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Resumo

Aqui, é fornecido um protocolo para a cultura de organoides esofágicos humanos e cultura de interface ar-líquido. A cultura de interface ar-líquido dos organoides esofágicos pode ser usada para estudar o impacto das citocinas na barreira epitelial esofágica.

Resumo

O epitélio escamoso do esôfago é diretamente exposto ao ambiente, enfrentando continuamente antígenos estranhos, incluindo antígenos alimentares e micróbios. Manter a integridade da barreira epitelial é fundamental para prevenir infecções e evitar a inflamação causada por antígenos inofensivos derivados de alimentos. Este artigo fornece protocolos simplificados para gerar organoides esofágicos humanos e culturas de interface ar-líquido a partir de biópsias de pacientes para estudar o compartimento epitelial do esôfago no contexto da homeostase tecidual e da doença. Esses protocolos foram marcos científicos significativos na última década, descrevendo estruturas tridimensionais semelhantes a órgãos de células primárias derivadas de pacientes, organoides e culturas de interface ar-líquido. Eles oferecem a possibilidade de investigar a função de citocinas específicas, fatores de crescimento e vias de sinalização no epitélio esofágico dentro de uma estrutura tridimensional, mantendo as propriedades fenotípicas e genéticas do doador. Os organoides fornecem informações sobre a microarquitetura tecidual, avaliando o transcriptoma e o proteoma após a estimulação de citocinas. Em contraste, as culturas de interface ar-líquido permitem a avaliação da integridade da barreira epitelial por meio de medições de resistência transepitelial (TEER) ou fluxo de macromoléculas. A combinação desses organoides e culturas de interface ar-líquido é uma ferramenta poderosa para avançar na pesquisa em condições de barreira epitelial esofágica prejudicadas.

Introdução

A inflamação esofágica compromete a integridade da barreira epitelial 1,2,3,4,5, como observado na esofagite eosinofílica (EoE), uma doença inflamatória crônica do esôfago dominada por Th26. A EoE foi descrita pela primeira vez na década de 1990 7,8 e é predominantemente induzida por antígenos alimentares 9,10,11,12,13. Os sintomas mais frequentes de EoE na população adulta são disfagia e impactação alimentar14. Em crianças, a EoE geralmente se manifesta com retardo do crescimento, recusa alimentar, vômitos e dor abdominal15. Estudos de associação genômica ampla (GWAS) identificaram genes de risco de EoE envolvidos na integridade da barreira epitelial, movendo o epitélio para o foco da pesquisa de EoE 16,17,18. A transcriptômica da EoE revelou ainda que um processo de diferenciação prejudicado e uma hiperplasia reativa da zona basal causam o comprometimento da função de barreira do epitélio esofágico 3,5,19,20,21,22. A compreensão precoce da EoE como uma doença mediada por Th26 levou à descoberta da IL-13 como um mediador determinante, perturbando a integridade epitelial3 , 4 , 21 , 23 . Sistemas experimentais que permitem a dissecação dos efeitos mediados por citocinas na integridade epitelial do comprometimento da barreira intrínseca por meio da predisposição genética fornecem a possibilidade de estudar a complexa interação entre as células imunes e o epitélio na EoE. Organoides esofágicos humanos e culturas de interface ar-líquido (LPA) têm sido propostos como ferramentas valiosas para analisar a consequência da estimulação de citocinas na integridade epitelial5.

O primeiro protocolo para geração de organoides esofágicos derivados de células-tronco específicas de tecido adulto (ASC) foi estabelecido cinco anos após os primeiros relatos publicados de organoides intestinais em 2009, usando ASCs Lgr5+ intestinais recapitulando o compartimento epitelial do intestino delgado24. DeWard et al. foram pioneiros na geração de organoides a partir de células epiteliais esofágicas murinas25. Em 2018, Kasagi et al. geraram organoides esofágicos humanos a partir da linha celular de epitélio escamoso esofágico humano imortalizada EPC2-hTERT e células primárias derivadas de pacientes26. No mesmo ano, Zhang et al. geraram com sucesso organoides esofágicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC). Eles delinearam a importância da inibição do TGFβ e da proteína morfogenética óssea (BMP) para o desenvolvimento de células progenitoras esofágicas (EPC) e o papel crucial da sinalização Notch na diferenciação do epitélio escamoso estratificado26,27. Trisno e colegas complementaram essas descobertas identificando o Sox2 como um inibidor de Wnt que direciona o destino do desenvolvimento para a diferenciação esofágica28. Os refinamentos subsequentes de protocolos, composição do meio e condições de cultura aumentaram a taxa de formação de organoides e possibilitaram a subcultura e recuperação de organoides após a criopreservação 26,29,30,31,32. Embora esses organoides sejam ferramentas poderosas para estudar a arquitetura do tecido e a expressão de genes-alvo potenciais após estimulação com citocinas, os organoides esofágicos não oferecerão a possibilidade de medir a resistência transepitelial (TEER) ou o fluxo de macromoléculas como medidas diretas para a integridade da barreira. Conforme descrito anteriormente por Sherrill e colegas22, as culturas ALI que modelam a diferenciação epitelial4 permitem avaliações diretas da integridade epitelial. A combinação de organoides derivados de pacientes e culturas de LPA é uma ferramenta poderosa para investigar a arquitetura do tecido e a integridade da barreira epitelial na EoE.

Aqui estão os procedimentos com instruções para isolar células viáveis de biópsias esofágicas e estabelecer culturas de organoides esofágicos e ALI que podem ser usados para estudar os efeitos das citocinas na integridade da barreira.

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Protocolo

Os procedimentos foram aprovados pelo comitê de ética do Noroeste e Central da Suíça (EKNZ; ID do projeto 2019-00273). Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido para o uso experimental de biópsias antes do exame endoscópico. Os reagentes e equipamentos utilizados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Isolamento celular para organoides esofágicos derivados de pacientes

NOTA: Uma lista dos constituintes do meio para a cultura de organoides esofágicos humanos é fornecida na Tabela 1.

  1. Obtenha as biópsias.
    NOTA: No presente estudo, duas biópsias de um segmento do esôfago são obtidas durante a esofagogastroduodenoscopia com pinça de biópsia usando um gastroscópio com um canal de trabalho de 2,8 mm.
  2. Transfira as biópsias para um meio livre de soro de queratinócitos disponível comercialmente (KSFM; Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE).
    NOTA: As biópsias podem ser armazenadas no gelo por várias horas até o uso.
  3. Substitua o meio KSFM por 1 mL de Dispase I (10 U / mL) e incube as biópsias por 10 min em temperatura ambiente.
  4. Centrifugue as biópsias em temperatura ambiente a 300 x g por 2 min.
  5. Aspire o Dispase usando uma pipeta de 1000 μL sem tocar nas biópsias e no pellet de detritos celulares.
  6. Enxágue as biópsias com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS).
  7. Centrifugue as biópsias em temperatura ambiente a 300 x g por 2 min.
  8. Aspirar o sobrenadante com uma pipeta de 1000 μL.
  9. Incubar as biópsias com 500 μL de tripsina-EDTA (0,05%) a 37 °C por 10 min enquanto agita a 800 rpm.
  10. Execute a interrupção mecânica por pipetagem repetida para cima e para baixo até obter uma suspensão de célula única.
  11. Filtrar as células através de um filtro de células de 70 μm utilizando a cabeça do êmbolo de borracha de uma seringa de tuberculina.
  12. Lave o coador com 2-4 mL de inibidor de tripsina de soja (250 μg/mL).
  13. Filtre as células através de um filtro de células de 35 μm com uma tampa de encaixe em um tubo de poliestireno de fundo redondo de 5 mL.
  14. Transfira a solução de célula única para um tubo cônico de 15 mL.
  15. Centrifugue a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
  16. Aspirar o sobrenadante com uma pipeta de 1000 μL.
  17. Ressuspenda as células em 100 μL de meio KSFM.
  18. Misturar 10 μL de azul de tripano com 10 μL de suspensão celular.
  19. Conte as células usando um contador de células automatizado.

2. Cultura organoide derivada do paciente

  1. Adicione 1-2 mL de KSFM à suspensão celular após a contagem.
  2. Centrifugue a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
  3. Aspirar o sobrenadante com uma pipeta de 1000 μL sem perturbar o sedimento celular.
  4. Ressuspenda o pellet celular na matriz de hidrogel do extrato de membrana basal (BME) (40 μL de BME por 20.000 células).
    NOTA: Depois de adicionar o BME, mantenha as células no gelo para evitar a solidificação prematura do BME.
  5. Corte uma ponta de pipeta de 200 μL para aspirar a mistura viscosa de suspensão de células BME.
  6. Forme gotículas de 40 μL em uma placa de cultura de células em suspensão pré-aquecida (37 ° C).
  7. Incubar a placa sem meio durante 20-30 min a 37 °C para garantir a solidificação das gotículas de BME.
  8. Adicione meio KSFM-C pré-aquecido suplementado com 10 μM de Y27632 (inibidor de ROCK) nos primeiros dois dias de cultivo.
  9. Substitua o meio por um novo meio KSFM-C (sem Y27632 e +/- citocina de interesse) a cada dois dias.
  10. Aspire o meio e raspe as gotículas com a ponta da pipeta enquanto adiciona continuamente 1 mL de Dispase II (1,5 U / mL) ao poço.
  11. Transferir a mistura BME-dispase para um tubo de centrifugação de 15 ml e incubá-la durante 20 min a 37 °C num banho-maria agitado para digerir o BME.
  12. Centrifugar a 250 x g durante 3 min a 4 °C e aspirar o Dispase II.
  13. Proceda de acordo com o protocolo da leitura de interesse (por exemplo, isolamento de RNA, isolamento de proteína ou fixação com PFA a 4% para histologia).

3. Isolamento celular para culturas de interface ar-líquido (LPA) derivadas do paciente

  1. Obtenha as biópsias. Durante a esofagogastroduodenoscopia com gastroscópio com canal de trabalho de 2,8 mm, são realizadas duas biópsias de um segmento do esôfago com pinça de biópsia.
  2. Coloque as biópsias em meio livre de soro de queratinócitos disponível comercialmente (KSFM; Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) e armazenar em gelo por várias horas até o uso.
  3. Troque KSFM por 1 mL de Dispase (10 U/mL). Em seguida, incube as biópsias por 10 min em temperatura ambiente.
  4. Centrifugue as biópsias em temperatura ambiente a 300 x g por 2 min.
  5. Remova o Dispase usando uma pipeta de 1000 μL sem tocar nas biópsias e no pellet de detritos celulares.
  6. Lave as biópsias com 1 mL de DPBS.
  7. À temperatura ambiente, gire as biópsias a 300 x g por 2 min.
  8. Aspirar o sobrenadante com uma pipeta de 1000 μL.
  9. Incubar as biópsias em 500 μL de tripsina-EDTA (0,05%) a 37 °C por 10 min e misturar continuamente a 800 rpm durante a incubação.
  10. Interrompa as biópsias mecanicamente com pipetagem repetida para cima e para baixo até obter uma suspensão unicelular.
  11. Passe as células dissociadas através de um filtro de células de 70 μm com uma cabeça de êmbolo de borracha de uma seringa de tuberculina e recolha as células em um tubo cônico de 50 mL.
  12. Lave o filtro com 2-4 mL de inibidor de tripsina de soja (250 μg/mL) para remover as células restantes do filtro.
  13. Filtre as células com uma tampa de encaixe do filtro de células de 35 μm em um tubo de poliestireno de fundo redondo de 5 mL.
  14. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL.
  15. Centrifugue a 300 x g a 4 °C durante 5 min.
  16. Remova o sobrenadante com uma pipeta de 1.000 μL.
  17. Ressuspenda o pellet celular em 4 mL de meio KSFM (Ca2+ 0,09 mM), incluindo 10 μM Y27632.
  18. Transferir as células para um balão de cultura de células T25.
  19. Para expandir os queratinócitos primários, cultive as células até 60% -80% de confluência por aproximadamente 1 semana.
    NOTA: A passagem (P)0 forma conglomerados celulares semelhantes a ilhotas e não é uma monocamada. Os queratinócitos primários formam monocamadas a partir de P1.
  20. Passagem a 60%-80% de confluência e ressemear P1 em 2-3 frascos de cultura de células T25 ou 1-2 T75.
  21. Passagem P1 novamente quando os queratinócitos formam uma monocamada com 60%-80% de confluência.

4. Cultura de interface ar-líquido (LPA) derivada do paciente

  1. Semeie queratinócitos primários P2 em inserções transwell para a cultura ALI.
    NOTA: Semeie 400.000 células em 12 inserções de poço (200.000 queratinócitos por 0,6 cm2) em 500 μL de KSFM (Ca2 + 0,09 mM, 1 ng / mL EGF, 50 μg / mL BPE).
    1. Semeie 150.000 células em 24 inserções de poços (155.000 queratinócitos por 0,5 cm2) em 100 μL de KSFM (Ca2 + 0,09 mM, 1 ng / mL EGF, 50 μg / mL BPE).
    2. Em alternativa, congelar no meio KSFM (Ca2+ 0,09 mM + 10% DMSO) a -80 °C durante 24 h e depois transferir as células congeladas para azoto líquido para utilização posterior.
      NOTA: Ao usar frascos congelados, passe mais uma vez após o descongelamento antes de usar as células para a cultura ALI.
  2. Adicione o meio ao poço inferior abaixo da inserção da placa de cultura transwell.
    NOTA: Para placas de 12 poços: 1,5 mL de KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE). Para placas de 24 poços: 600 μL de KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE).
  3. Substitua o KSFM de cálcio médio a alto (Ca2+ 1,8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) após 2 dias.
  4. Troque o meio KSFM com alto teor de cálcio a cada dois dias até o dia 7.
  5. Realize o transporte aéreo no dia 7 aspirando o meio da câmara superior e substituindo o meio na câmara inferior por KSFM com alto teor de cálcio (Ca2+ 1,8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) contendo 10 ng/mL KGF (=FGF7), 75 μg/mL de ácido ascórbico (AA).
    1. Opcional: Adicione citocinas de interesse na concentração desejada ao meio.
  6. Troque o meio a cada dois dias até o dia 14.

5. Medição da resistência elétrica transepitelial (TEER)

  1. Esterilize o eletrodo do medidor TEER mergulhando-o em um poço de uma placa de 24 poços com hipoclorito de sódio a 5% por 10-15 min.
  2. Lave o hipoclorito de sódio a 5% imergindo o eletrodo em 4 poços subsequentes com ddH2O estéril e deixando o eletrodo secar ao ar.
  3. Defina o branco colocando um eletrodo no poço e o segundo eletrodo no inserto do poço trans, preenchendo-o com PBS e medindo o TEER.
    NOTA: Volumes recomendados para medições TEER: Para placa de 12 poços (1900 μL no poço e 900 μL no inserto). Para placa de 24 poços (750-1000 μL no poço e 250 μL no inserto).
  4. Substitua o meio das culturas ALI por PBS estéril à temperatura ambiente.
    NOTA: Remova o meio do poço inferior e, em uma segunda etapa, do inserto do transpoço. Da mesma forma, adicione PBS primeiro ao inserto e depois ao poço inferior para evitar o descolamento da cultura ALI da membrana transwell.
  5. Colocar os elétrodos do medidor TEER nos poços experimentais com culturas ALI e realizar a medição TEER1.
    NOTA: Realize medições TEER a cada dois dias antes que o meio seja trocado.

6. Fluxo macromolecular

  1. Diluir a solução-mãe de FITC-Dextrano (3-5 kDa) até uma concentração de trabalho de 1 mg/ml.
    NOTA: Sempre proteja o FITC-Dextran da exposição à luz.
  2. Preparar uma linha de diluição com uma concentração decrescente de FITC (1000 μg/ml a 0,25 μg/ml) como padrão para a leitura.
  3. Adicione 500 μL de solução de FITC-dextrano (1 mg / mL) à câmara superior do poço trans e 1,5 mL de meio (+/- citocina de interesse) no compartimento inferior e coloque a placa na incubadora.
  4. Colete 120 μL de meio do compartimento inferior nos respectivos pontos de tempo (por exemplo, 0 min, 15 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min e 180 min).
  5. Pipete duplicatas (50 μL / poço) de cada ponto de tempo em uma placa de fundo plano transparente preta de 96 poços.
  6. Excitar o FITC-dextrano a 490 nm e ler a emissão a um comprimento de onda de 520 nm utilizando um leitor de placas.
  7. Calcule a quantidade de fluxo macromolecular de acordo com o padrão.

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Resultados

Os organoides esofágicos crescerão a partir de células primárias extraídas de biópsias de pacientes de acordo com as instruções do protocolo fornecido, conforme documentado com um microscópio de campo claro invertido (Figura 1). As ASCs epiteliais começam a formar aglomerados de células de maneira auto-organizada nos primeiros dois dias de cultura após a semeadura das células isoladas no extrato da membrana basal, servindo como um andaime. O tamanho e o número de aglomerados de...

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Discussão

Os procedimentos fornecidos permitem o cultivo de organoides derivados de pacientes e culturas de LPA com altas perspectivas de sucesso. O protocolo organoide foi adaptado do primeiro protocolo publicado relatando a geração de organoides esofágicos humanos26 e de um protocolo publicado recentemente32. Sherill e colegas descreveram o modelo ALI22. Organoides e modelos de cultura de LPA auxiliam-se mutuamente no estudo do impacto de citocinas e outr...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

A concessão SNSF 310030_219210 para J.H.N. apoiou a publicação deste manuscrito sem restrições. A Figura 1 foi criada com a ajuda de BioRender.com.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1250 µL Griptip - FilterIntegra4445
300 µL Griptip - FilterIntegra4435
70 µM cell strainerSarstedt83.3945.070
Ascorbic AcidSigma-Aldrich (Merck)A4544
Bovine pituitary extractGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
Calcium chlorideSigma-Aldrich (Merck)21115
Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension culturesGreiner Bio-One7.657 185
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, PathclearR&D Systems (Bio-Techne)3532-010-02
Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience GradeCarl RothA994
Dispase ICorning354235
Dispase IISigma-Aldrich (Merck)D4693
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline  (DPBS)Sigma-Aldrich (Merck)D8537
EVE Automated Cell CounterNanoEntekEVE-MC
EVE Cell counting slideNanoEntekEVS-050
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap CapFalcon352235
Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextranSigma-Aldrich (Merck)FD4average mol wt 3000-5000
Heraeus - Megafuge  40R Thermo Fisher Scientific75004518
Human recombinant epidermal growth factorGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
Keratinocyte-SFMGibco (Thermo Fischer Scientific)17005042
Penicillin-StreptomycinGibco (Thermo Fischer Scientific)15140122
Recombinant Human KGF/FGF-7 ProteinR&D Systems (Bio-Techne)251-KG-010/CF
Screw cap tube, 15 mLSarstedt62.554.502
Single Channel EVOLVE 100-1000 µL Integra3018
Single Channel EVOLVE 20-200 µL Integra3016
Syringe 1 mL1134950
ThermoMixer CEppendorf5382000015
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)Sigma-Aldrich (Merck)T9128
Trypsin-EDTASAFC Biosciences (Merck)59418C
Y27632 dihydrochlorideTocris (Bio-Techne)1254

Referências

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