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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui viene fornito un protocollo per la coltura di organoidi esofagei umani e la coltura dell'interfaccia aria-liquido. La coltura dell'interfaccia aria-liquido degli organoidi esofagei può essere utilizzata per studiare l'impatto delle citochine sulla barriera epiteliale esofagea.

Abstract

L'epitelio squamoso dell'esofago è esposto direttamente all'ambiente, affrontando continuamente antigeni estranei, inclusi antigeni alimentari e microbi. Mantenere l'integrità della barriera epiteliale è fondamentale per prevenire le infezioni ed evitare l'infiammazione causata da antigeni innocui di origine alimentare. Questo articolo fornisce protocolli semplificati per la generazione di organoidi esofagei umani e colture di interfaccia aria-liquido da biopsie di pazienti per studiare il compartimento epiteliale dell'esofago nel contesto dell'omeostasi e della malattia tissutale. Questi protocolli sono stati pietre miliari scientifiche significative nell'ultimo decennio, descrivendo strutture tridimensionali simili a organi da cellule primarie derivate da pazienti, organoidi e colture di interfaccia aria-liquido. Offrono la possibilità di studiare la funzione di specifiche citochine, fattori di crescita e vie di segnalazione nell'epitelio esofageo all'interno di un quadro tridimensionale, mantenendo le proprietà fenotipiche e genetiche del donatore. Gli organoidi forniscono informazioni sulla microarchitettura tissutale valutando il trascrittoma e il proteoma dopo la stimolazione delle citochine. Al contrario, le colture di interfaccia aria-liquido consentono di valutare l'integrità della barriera epiteliale attraverso misure di resistenza transepiteliale (TEER) o di flusso di macromolecole. La combinazione di questi organoidi e colture di interfaccia aria-liquido è uno strumento potente per far progredire la ricerca in condizioni di barriera epiteliale esofagea compromessa.

Introduzione

L'infiammazione esofagea compromette l'integrità della barriera epiteliale 1,2,3,4,5, come osservato nell'esofagite eosinofila (EoE), una malattia infiammatoria cronica dell'esofago6-dominata da Th2. L'EoE è stata descritta per la prima volta negli anni '90 7,8 ed è prevalentemente indotta dagli antigeni alimentari 9,10,11,12,13. I sintomi più frequenti dell'EoE nella popolazione adulta sono la disfagia e l'occlusione alimentare14. Nei bambini, l'EoE si manifesta tipicamente con ritardo della crescita, rifiuto del cibo, vomito e dolore addominale15. Gli studi di associazione genomica-wide (GWAS) hanno identificato i geni di rischio EoE coinvolti nell'integrità della barriera epiteliale, spostando l'epitelio al centro della ricerca EoE 16,17,18. La trascrittomica EoE ha inoltre rivelato che un processo di differenziazione alterato e un'iperplasia reattiva della zona basale causano la compromissione della funzione di barriera dell'epitelio esofageo 3,5,19,20,21,22. La comprensione precoce del fatto che l'EoE è una malattia mediata da Th26 ha portato alla scoperta dell'IL-13 come mediatore guida disturbando l'integrità epiteliale 3,4,21,23. I sistemi sperimentali che consentono di dissecare gli effetti mediati dalle citochine sull'integrità epiteliale da compromissione intrinseca della barriera attraverso la predisposizione genetica forniscono la possibilità di studiare la complessa interazione tra le cellule immunitarie e l'epitelio nell'EoE. Gli organoidi esofagei umani e le colture di interfaccia aria-liquido (ALI) sono stati proposti come strumenti validi per analizzare le conseguenze della stimolazione delle citochine sull'integrità epiteliale5.

Il primo protocollo per la generazione di organoidi esofagei derivati da cellule staminali tessuto-specifiche (ASC) adulte è stato stabilito cinque anni dopo i primi rapporti pubblicati di organoidi intestinali nel 2009 utilizzando ASC intestinali Lgr5+ che ricapitolano il compartimento epiteliale dell'intestino tenue24. DeWard et al. sono stati i pionieri della generazione di organoidi da cellule epiteliali esofagee murine25. Nel 2018, Kasagi et al. hanno generato organoidi esofagei umani dalla linea cellulare di epitelio squamoso esofageo umano immortalizzato EPC2-hTERT e da cellule primarie derivate da pazienti26. Nello stesso anno, Zhang et al. hanno generato con successo organoidi esofagei derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Hanno delineato il significato dell'inibizione del TGFβ e della proteina morfogenetica ossea (BMP) per lo sviluppo delle cellule progenitrici esofagee (EPC) e il ruolo cruciale della segnalazione di Notch nella differenziazione dell'epitelio squamoso stratificato26,27. Trisno e colleghi hanno integrato questi risultati identificando Sox2 come un inibitore di Wnt che dirige il destino dello sviluppo verso la differenziazione esofagea28. I successivi perfezionamenti dei protocolli, della composizione del terreno e delle condizioni di coltura hanno aumentato il tasso di formazione degli organoidi e hanno reso possibile la subcoltura e il recupero degli organoidi dopo la crioconservazione 26,29,30,31,32. Sebbene questi organoidi siano potenti strumenti per studiare l'architettura tissutale e l'espressione di potenziali geni bersaglio dopo la stimolazione con citochine, gli organoidi esofagei non offrono la possibilità di misurare la resistenza transepiteliale (TEER) o il flusso di macromolecole come misure dirette per l'integrità della barriera. Come precedentemente descritto da Sherrill e colleghi22, le colture ALI che modellano la differenziazione epiteliale4 consentono valutazioni dirette dell'integrità epiteliale. La combinazione di organoidi derivati da pazienti e colture di ALI è un potente strumento per studiare l'architettura dei tessuti e l'integrità della barriera epiteliale nell'EoE.

Di seguito sono riportate le procedure con le istruzioni per isolare le cellule vitali dalle biopsie esofagee e stabilire colture di organoidi esofagei e ALI che possono essere ulteriormente utilizzate per studiare gli effetti delle citochine sull'integrità della barriera.

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Protocollo

Le procedure sono state approvate dalla commissione d'etica della Svizzera nordoccidentale e centrale (EKNZ; ID progetto 2019-00273). Tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato scritto per l'uso sperimentale delle biopsie prima dell'esame endoscopico. I reagenti e le attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Isolamento cellulare per organoidi esofagei derivati da pazienti

NOTA: Un elenco dei costituenti del terreno per la coltura di organoidi esofagei umani è fornito nella Tabella 1.

  1. Ottenere le biopsie.
    NOTA: Nel presente studio, due biopsie da un segmento dell'esofago sono state ottenute durante l'esofagogastroduodenoscopia con pinza per biopsia utilizzando un gastroscopio con un canale di lavoro da 2,8 mm.
  2. Trasferire le biopsie in un terreno privo di siero per cheratinociti disponibile in commercio (KSFM; Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE).
    NOTA: Le biopsie possono essere conservate su ghiaccio per diverse ore fino all'uso.
  3. Sostituire il terreno KSFM con 1 mL di Dispase I (10 U/mL) e incubare le biopsie per 10 minuti a temperatura ambiente.
  4. Centrifugare le biopsie a temperatura ambiente a 300 x g per 2 min.
  5. Aspirare la Dispase utilizzando una pipetta da 1000 μL senza toccare le biopsie e il pellet di detriti cellulari.
  6. Sciacquare le biopsie con 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS).
  7. Centrifugare le biopsie a temperatura ambiente a 300 x g per 2 min.
  8. Aspirare il surnatante utilizzando una pipetta da 1000 μl.
  9. Incubare le biopsie con 500 μl di tripsina-EDTA (0,05%) a 37 °C per 10 minuti agitando a 800 giri/min.
  10. Eseguire l'interruzione meccanica mediante pipettaggio ripetuto su e giù fino a ottenere una sospensione a cellula singola.
  11. Filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare da 70 μm utilizzando la testa dello stantuffo in gomma di una siringa di tubercolina.
  12. Lavare il colino con 2-4 ml di inibitore della tripsina di soia (250 μg/mL).
  13. Filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare da 35 μm con tappo a scatto su una provetta di polistirene a fondo tondo da 5 mL.
  14. Trasferire la soluzione monocellulare in una provetta conica da 15 mL.
  15. Centrifugare a 300 x g per 5 min a 4 °C.
  16. Aspirare il surnatante utilizzando una pipetta da 1000 μl.
  17. Risospendere le cellule in 100 μL di terreno KSFM.
  18. Miscelare 10 μl di blu di tripano con 10 μl di sospensione cellulare.
  19. Conta le celle utilizzando un contatore di celle automatizzato.

2. Coltura di organoidi derivati da pazienti

  1. Aggiungere 1-2 mL di KSFM alla sospensione cellulare dopo il conteggio.
  2. Centrifugare a 300 x g per 5 min a 4 °C.
  3. Aspirare il surnatante con una pipetta da 1000 μl senza disturbare il pellet cellulare.
  4. Risospendere il pellet cellulare nella matrice di idrogel di estratto di membrana basale (BME) (40 μL di BME per 20.000 cellule).
    NOTA: Dopo aver aggiunto il BME, mantenere le celle sul ghiaccio per evitare la solidificazione prematura del BME.
  5. Tagliare un puntale per pipetta da 200 μl per aspirare la miscela viscosa di sospensione di cellule BME.
  6. Formare goccioline da 40 μl in una piastra di coltura cellulare in sospensione preriscaldata (37 °C).
  7. Incubare la piastra senza terreno per 20-30 minuti a 37 °C per garantire la solidificazione delle goccioline di BME.
  8. Aggiungere un terreno KSFM-C preriscaldato integrato con 10 μM di Y27632 (inibitore di ROCK) per i primi due giorni di coltura.
  9. Sostituire il terreno con un nuovo terreno KSFM-C (senza Y27632 e +/- citochine di interesse) a giorni alterni.
  10. Aspirare il terreno e grattare via le goccioline con la punta della pipetta, aggiungendo continuamente 1 mL di Dispase II (1,5 U/mL) al pozzetto.
  11. Trasferire la miscela BME-dispasi in una provetta da centrifuga da 15 mL e incubarla per 20 minuti a 37 °C in un bagno d'acqua agitante per digerire il BME.
  12. Centrifugare a 250 x g per 3 min a 4 °C e aspirare la Dispase II.
  13. Procedere secondo il protocollo di lettura dell'interesse (ad esempio, isolamento dell'RNA, isolamento delle proteine o fissazione con PFA al 4% per l'istologia).

3. Isolamento cellulare per colture di interfaccia aria-liquido (ALI) derivate da pazienti

  1. Ottenere le biopsie. Durante l'esofagogastroduodenoscopia con un gastroscopio con un canale di lavoro da 2,8 mm, vengono prelevate due biopsie da un segmento di esofago con pinza per biopsia.
  2. Posizionare le biopsie in un terreno privo di siero per cheratinociti disponibile in commercio (KSFM; Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) e conservare in ghiaccio per diverse ore fino all'uso.
  3. Sostituire KSFM con 1 mL di Dispase (10 U/mL). Successivamente, incubare le biopsie per 10 minuti a temperatura ambiente.
  4. Centrifugare le biopsie a temperatura ambiente a 300 x g per 2 min.
  5. Rimuovere la Dispasi utilizzando una pipetta da 1000 μL senza toccare le biopsie e il pellet di detriti cellulari.
  6. Lavare le biopsie con 1 mL di DPBS.
  7. A temperatura ambiente, centrifugare le biopsie a 300 x g per 2 minuti.
  8. Aspirare il surnatante con una pipetta da 1000 μl.
  9. Incubare le biopsie in 500 μL di tripsina-EDTA (0,05%) a 37 °C per 10 minuti e mescolare continuamente a 800 giri/min durante l'incubazione.
  10. Interrompere meccanicamente le biopsie con pipettaggio ripetuto su e giù fino a ottenere una sospensione a cellula singola.
  11. Passare le cellule dissociate attraverso un filtro cellulare da 70 μm con una testa di stantuffo in gomma da una siringa di tubercolina e raccogliere le cellule in una provetta conica da 50 mL.
  12. Lavare il colino con 2-4 ml di inibitore della tripsina di soia (250 μg/mL) per rimuovere le cellule rimanenti dal colino.
  13. Filtrare le cellule con un tappo a scatto per filtro cellulare da 35 μm in una provetta di polistirene a fondo tondo da 5 mL.
  14. Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL.
  15. Centrifugare a 300 x g a 4 °C per 5 min.
  16. Rimuovere il surnatante con una pipetta da 1.000 μl.
  17. Risospendere il pellet cellulare in 4 mL di terreno KSFM (Ca2+ 0,09 mM), di cui 10 μM Y27632.
  18. Trasferire le cellule in un pallone per colture cellulari T25.
  19. Per espandere i cheratinociti primari, coltivare le cellule fino al 60%-80% di confluenza per circa 1 settimana.
    NOTA: Il passaggio (P)0 forma conglomerati cellulari simili a isole e non è un monostrato. I cheratinociti primari formano monostrati a partire da P1.
  20. Passaggio al 60%-80% di confluenza e risemina di P1 in 2-3 fiasche per colture cellulari T25 o 1-2 T75.
  21. Passaggio P1 di nuovo quando i cheratinociti formano un monostrato con confluenza del 60%-80%.

4. Coltura di interfaccia aria-liquido (ALI) derivata dal paziente

  1. Seminare i cheratinociti primari P2 su inserti transwell per la coltura ALI.
    NOTA: Seminare 400.000 cellule in 12 inserti a pozzetti (200.000 cheratinociti per 0,6 cm2) in 500 μL di KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE).
    1. Semina di 150.000 cellule in 24 inserti di pozzetti (155.000 cheratinociti per 0,5 cm2) in 100 μL di KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE).
    2. In alternativa, congelare nel terreno KSFM (Ca2+ 0,09 mM + 10% DMSO) a -80 °C per 24 ore e quindi trasferire le celle congelate in azoto liquido per un uso successivo.
      NOTA: Quando si utilizzano fiale congelate, passare ancora una volta dopo lo scongelamento prima di utilizzare le cellule per la coltura ALI.
  2. Aggiungere il terreno nel pozzetto inferiore sotto l'inserto della piastra di coltura del pozzetto.
    NOTA: Per piastre a 12 pozzetti: 1,5 mL di KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE). Per piastre a 24 pozzetti: 600 μL di KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE).
  3. Sostituire il KSFM di calcio medio-alto (Ca2+ 1,8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) dopo 2 giorni.
  4. Cambiare il terreno KSFM ad alto contenuto di calcio ogni due giorni fino al giorno 7.
  5. Eseguire il trasporto aereo il giorno 7 aspirando il terreno dalla camera superiore e sostituendo il terreno nella camera inferiore con KSFM ad alto contenuto di calcio (Ca2+ 1,8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) contenente 10 ng/mL KGF (=FGF7), 75 μg/mL di acido ascorbico (AA).
    1. Facoltativo: aggiungere al terreno la citochina di interesse alla concentrazione desiderata.
  6. Cambia il mezzo ogni due giorni fino al giorno 14.

5. Misurazione della resistenza elettrica transepiteliale (TEER)

  1. Sterilizzare l'elettrodo del misuratore TEER immergendolo in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti con ipoclorito di sodio al 5% per 10-15 minuti.
  2. Lavare via l'ipoclorito di sodio al 5% immergendo l'elettrodo in 4 pozzetti successivi con ddH2O sterile e lasciando asciugare l'elettrodo all'aria.
  3. Impostare il bianco posizionando un elettrodo nel pozzetto e il secondo elettrodo nell'inserto del pozzetto, riempiendolo di PBS e misurando il TEER.
    NOTA: Volumi consigliati per le misurazioni TEER: Per piastra da 12 pozzetti (1900 μl nel pozzetto e 900 μl nell'inserto). Per piastra a 24 pozzetti (750-1000 μl nel pozzetto e 250 μl nell'inserto).
  4. Sostituire il terreno delle colture ALI con PBS sterile a temperatura ambiente.
    NOTA: Rimuovere il fluido dal pozzetto inferiore e, in una seconda fase, dall'inserto del pozzetto trans. Allo stesso modo, aggiungere PBS prima all'inserto e poi al pozzetto inferiore per evitare il distacco della coltura di ALI dalla membrana del pozzetto.
  5. Posizionare gli elettrodi del misuratore TEER nei pozzetti sperimentali con colture ALI ed eseguire la misurazione TEER1.
    NOTA: Eseguire le misurazioni TEER ogni due giorni prima di cambiare il fluido.

6. Flusso macromolecolare

  1. Diluire la soluzione madre di FITC-destrano (3-5 kDa) a una concentrazione di lavoro di 1 mg/mL.
    NOTA: Proteggere sempre il FITC-destrano dall'esposizione alla luce.
  2. Preparare una riga di diluizione con una concentrazione FITC decrescente (da 1000 μg/mL a 0,25 μg/mL) come standard per la lettura.
  3. Aggiungere 500 μL di soluzione di FITC-destrano (1 mg/mL) nella camera superiore del pozzetto e 1,5 mL di terreno (+/- citochina di interesse) nel compartimento inferiore e posizionare la piastra nell'incubatore.
  4. Raccogliere 120 μl di terreno dallo scomparto inferiore nei rispettivi punti temporali (ad esempio, 0 min, 15 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min e 180 min).
  5. La pipetta duplica (50 μL/pozzetto) di ciascun punto temporale in una piastra nera a fondo piatto trasparente a 96 pozzetti.
  6. Eccitare il destrano FITC a 490 nm e leggere l'emissione a una lunghezza d'onda di 520 nm utilizzando un lettore di piastre.
  7. Calcolare la quantità di flusso macromolecolare secondo lo standard.

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Risultati

Gli organoidi esofagei cresceranno da cellule primarie estratte da biopsie di pazienti secondo le istruzioni del protocollo fornito, come documentato con un microscopio a campo chiaro invertito (Figura 1). Le ASC epiteliali iniziano a formare cluster cellulari in modo auto-organizzante entro i primi due giorni di coltura dopo aver seminato le cellule isolate nell'estratto della membrana basale, fungendo da impalcatura. La dimensione e il numero di cluster cellulari, evidenti con un microscop...

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Discussione

Le procedure fornite consentono la coltivazione di organoidi derivati da pazienti e colture di ALI con elevate prospettive di successo. Il protocollo degli organoidi è stato adattato dal primo protocollo pubblicato che riporta la generazione di organoidi esofagei umani26 e da un protocollo32 pubblicato di recente. Sherill e colleghi hanno descritto il modello ALI22. Gli organoidi e i modelli di coltura ALI si assistono a vicenda nello studio dell'im...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

La sovvenzione del FNS 310030_219210 a J.H.N. ha sostenuto la pubblicazione di questo manoscritto senza restrizioni. La Figura 1 è stata creata con l'aiuto di BioRender.com.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1250 µL Griptip - FilterIntegra4445
300 µL Griptip - FilterIntegra4435
70 µM cell strainerSarstedt83.3945.070
Ascorbic AcidSigma-Aldrich (Merck)A4544
Bovine pituitary extractGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
Calcium chlorideSigma-Aldrich (Merck)21115
Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension culturesGreiner Bio-One7.657 185
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, PathclearR&D Systems (Bio-Techne)3532-010-02
Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience GradeCarl RothA994
Dispase ICorning354235
Dispase IISigma-Aldrich (Merck)D4693
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline  (DPBS)Sigma-Aldrich (Merck)D8537
EVE Automated Cell CounterNanoEntekEVE-MC
EVE Cell counting slideNanoEntekEVS-050
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap CapFalcon352235
Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextranSigma-Aldrich (Merck)FD4average mol wt 3000-5000
Heraeus - Megafuge  40R Thermo Fisher Scientific75004518
Human recombinant epidermal growth factorGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
Keratinocyte-SFMGibco (Thermo Fischer Scientific)17005042
Penicillin-StreptomycinGibco (Thermo Fischer Scientific)15140122
Recombinant Human KGF/FGF-7 ProteinR&D Systems (Bio-Techne)251-KG-010/CF
Screw cap tube, 15 mLSarstedt62.554.502
Single Channel EVOLVE 100-1000 µL Integra3018
Single Channel EVOLVE 20-200 µL Integra3016
Syringe 1 mL1134950
ThermoMixer CEppendorf5382000015
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)Sigma-Aldrich (Merck)T9128
Trypsin-EDTASAFC Biosciences (Merck)59418C
Y27632 dihydrochlorideTocris (Bio-Techne)1254

Riferimenti

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