호산구성 식도염의 상피 장벽을 조사하기 위한 3차원 세포 배양 모델

요약

여기에서는 인간 식도 오가노이드 배양 및 공기-액체 계면 배양을 위한 프로토콜을 제공합니다. 식도 오가노이드의 공기-액체 계면 배양은 식도 상피 장벽에 대한 사이토카인의 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

식도의 편평 상피는 환경에 직접 노출되어 식품 항원 및 미생물을 포함한 외부 항원과 지속적으로 마주합니다. 상피 장벽의 무결성을 유지하는 것은 감염을 예방하고 무해한 식품 유래 항원으로 인한 염증을 피하는 데 매우 중요합니다. 이 기사에서는 조직 항상성 및 질병의 맥락에서 식도의 상피 구획을 연구하기 위해 환자 생검에서 인간 식도 오가노이드 및 공기-액체 계면 배양을 생성하기 위한 간소화된 프로토콜을 제공합니다. 이러한 프로토콜은 지난 10년 동안 중요한 과학적 이정표였으며, 환자 유래 일차 세포, 오가노이드 및 공기-액체 계면 배양에서 3차원 장기와 같은 구조를 설명했습니다. 그들은 3차원 프레임워크 내에서 식도 상피의 특정 사이토카인, 성장 인자 및 신호 경로의 기능을 조사하면서 기증자의 표현형 및 유전적 특성을 유지할 수 있는 가능성을 제공합니다. 오가노이드는 사이토카인 자극 후 전사체와 단백질체를 평가하여 조직 미세구조에 대한 정보를 제공합니다. 대조적으로, 공기-액체 계면 배양은 경상피 저항성(TEER) 또는 거대분자 플럭스 측정을 통해 상피 장벽 무결성을 평가할 수 있습니다. 이러한 오가노이드와 공기-액체 계면 배양을 결합하는 것은 손상된 식도 상피 장벽 상태에 대한 연구를 발전시키는 강력한 도구입니다.

서문

식도 염증은 Th2 지배 만성 식도 염증성 질환인 호산구성 식도염(EoE)에서 관찰되는 바와 같이 상피 장벽 무결성 1,2,3,4,5를 손상시킨다 6. EoE는 1990^{년대에 처음} 기술되었으며^7,8 주로 식품 항원 ^{9,10,11,12,13}에 의해 유도됩니다. 성인 인구에서 가장 빈번하게 발생하는 EoE 증상은 삼킴곤란과 음식물 매립이다¹⁴. 소아의 경우, EoE는 전형적으로 성장 부진, 음식 거부, 구토, 복통 등으로 나타난다¹⁵. 게놈 전체 연관 연구(Genome-wide association studies, GWAS)는 상피 장벽 무결성에 관여하는 EoE 위험 유전자를 식별하여 상피를 EoE 연구의 초점으로 이동시켰습니다 16,17,18. EoE 전사체학은 또한 손상된 분화 과정과 반응성 기저 영역 증식이 식도 상피 3,5,19,20,21,22의 손상된 장벽 기능을 유발한다는 것을 밝혔습니다. EoE가 Th2^{매개 질환이라는} 초기의 이해6는 상피 무결성 ^3,4,21,23을 방해함으로써 IL-13을 구동 매개체로 발견하게 되었습니다. 유전적 소인을 통한 내인적 장벽 손상에서 상피 무결성에 대한 사이토카인 매개 효과를 해부할 수 있는 실험 시스템은 EoE에서 면역 세포와 상피 사이의 복잡한 상호 작용을 연구할 수 있는 가능성을 제공합니다. 인간 식도 오가노이드 및 공기-액체 계면(ALI) 배양은 사이토카인 자극이 상피 무결성에 미치는 영향을 분석하기 위한 유용한 도구로 제안되었습니다⁵.

성체 조직 특이적 줄기세포(ASC) 유래 식도 오가노이드를 생성하기 위한 첫 번째 프로토콜은 2009년 소장의 상피 구획을 재현하는 장 Lgr5⁺ ASC를 사용하여 장 오가노이드에 대한 첫 번째 발표된 보고서 이후 5년 후에 확립되었습니다²⁴. DeWard et al.은 쥐 식도 상피 세포에서 오가노이드를 생성하는 데 앞장섰습니다²⁵. 2018년, Kasagi et al.은 불멸화된 인간 식도 편평 상피 세포주 EPC2-hTERT 및 1차 환자 유래 세포²⁶에서 인간 식도 오가노이드를 생성했습니다. 같은 해에 Zhang 등은 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 식도 오가노이드를 성공적으로 생성했습니다. 그들은 식도 전구 세포(EPC) 발달에 대한 TGFβ 및 뼈 형태 형성 단백질(BMP) 억제의 중요성과 층화 편평 상피^26,27의 분화에서 Notch 신호의 중요한 역할을 설명했습니다. 트리스노(Trisno)와 동료들은 Sox2를 식도 분화(esophageal differentiation)로 발달 운명을 이끄는 Wnt 억제제(inhibitor)로 확인함으로써 이러한 발견을 보완했다²⁸. 프로토콜, 배지 조성 및 배양 조건의 후속 개선으로 오가노이드 형성 속도가 증가하고 동결 보존 후 오가노이드를 하위 배양 및 회수할 수 있게 되었습니다 26,29,30,31,32. 이러한 오가노이드는 사이토카인으로 자극한 후 조직 구조와 잠재적 표적 유전자의 발현을 연구하기 위한 강력한 도구이지만, 식도 오가노이드는 장벽 무결성에 대한 직접적인 측정으로 경상피 저항성(TEER) 또는 거대분자 플럭스를 측정할 수 있는 가능성을 제공하지 않습니다. Sherrill과 동료들에 의해 이전에 기술된^{바와 같이22}, 상피 분화(epithelial differentiation⁾⁴를 모델링하는 ALI 배양은 상피 무결성(epithelial integrity)에 대한 직접적인 평가를 가능하게 한다. 환자 유래 오가노이드와 ALI 배양을 결합하는 것은 EoE에서 조직 구조와 상피 장벽 무결성을 조사하기 위한 강력한 도구입니다.

다음은 식도 생검에서 생존 가능한 세포를 분리하고 사이토카인이 장벽 무결성에 미치는 영향을 추가로 연구하는 데 사용할 수 있는 식도 오가노이드 및 ALI 배양을 확립하기 위한 지침이 포함된 절차입니다.

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프로토콜

이 절차는 북서부 및 중부 스위스 윤리 위원회(EKNZ; 프로젝트 ID 2019-00273). 모든 환자는 내시경 검사 전에 생검의 실험적 사용에 대한 서면 동의서를 제공했습니다. 연구에 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 환자 유래 식도 오가노이드를 위한 세포 분리

참고: 인간 식도 오가노이드를 배양하기 위한 배지 성분 목록은 표 1에 나와 있습니다.

1. 생검을 받습니다.
   참고: 본 연구에서는 작동 채널이 2.8mm인 위내시경을 사용하여 생검 겸자를 사용한 식도 위십이지장 내시경 검사 중에 한 식도 분절에서 두 번의 생검을 얻습니다.
2. 생검을 시판되는 각질세포 무혈청 배지(KSFM; Ca²⁺ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE).
   알림: 생검은 사용할 때까지 몇 시간 동안 얼음에 보관할 수 있습니다.
3. KSFM 배지를 1mL의 Dispase I(10U/mL)로 교체하고 실온에서 10분 동안 생검을 배양합니다.
4. 300 x g 의 실온에서 2분 동안 생검을 원심분리합니다.
5. 생검과 세포 파편 펠릿을 건드리지 않고 1000μL 피펫을 사용하여 Dipase를 흡입합니다.
6. 1mL Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 생검을 헹굽니다.
7. 300 x g 의 실온에서 2분 동안 생검을 원심분리합니다.
8. 1000μL 피펫을 사용하여 상층액을 흡입합니다.
9. 800rpm에서 흔들면서 37°C에서 10분 동안 500μL의 Trypsin-EDTA(0.05%)로 생검을 배양합니다.
10. single-cell suspension이 얻어질 때까지 반복적인 up-down 피펫팅을 통해 기계적 파괴를 수행합니다.
11. 투베르쿨린 주사기의 고무 플런저 헤드를 사용하여 70μm 세포 여과기를 통해 세포를 여과합니다.
12. 2-4mL의 대두 트립신 억제제(250μg/mL)로 여과기를 세척합니다.
13. 5mL 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브의 스냅온 캡이 있는 35μm 세포 여과기를 통해 세포를 여과합니다.
14. 단일 셀 용액을 15mL 코니컬 튜브에 옮깁니다.
15. 300 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다.
16. 1000μL 피펫을 사용하여 상층액을 흡입합니다.
17. 100 μL의 KSFM 배지에 셀을 재현탁시킵니다.
18. 트리판 블루 10μL와 세포 현탁액 10μL를 혼합합니다.
19. 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 세십시오.

2. 환자 유래 오가노이드 배양

1. 계수 후 세포 현탁액에 1-2mL의 KSFM을 추가합니다.
2. 300 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다.
3. 세포 펠릿을 방해하지 않고 1000μL 피펫으로 상층액을 흡입합니다.
4. 기저막 추출물(BME) 하이드로겔 매트릭스(20,000개 세포당 40μL의 BME)에서 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.
   알림: BME를 추가한 후에는 BME의 조기 응고를 방지하기 위해 셀을 얼음 위에 두십시오.
5. 200μL 피펫 팁을 절단하여 점성이 있는 BME-세포 현탁액 혼합물을 흡입합니다.
6. 예열된(37°C) 현탁 세포 배양 플레이트에서 40μL 방울을 형성합니다.
7. BME 방울의 응고를 보장하기 위해 37°C에서 20-30분 동안 배지 없이 플레이트를 배양합니다.
8. 배양 첫 2일 동안 10μM의 Y27632(ROCK-inhibitor)가 보충된 사전 예열된 KSFM-C 배지를 추가합니다.
9. 이틀에 한 번씩 새로운 KSFM-C 배지(Y27632 및 관심 +/- 사이토카인 제외)로 교체합니다.
10. 배지를 흡입하고 피펫 팁으로 액적을 긁어내면서 1mL의 Dispase II(1.5U/mL)를 웰에 지속적으로 추가합니다.
11. BME-dispase 혼합물을 15mL 원심분리 튜브에 옮기고 진탕수 수조에서 37°C에서 20분 동안 배양하여 BME를 분해합니다.
12. 250 x g 에서 4 °C에서 3 분 동안 원심 분리하고 Dispase II를 흡입합니다.
13. 관심 판독의 프로토콜에 따라 진행합니다(예: RNA 분리, 단백질 분리 또는 조직학을 위한 4% PFA로 고정).

3. 환자 유래 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양을 위한 세포 분리

1. 생검을 받습니다. 2.8mm의 작동 채널이 있는 위내시경을 사용하는 식도 십이지장 내시경 검사에서는 생검 겸자를 사용하여 한 식도 분절에서 두 번의 생검을 수행합니다.
2. 생검을 시판되는 무혈청 세포(KSFM; Ca²⁺ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) 사용할 때까지 몇 시간 동안 얼음에 보관하십시오.
3. KSFM을 Dispase 1mL(10U/mL)와 교환합니다. 그 후, 실온에서 10분 동안 생검을 배양합니다.
4. 300 x g의 실온에서 2분 동안 생검을 원심분리합니다.
5. 생검 및 세포 파편 펠릿을 건드리지 않고 1000μL 피펫을 사용하여 Distase를 제거합니다.
6. 1mL의 DPBS로 생검을 세척합니다.
7. 실온에서 300 x g 에서 2분 동안 생검을 회전시킵니다.
8. 1000μL 피펫으로 상층액을 흡입합니다.
9. 생검을 37°C에서 500μL의 Trypsin-EDTA(0.05%)에 10분 동안 배양하고 배양 중에 800rpm에서 계속 혼합합니다.
10. single-cell suspension이 얻어질 때까지 반복적인 up-and down pipetting으로 생검을 기계적으로 중단시킵니다.
11. 해리된 세포를 투베르쿨린 주사기의 고무 플런저 헤드가 있는 70μm 세포 여과기에 통과시키고 50mL 원뿔형 튜브에 세포를 수집합니다.
12. 스트레이너를 2-4mL의 대두 트립신 억제제(250μg/mL)로 세척하여 스트레이너에서 남은 세포를 제거합니다.
13. 35μm 세포 스트레이너 스냅 캡으로 세포를 5mL의 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브에 여과합니다.
14. 세포를 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
15. 4 °C에서 300 x g 으로 5분 동안 원심분리합니다.
16. 1,000μL 피펫으로 상층액을 제거합니다.
17. 10 μM Y27632를 포함하여 4 mL의 KSFM 배지(Ca²⁺ 0.09 mM)에 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.
18. 세포를 T25 세포 배양 플라스크에 옮깁니다.
19. 원발성 각질세포를 확장하려면 약 1주일 동안 60%-80% 밀도가 될 때까지 세포를 배양합니다.
    참고: 통로 (P)0은 섬과 같은 세포 복합체를 형성하며 단층이 아닙니다. 일차 각질세포는 P1부터 단층을 형성합니다.
20. 60%-80% 밀도로 통과하고 2-3 T25 또는 1-2 T75 세포 배양 플라스크에서 P1을 재파종합니다.
21. 각질 형성 세포가 60%-80%의 밀도를 가진 단층을 형성할 때 다시 P1 통로.

4. 환자 유래 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양

1. ALI 배양을 위해 P2 1차 각질세포를 트랜스웰 삽입체에 파종합니다.
   참고: 500 μL의 KSFM(Ca²⁺ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE)에 12개의 웰 인서트(0.6cm²당 200,000개의 각질세포)에 400,000개의 세포를 파종합니다.
   1. 100 μL의 KSFM (Ca^{2 +} 0.09 mM, 1 ng / mL EGF, 50 μg / mL BPE)에 24 개의 웰 삽입 (0.5cm² 당 155,000 개의 각질 형성 세포)에 150,000 개의 세포를 파종합니다.
   2. 또는 -80°C의 KSFM 배지(Ca²⁺ 0.09 mM + 10% DMSO)에서 24시간 동안 동결한 후 동결된 세포를 액체 질소로 옮겨 나중에 사용할 수 있습니다.
      참고: 냉동 바이알을 사용하는 경우 해동 후 ALI 배양에 세포를 사용하기 전에 한 번 더 통과시키십시오.
2. 트랜스웰 배양 플레이트의 삽입물 아래에 있는 하단 웰에 배지를 추가합니다.
   참고: 12웰 플레이트: KSFM 1.5mL(Ca²⁺ 0.09mM, 1ng/mL EGF, 50μg/mL BPE). 24웰 플레이트: KSFM 600 μL(Ca²⁺ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE).
3. 중칼슘에서 고칼슘 KSFM(Ca²⁺ 1.8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE)을 2일 후에 교체합니다.
4. 고칼슘 KSFM 배지를 7일까지 이틀에 한 번씩 교체하십시오.
5. 상부 챔버에서 배지를 흡인하고 하부 챔버의 배지를 10ng/mL KGF(=FGF7), 75μg/mL 아스코르브산(AA)을 함유하는 고칼슘 KSFM(Ca²⁺ 1.8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE)으로 교체하여 7일차에 공수를 수행합니다.
   1. 선택 사항: 원하는 농도의 관심 사이토카인을 배지에 추가합니다.
6. 14일째까지 이틀에 한 번씩 매체를 교체하십시오.

5. 경상피 전기 저항(TEER) 측정

1. TEER 미터의 전극을 24% 차아염소산나트륨이 있는 5웰 플레이트의 웰에 10-15분 동안 담가 멸균합니다.
2. 멸균 ddH₅O가 있는 4개의 하위 웰에 전극을 담그고 전극을 공기 중에서 건조시켜 2% 차아염소산나트륨을 씻어냅니다.
3. 웰에 하나의 전극을 배치하고 두 번째 전극을 트랜스웰 인서트에 배치하고 PBS로 채우고 TEER를 측정하여 블랭크를 설정합니다.
   참고: TEER 측정을 위한 권장 용량: 12웰 플레이트(웰에서 1900 μL, 인서트에서 900 μL). 24웰 플레이트용(웰에서 750-1000 μL, 인서트에서 250 μL).
4. ALI 배양액의 배지를 실온 멸균 PBS로 교체합니다.
   알림: 하단 웰에서 매체를 제거하고 두 번째 단계에서 트랜스웰 인서트에서 제거합니다. 마찬가지로, PBS를 먼저 인서트에 추가한 다음 하단 웰에 추가하여 트랜스웰 멤브레인에서 ALI 배양액이 분리되는 것을 방지합니다.
5. ALI 배양이 있는 실험용 웰에 TEER 미터 전극을 배치하고 TEER 측정¹을 수행합니다.
   알림: 매체를 교체하기 전에 이틀에 한 번씩 TEER 측정을 수행하십시오.

6. 고분자 플럭스

1. FITC-덱스트란(3-5kDa) 원액을 1mg/mL 농도로 희석합니다.
   알림: 항상 FITC-Dextran을 빛에 노출되지 않도록 보호하십시오.
2. 판독을 위한 표준으로 FITC 농도가 감소(1000 μg/mL - 0.25 μg/mL)하는 희석 행을 준비합니다.
3. 500μL의 FITC-dextran 용액(1mg/mL)을 트랜스웰의 상부 챔버에 추가하고 1.5mL 배지(+/- 관심 사이토카인)를 하부 구획에 넣고 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다.
4. 각 시점(예: 0분, 15분, 30분, 60분, 90분, 120분, 150분, 180분)에 하부 구획에서 120μL의 매체를 수집합니다.
5. 피펫은 각 시점의 복제(50 μL/웰)를 검은색 96웰 투명한 평평한 바닥 플레이트에 넣습니다.
6. 490nm에서 FITC-dextran을 여기시키고 플레이트 리더를 사용하여 520nm의 파장에서 방출을 판독합니다.
7. 표준에 따라 고분자 플럭스의 양을 계산하십시오.

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결과

식도 오가노이드는 도립 명시야 현미경으로 문서화된 대로 제공된 프로토콜의 지침에 따라 환자 생검에서 추출한 일차 세포에서 자랍니다(그림 1). 상피 ASC는 분리된 세포를 기저막 추출물에 파종한 후 배양 후 처음 2일 이내에 자기 조직화 방식으로 세포 클러스터를 형성하기 시작하여 골격 역할을 합니다. 도립 명시야 현미경으로 눈에 띄는 세포 클러스터의 크기와 수는 ?...

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토론

제공된 절차를 통해 성공 가능성이 높은 환자 유래 오가노이드 및 ALI 배양을 할 수 있습니다. 오가노이드 프로토콜은 인간 식도 오가노이드²⁶의 생성을 보고하는 첫 번째 발표된 프로토콜과 최근에 발표된 프로토콜³²에서 채택되었습니다. Sherill과 동료들은 ALI 모델²²를 설명했습니다. 오가노이드 및 ALI 배양 모델은 EoE ^5,26<...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1250 µL Griptip - Filter	Integra	4445
300 µL Griptip - Filter	Integra	4435
70 µM cell strainer	Sarstedt	83.3945.070
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich (Merck)	A4544
Bovine pituitary extract	Gibco (Thermo Fischer Scientific)	3700015
Calcium chloride	Sigma-Aldrich (Merck)	21115
Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures	Greiner Bio-One	7.657 185
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear	R&D Systems (Bio-Techne)	3532-010-02
Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade	Carl Roth	A994
Dispase I	Corning	354235
Dispase II	Sigma-Aldrich (Merck)	D4693
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline  (DPBS)	Sigma-Aldrich (Merck)	D8537
EVE Automated Cell Counter	NanoEntek	EVE-MC
EVE Cell counting slide	NanoEntek	EVS-050
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Falcon	352235
Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran	Sigma-Aldrich (Merck)	FD4	average mol wt 3000-5000
Heraeus - Megafuge  40R	Thermo Fisher Scientific	75004518
Human recombinant epidermal growth factor	Gibco (Thermo Fischer Scientific)	3700015
Keratinocyte-SFM	Gibco (Thermo Fischer Scientific)	17005042
Penicillin-Streptomycin	Gibco (Thermo Fischer Scientific)	15140122
Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein	R&D Systems (Bio-Techne)	251-KG-010/CF
Screw cap tube, 15 mL	Sarstedt	62.554.502
Single Channel EVOLVE 100-1000 µL	Integra	3018
Single Channel EVOLVE 20-200 µL	Integra	3016
Syringe 1 mL		1134950
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000015
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)	Sigma-Aldrich (Merck)	T9128
Trypsin-EDTA	SAFC Biosciences (Merck)	59418C
Y27632 dihydrochloride	Tocris (Bio-Techne)	1254