יומיים לפני שינוי המדיום.

6. שטף מקרומולקולרי

1. דללו את תמיסת המלאי FITC-Dextran (3-5 kDa) לריכוז תקין של 1 מ"ג/מ"ל.
   הערה: הגן תמיד על FITC-Dextran מפני חשיפה לאור.
2. הכן שורת דילול עם ריכוז FITC יורד (1000 מיקרוגרם/מ"ל עד 0.25 מיקרוגרם/מ"ל) כתקן לקריאה.
3. הוסף 500 μL של תמיסת FITC-dextran (1 מ"ג / מ"ל) לתא העליון של transwell ו 1.5 מ"ל בינוני (+/- ציטוקין של עניין) לתוך התא התחתון ומניחים את הצלחת באינקובטור.
4. אסוף 120 מיקרוליטר של מדיום מהתא התחתון בנקודות הזמן המתאימות (לדוגמה, 0 דקות, 15 דקות, 30 דקות, 60 דקות, 90 דקות, 120 דקות, 150 דקות ו-180 דקות).
5. פיפטה משכפלת (50 מיקרוליטר/באר) של כל נקודת זמן ללוח תחתון שטוח שחור שקוף בן 96 בארות.
6. הרגש את FITC-dextran ב- 490 ננומטר וקרא את הפליטה באורך גל של 520 ננומטר באמצעות קורא לוחות.
7. חישוב כמות השטף המקרומולקולרי על פי התקן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

אורגנואידים של הוושט יגדלו מתאים ראשוניים שחולצו מביופסיות של מטופלים בהתאם להוראות הפרוטוקול שסופק, כפי שתועד במיקרוסקופ שדה בהיר הפוך (איור 1). ASCs אפיתל מתחילים ליצור צבירי תאים באופן התארגנות עצמית ביומיים הראשונים של התרבית לאחר זריעת התאים המבודדים בתמצית קרום המרתף...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ההליכים הניתנים מאפשרים טיפוח של אורגנואידים שמקורם במטופל ותרביות ALI עם סיכויי הצלחה גבוהים. פרוטוקול האורגנואידים הותאם מהפרוטוקול הראשון שפורסם המדווח על יצירת אורגנואידים של הוושט האנושי²⁶ ומפרוטוקול³² שפורסם לאחרונה. שריל ועמיתיו תיארו את מודל^{ALI 2...}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1250 µL Griptip - Filter	Integra	4445
300 µL Griptip - Filter	Integra	4435
70 µM cell strainer	Sarstedt	83.3945.070
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich (Merck)	A4544
Bovine pituitary extract	Gibco (Thermo Fischer Scientific)	3700015
Calcium chloride	Sigma-Aldrich (Merck)	21115
Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures	Greiner Bio-One	7.657 185
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear	R&D Systems (Bio-Techne)	3532-010-02
Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade	Carl Roth	A994
Dispase I	Corning	354235
Dispase II	Sigma-Aldrich (Merck)	D4693
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline  (DPBS)	Sigma-Aldrich (Merck)	D8537
EVE Automated Cell Counter	NanoEntek	EVE-MC
EVE Cell counting slide	NanoEntek	EVS-050
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Falcon	352235
Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran	Sigma-Aldrich (Merck)	FD4	average mol wt 3000-5000
Heraeus - Megafuge  40R	Thermo Fisher Scientific	75004518
Human recombinant epidermal growth factor	Gibco (Thermo Fischer Scientific)	3700015
Keratinocyte-SFM	Gibco (Thermo Fischer Scientific)	17005042
Penicillin-Streptomycin	Gibco (Thermo Fischer Scientific)	15140122
Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein	R&D Systems (Bio-Techne)	251-KG-010/CF
Screw cap tube, 15 mL	Sarstedt	62.554.502
Single Channel EVOLVE 100-1000 µL	Integra	3018
Single Channel EVOLVE 20-200 µL	Integra	3016
Syringe 1 mL		1134950
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000015
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)	Sigma-Aldrich (Merck)	T9128
Trypsin-EDTA	SAFC Biosciences (Merck)	59418C
Y27632 dihydrochloride	Tocris (Bio-Techne)	1254