JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

ここでは、ヒト食道オルガノイドの培養と気液界面培養のプロトコールを提供します。食道オルガノイドの気液界面培養は、サイトカインが食道上皮バリアに及ぼす影響を研究するために使用できます。

要約

食道の扁平上皮は環境に直接さらされ、食物抗原や微生物などの外来抗原に絶えず直面しています。上皮バリアの完全性を維持することは、感染を予防し、無害な食品由来抗原によって引き起こされる炎症を避けるために重要です。この記事では、患者の生検からヒト食道オルガノイドおよび気液界面培養物を生成するための簡略化されたプロトコルを提供し、組織の恒常性と疾患の文脈で食道の上皮コンパートメントを研究します。これらのプロトコルは、過去10年間で重要な科学的マイルストーンであり、患者由来の初代細胞、オルガノイド、および気液界面培養からの3次元臓器様構造を記述しています。彼らは、ドナーの表現型および遺伝的特性を維持しながら、食道上皮における特定のサイトカイン、成長因子、およびシグナル伝達経路の機能を三次元フレームワーク内で調査する可能性を提供します。オルガノイドは、サイトカイン刺激後のトランスクリプトームとプロテオームを評価することにより、組織の微細構造に関する情報を提供します。対照的に、気液界面培養では、経上皮抵抗性(TEER)または高分子フラックス測定を通じて上皮バリアの完全性を評価できます。これらのオルガノイドと気液界面培養を組み合わせることで、食道上皮バリア障害疾患の研究を進めるための強力なツールとなります。

概要

食道の炎症は、Th2優位の食道の慢性炎症性疾患である好酸球性食道炎(EoE)で観察されるように、上皮バリアの完全性1,2,3,4,5を損なう6。EoEは1990年代に初めて報告され7,8、主に食物抗原9,10,11,12,13によって誘導されます。成人集団で最も頻繁に発生するEoEの症状は、嚥下障害と食物宿便です14。小児では、EoEは通常、成長の失敗、食物拒否、嘔吐、および腹痛を伴って現れます15。ゲノムワイド関連解析(GWAS)により、上皮バリアの完全性に関与するEoEリスク遺伝子が特定され、上皮がEoE研究の焦点となっている16,17,18。さらに、EoEトランスクリプトミクスは、分化過程の障害と反応性基底帯過形成が食道上皮のバリア機能の低下を引き起こすことを明らかにしました3,5,19,20,21,22。EoEがTh2媒介性疾患であるという初期の理解6は、上皮の完全性を乱すことによる駆動メディエーターとしてのIL-13の発見につながった3,4,21,23。遺伝的素因を通じて、内因性バリア障害から上皮の完全性に対するサイトカイン媒介性の影響を解剖できる実験システムは、EoEにおける免疫細胞と上皮との間の複雑な相互作用を研究する可能性を提供します。ヒト食道オルガノイドと気液界面(ALI)培養物は、サイトカイン刺激が上皮完全性に及ぼす影響を分析するための貴重なツールとして提案されています5。

成体組織特異的幹細胞(ASC)由来の食道オルガノイドを作製するための最初のプロトコルは、2009年に腸オルガノイドの最初の発表報告から5年後に確立され、腸内Lgr5+ ASCを使用して小腸の上皮コンパートメントを再現した24。DeWardらは、マウスの食道上皮細胞からオルガノイドを作製する先駆者となった25。2018年、笠木らは、不死化ヒト食道扁平上皮細胞株EPC2-hTERTおよび初代患者由来細胞からヒト食道オルガノイドを作製した26。同年、Zhangらは人工多能性幹細胞(iPSC)由来の食道オルガノイドの作製に成功しました。彼らは、食道前駆細胞(EPC)の発生に対するTGFβおよび骨形態形成タンパク質(BMP)阻害の重要性と、層状扁平上皮の分化におけるNotchシグナル伝達の重要な役割を描写しました26,27。Trisnoらは、Sox2を、発生の運命を食道分化に導くWnt阻害剤として同定することで、これらの知見を補完した28。その後のプロトコル、培地組成、および培養条件の改良により、オルガノイドの形成速度が増加し、凍結保存後のオルガノイドの継代および回収が可能になりました26,29,30,31,32。これらのオルガノイドは、サイトカインによる刺激後の組織構造と潜在的な標的遺伝子の発現を研究するための強力なツールですが、食道オルガノイドは、バリア完全性の直接的な尺度として経上皮耐性(TEER)または高分子フラックスを測定する可能性を提供しません。Sherrillら22が以前に述べたように、上皮分化をモデル化するALI培養4は、上皮の完全性を直接評価することを可能にする。患者由来オルガノイドとALI培養物を組み合わせることは、EoEにおける組織構造と上皮バリアの完全性を研究するための強力なツールです。

ここでは、食道生検から生存細胞を単離し、サイトカインがバリアインテグリティに及ぼす影響をさらに研究するために使用できる食道オルガノイドおよびALI培養を確立するための手順を示します。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

この手続きは、北西および中央スイスの倫理委員会(EKNZ;Project-ID 2019-00273)。すべての患者は、内視鏡検査の前に生検の実験的使用について書面によるインフォームドコンセントを提供しました。この試験で使用された試薬および機器は、 材料表に記載されています。

1. 患者由来の食道オルガノイドの細胞単離

注:ヒト食道オルガノイドを培養するための培地成分のリストを 表1に示します。

  1. 生検を取得します。
    注: 本研究では、2.8 mm のワーキング チャネルを備えた胃鏡を使用して、生検鉗子を使用した食道胃十二指腸内視鏡検査中に、1 つの食道セグメントから 2 つの生検が取得されます。
  2. 生検を市販のケラチノサイト無血清培地(KSFM;Ca2+ 0.09 mM、1 ng/mL EGF、50 μg/mL BPE)。
    注:生検は、使用まで数時間氷上に保存できます。
  3. KSFM培地を1 mLのディスパーゼI(10 U/mL)と交換し、生検を室温で10分間インキュベートします。
  4. 生検を室温で300 x g で2分間遠心分離します。
  5. 1000 μLピペットを使用して、生検や細胞破片ペレットに触れずにディスパーゼを吸引します。
  6. 生検を1mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)ですすいでください。
  7. 生検を室温で300 x g で2分間遠心分離します。
  8. 1000 μLピペットを使用して上清を吸引します。
  9. 800 rpmで振とうしながら、500 μLのトリプシン-EDTA(0.05%)と37°Cで10分間、生検をインキュベートします。
  10. 単一細胞懸濁液が得られるまで、ピペッティングの上下を繰り返すことにより、機械的な破壊を行います。
  11. ツベルクリンシリンジのゴム製プランジャーヘッドを使用して、70 μmのセルストレーナーで細胞をろ過します。
  12. ストレーナーを2〜4 mLの大豆トリプシン阻害剤(250 μg / mL)で洗浄します。.
  13. 5 mLの丸底ポリスチレンチューブにスナップオンキャップを取り付けた35 μmセルストレーナーで細胞をろ過します。
  14. シングルセル溶液を15 mLのコニカルチューブに移します。
  15. 300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
  16. 1000 μLピペットを使用して上清を吸引します。
  17. 細胞を100 μLのKSFM培地に再懸濁します。
  18. 10 μLのトリパンブルーと10 μLの細胞懸濁液を混合します。
  19. 自動セルカウンターを使用してセルをカウントします。

2. 患者由来のオルガノイド培養

  1. カウント後、1〜2 mLのKSFMを細胞懸濁液に加えます。
  2. 300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
  3. 細胞ペレットを乱さずに1000μLピペットで上清を吸引します。
  4. 細胞ペレットを基底膜抽出物(BME)ハイドロゲルマトリックス(20,000細胞あたり40μLのBME)に再懸濁します。
    注:BMEを追加した後は、BMEの早期固化を防ぐために、セルを氷上に保ちます。
  5. 200 μLのピペットチップを切り取り、粘性のあるBME細胞懸濁液混合物を吸引します。
  6. 予熱した(37°C)浮遊細胞培養プレートで40μLの液滴を形成します。
  7. 培地なしでプレートを37°Cで20〜30分間インキュベートし、BME液滴が固まるようにします。
  8. 培養の最初の2日間、10 μMのY27632(ROCK阻害剤)を添加した予熱したKSFM-C培地を添加します。
  9. 1日おきに、培地を新しいKSFM-C培地(Y27632および目的の+/-サイトカインを含まない)と交換してください。
  10. 培地を吸引し、ピペットチップで液滴を掻き取りながら、1 mLのディスパーゼII(1.5 U/mL)をウェルに連続的に加えます。
  11. BMEディスパーゼ混合物を15 mLの遠心分離チューブに移し、37°Cで20分間インキュベートし、BMEを消化します。
  12. 250 x g で4°Cで3分間遠心分離し、ディスパーゼIIを吸引します。
  13. 目的の読み出しのプロトコルに従って進行します(例:RNA単離、タンパク質単離、または組織学のための4%PFAによる固定)。

3. 患者由来の気液界面(ALI)培養のための細胞単離

  1. 生検を取得します。2.8 mm のワーキング チャネルを備えた胃鏡を使用した食道胃十二指腸内視鏡検査では、生検鉗子を使用して 1 つの食道セグメントから 2 つの生検が行われます。
  2. 生検を市販のケラチノサイト無血清培地(KSFM;Ca2+ 0.09 mM、1 ng/mL EGF、50 μg/mL BPE)を使用し、使用するまで数時間氷上に保存します。
  3. KSFMを1 mLのディスパーゼ(10 U/mL)と交換します。その後、生検を室温で10分間インキュベートします。
  4. 生検を室温で300 x gで2分間遠心分離します。
  5. 1000 μLピペットを使用して、生検や細胞破片ペレットに触れずにディスパーゼを取り出します。
  6. 生検を1mLのDPBSで洗浄します。
  7. 室温で、生検を300 x g で2分間スピンダウンします。
  8. 上清を1000μLのピペットで吸引します。
  9. 生検を500 μLのトリプシン-EDTA(0.05%)で37°Cで10分間インキュベートし、インキュベーション中に800 rpmで連続的に混合します。
  10. 単一細胞懸濁液が得られるまで、ピペッティングを繰り返して生検を機械的に中断します。
  11. 解離した細胞を、ツベルクリンシリンジのゴム製プランジャーヘッドを備えた70μmのセルストレーナーに通し、細胞を50mLのコニカルチューブに集めます。
  12. ストレーナーを2〜4mLの大豆トリプシン阻害剤(250μg / mL)で洗浄し、残りの細胞をストレーナーから取り出します。
  13. 35 μmのセルストレーナースナップキャップで細胞を5 mLの丸底ポリスチレンチューブにろ過します。
  14. 細胞を15mLのコニカルチューブに移します。
  15. 300 x g 、4°C、5分間遠心分離します。
  16. 1,000 μLのピペットで上清を取り除きます。
  17. 細胞ペレットを10 μM Y27632を含む4 mLのKSFM培地(Ca2+ 0.09 mM)に再懸濁します。
  18. 細胞をT25細胞培養フラスコに移します。
  19. 初代ケラチノサイトを増殖させるために、細胞を60%〜80%のコンフルエント度になるまで約1週間培養します。
    注:継代(P)0は膵島様の細胞コングロマリットを形成し、単層ではありません。初代ケラチノサイトは、P1以降に単層を形成します。
  20. 60%-80%のコンフルエントで継代し、2-3 T25または1-2 T75細胞培養フラスコでP1を再播種します。
  21. ケラチノサイトが60%〜80%のコンフルエントで単層を形成するときに、再びP1を通過します。

4. 患者由来の気液界面(ALI)培養

  1. P2初代ケラチノサイトをALI培養用のトランズウェルインサートに播種します。
    注:500 μLのKSFM(Ca2+ 0.09 mM、1 ng / mL EGF、50 μg / mL BPE)中の12ウェルインサート(0.6 cm2あたり200,000ケラチノサイト)に400,000細胞を播種します。
    1. 100 μL の KSFM (Ca2+ 0.09 mM、1 ng/mL EGF、50 μg/mL BPE) 中の 24 ウェルインサート (0.5 cm2 あたり 155,000 ケラチノサイト) に 150,000 個の細胞を播種します。
    2. あるいは、KSFM培地(Ca2+ 0.09 mM + 10% DMSO)で-80°Cで24時間凍結し、凍結した細胞を液体窒素に移して後で使用します。
      注:凍結バイアルを使用する場合は、解凍後にもう一度継代してから、ALI培養用の細胞を使用してください。
  2. トランズウェル培養プレートのインサートの下の下部ウェルに培地を加えます。
    注:12ウェルプレートの場合:1.5 mLのKSFM(Ca2 + 0.09 mM、1 ng / mL EGF、50 μg / mL BPE)。24ウェルプレートの場合:600 μLのKSFM(Ca2+ 0.09 mM、1 ng/mL EGF、50 μg/mL BPE)。
  3. 2日後に中程度から高カルシウムKSFM(Ca2+ 1.8 mM、1 ng / mL EGF、50 μg / mL BPE)を交換します。.
  4. 高カルシウムKSFM培地は、7日目まで隔日で交換してください。
  5. 7日目に上部チャンバーから培地を吸引し、下部チャンバー内の培地を10 ng/mL KGF(= FGF7)、75 μg/mL アスコルビン酸(AA)を含む高カルシウムKSFM(Ca2+ 1.8 mM、1 ng / mL EGF、50 μg / mL BPE)に交換して空輸を行います。
    1. オプション:目的のサイトカインを目的の濃度で培地に加えます。
  6. 14日目まで2日おきに媒体を交換してください。

5. 経上皮電気抵抗(TEER)測定

  1. TEERメーターの電極を5%次亜塩素酸ナトリウムを入れた24ウェルプレートのウェルに10〜15分間浸して滅菌します。
  2. 滅菌ddH2Oで電極を4つのサブシーケンシャルウェルに浸し、電極を空気乾燥させて、5%次亜塩素酸ナトリウムを洗い流します。
  3. 1つの電極をウェルに、もう1つの電極をトランズウェルインサートに配置し、PBSを充填してTEERを測定して、ブランクをセットします。
    注:TEER測定の推奨容量:12ウェルプレートの場合(ウェルに1900μL、インサートに900μL)。24ウェルプレート用(ウェルに750-1000μL、インサートに250μL)。
  4. ALI培養液を室温滅菌PBSと交換します。
    注:培地を下のウェルから取り出し、2番目のステップでトランズウェルインサートから取り出します。同様に、最初にPBSをインサートに加え、次に下部ウェルにPBSを添加して、ALI培養物がトランズウェル膜から剥離するのを防ぎます。
  5. ALI培養物を用いた実験井戸にTEERメーター電極を配置し、TEER測定1を行います。
    注意: 媒体を交換する前に、2日おきにTEER測定を実行してください。

6. 高分子フラックス

  1. FITC-デキストラン(3-5 kDa)ストック溶液を1 mg/mLの濃度に希釈します。
    注:FITC-Dextranは常に光にさらされないように保護してください。.
  2. 読み出しの標準試料として、FITC濃度を減少させる(1000 μg/mL〜0.25 μg/mL)希釈列を調製します。
  3. 500 μL の FITC-デキストラン溶液 (1 mg/mL) をトランズウェルの上部チャンバーに加え、1.5 mL の培地 (+/- 目的のサイトカイン) を下部コンパートメントに加え、プレートをインキュベーターに入れます。
  4. 下部コンパートメントからそれぞれの時点(0分、15分、30分、60分、90分、120分、150分、180分など)で120μLの培地を回収します。
  5. ピペットは、各タイムポイントを黒色の96ウェル透明平底プレートに複製(50 μL/ウェル)します。
  6. FITC-デキストランを490 nmで励起し、プレートリーダーを使用して520 nmの波長で発光を読み取ります。
  7. 標準に従って高分子フラックスの量を計算します。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

食道オルガノイドは、倒立明視野顕微鏡で文書化されたように、提供されたプロトコルの指示に従って、患者の生検から抽出された初代細胞から増殖します(図1)。上皮ASCは、単離された細胞を基底膜抽出物に播種した後、培養の最初の2日以内に自己組織化的に細胞クラスターを形成し始め、足場として機能します。細胞クラスターのサイズと数は、倒立明視野顕微鏡で...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

提供される手順により、患者由来のオルガノイドとALI培養の培養が可能になり、成功の見込みが高いです。オルガノイドプロトコルは、ヒト食道オルガノイド26の生成を報告した最初に公開されたプロトコルから、および最近発表されたプロトコル32から適応された。Sherill氏らは、ALIモデル22について説明しました。オルガノイドとALI培養...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

SNSFのJ.H.N.への助成金310030_219210は、この原稿の出版を制限なく支援しました。 図 1 は、BioRender.com の助けを借りて作成されました。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1250 µL Griptip - FilterIntegra4445
300 µL Griptip - FilterIntegra4435
70 µM cell strainerSarstedt83.3945.070
Ascorbic AcidSigma-Aldrich (Merck)A4544
Bovine pituitary extractGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
Calcium chlorideSigma-Aldrich (Merck)21115
Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension culturesGreiner Bio-One7.657 185
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, PathclearR&D Systems (Bio-Techne)3532-010-02
Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience GradeCarl RothA994
Dispase ICorning354235
Dispase IISigma-Aldrich (Merck)D4693
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline  (DPBS)Sigma-Aldrich (Merck)D8537
EVE Automated Cell CounterNanoEntekEVE-MC
EVE Cell counting slideNanoEntekEVS-050
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap CapFalcon352235
Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextranSigma-Aldrich (Merck)FD4average mol wt 3000-5000
Heraeus - Megafuge  40R Thermo Fisher Scientific75004518
Human recombinant epidermal growth factorGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
Keratinocyte-SFMGibco (Thermo Fischer Scientific)17005042
Penicillin-StreptomycinGibco (Thermo Fischer Scientific)15140122
Recombinant Human KGF/FGF-7 ProteinR&D Systems (Bio-Techne)251-KG-010/CF
Screw cap tube, 15 mLSarstedt62.554.502
Single Channel EVOLVE 100-1000 µL Integra3018
Single Channel EVOLVE 20-200 µL Integra3016
Syringe 1 mL1134950
ThermoMixer CEppendorf5382000015
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)Sigma-Aldrich (Merck)T9128
Trypsin-EDTASAFC Biosciences (Merck)59418C
Y27632 dihydrochlorideTocris (Bio-Techne)1254

参考文献

  1. Wu, L., et al. Filaggrin and tight junction proteins are crucial for IL-13-mediated esophageal barrier dysfunction. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 315 (3), G341-G350 (2018).
  2. Davis, B. P., et al. Eosinophilic esophagitis-linked calpain 14 is an IL-13-induced protease that mediates esophageal epithelial barrier impairment. JCI Insight. 1 (4), e86355(2016).
  3. Blanchard, C., et al. Coordinate interaction between IL-13 and epithelial differentiation cluster genes in eosinophilic esophagitis. J Immunol. 184 (7), 4033-4041 (2010).
  4. Kc, K., Rothenberg, M. E., Sherrill, J. D. In vitro model for studying esophageal epithelial differentiation and allergic inflammatory responses identifies keratin involvement in eosinophilic esophagitis. PLoS One. 10 (6), e0127755(2015).
  5. Kaymak, T., et al. IL-20 subfamily cytokines impair the oesophageal epithelial barrier by diminishing filaggrin in eosinophilic oesophagitis. Gut. 72 (5), 821-833 (2023).
  6. Straumann, A., Bauer, M., Fischer, B., Blaser, K., Simon, H. U. Idiopathic eosinophilic esophagitis is associated with a T(H)2-type allergic inflammatory response. J Allergy Clin Immunol. 108 (6), 954-961 (2001).
  7. Straumann, A., Spichtin, H. P., Bernoulli, R., Loosli, J., Vogtlin, J. Idiopathic eosinophilic esophagitis: a frequently overlooked disease with typical clinical aspects and discrete endoscopic findings. Schweiz Med Wochenschr. 124 (33), 1419-1429 (1994).
  8. Attwood, S. E., Smyrk, T. C., Demeester, T. R., Jones, J. B. Esophageal eosinophilia with dysphagia. A distinct clinicopathologic syndrome. Dig Dis Sci. 38 (1), 109-116 (1993).
  9. Kelly, K. J., et al. Eosinophilic esophagitis attributed to gastroesophageal reflux: improvement with an amino acid-based formula. Gastroenterology. 109 (5), 1503-1512 (1995).
  10. Fogg, M. I., Ruchelli, E., Spergel, J. M. Pollen and eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 112 (4), 796-797 (2003).
  11. Wolf, W. A., Jerath, M. R., Dellon, E. S. De-novo onset of eosinophilic esophagitis after large volume allergen exposures. J Gastrointestin Liver Dis. 22 (2), 205-208 (2013).
  12. Moawad, F. J., et al. Correlation between eosinophilic oesophagitis and aeroallergens. Aliment Pharmacol Ther. 31 (4), 509-515 (2010).
  13. Woo, W., Aceves, S. S. The role of the allergist in the management of eosinophilic esophagitis. Curr Opin Gastroenterol. 37 (4), 390-396 (2021).
  14. Dellon, E. S., et al. Updated International Consensus diagnostic criteria for eosinophilic esophagitis: Proceedings of the AGREE conference. Gastroenterology. 155 (4), e1010 1022-1033 (2018).
  15. Liacouras, C. A., Spergel, J., Gober, L. M. Eosinophilic esophagitis: Clinical presentation in children. Gastroenterol Clin North Am. 43 (2), 219-229 (2014).
  16. Sleiman, P. M., et al. GWAS identifies four novel eosinophilic esophagitis loci. Nat Commun. 5, 5593(2014).
  17. Kottyan, L. C., et al. Genome-wide association analysis of eosinophilic esophagitis provides insight into the tissue specificity of this allergic disease. Nat Genet. 46 (8), 895-900 (2014).
  18. Kottyan, L. C., et al. Replication and meta-analyses nominate numerous eosinophilic esophagitis risk genes. J Allergy Clin Immunol. 147 (1), 255-266 (2021).
  19. Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes Immun. 15 (6), 361-369 (2014).
  20. Collins, M. H., et al. Newly developed and validated eosinophilic esophagitis histology scoring system and evidence that it outperforms peak eosinophil count for disease diagnosis and monitoring. Dis Esophagus. 30 (3), 1-8 (2017).
  21. Rochman, M., et al. Profound loss of esophageal tissue differentiation in patients with eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 140 (3), 738-749 (2017).
  22. Sherrill, J. D., et al. Desmoglein-1 regulates esophageal epithelial barrier function and immune responses in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunol. 7 (3), 718-729 (2014).
  23. Blanchard, C., et al. IL-13 involvement in eosinophilic esophagitis: transcriptome analysis and reversibility with glucocorticoids. J Allergy Clin Immunol. 120 (6), 1292-1300 (2007).
  24. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  25. DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Rep. 9 (2), 701-711 (2014).
  26. Kasagi, Y., et al. The esophageal organoid system reveals functional interplay between Notch and cytokines in reactive epithelial changes. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (3), 333-352 (2018).
  27. Zhang, Y., et al. 3D modeling of esophageal development using human PSC-derived basal progenitors reveals a critical role for notch signaling. Cell Stem Cell. 23 (4), e515 516-529 (2018).
  28. Trisno, S. L., et al. Esophageal organoids from human pluripotent stem cells delineate sox2 functions during esophageal specification. Cell Stem Cell. 23 (4), e507 501-515 (2018).
  29. Kijima, T., et al. Three-dimensional organoids reveal therapy resistance of esophageal and oropharyngeal squamous cell carcinoma cells. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 73-91 (2019).
  30. Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 53 (1), e109(2020).
  31. Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440(2021).
  32. Nakagawa, H., et al. Modeling epithelial homeostasis and reactive epithelial changes in human and murine three-dimensional esophageal organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 52 (1), e106(2020).
  33. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  34. Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81, 1 Suppl 33-40 (1983).
  35. Bertolero, F., Kaighn, M. E., Gonda, M. A., Saffiotti, U. Mouse epidermal keratinocytes. Clonal proliferation and response to hormones and growth factors in serum-free medium. Exp Cell Res. 155 (1), 64-80 (1984).
  36. Bertolero, F., Kaighn, M. E., Camalier, R. F., Saffiotti, U. Effects of serum and serum-derived factors on growth and differentiation of mouse keratinocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 22 (7), 423-428 (1986).
  37. Witkowski, T. A., et al. Y-27632 acts beyond ROCK inhibition to maintain epidermal stem-like cells in culture. J Cell Sci. 136 (17), jcs.260990 (2023).
  38. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
  39. Sasaki, M., et al. Lysyl oxidase regulates epithelial differentiation and barrier integrity in eosinophilic esophagitis. bioRxiv. , (2023).
  40. Doyle, A. D., et al. Detergent exposure induces epithelial barrier dysfunction and eosinophilic inflammation in the esophagus. Allergy. 78 (1), 192-201 (2023).
  41. Hara, T., et al. CD73(+) epithelial progenitor cells that contribute to homeostasis and renewal are depleted in eosinophilic esophagitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1449-1467 (2022).
  42. Kasagi, Y., et al. Fibrostenotic eosinophilic esophagitis might reflect epithelial lysyl oxidase induction by fibroblast-derived TNF-alpha. J Allergy Clin Immunol. 144 (1), 171-182 (2019).
  43. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  44. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  45. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
  46. Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
  47. Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nat Biotechnol. 37 (3), 303-313 (2019).
  48. Sorrentino, G., et al. Mechano-modulatory synthetic niches for liver organoid derivation. Nat Commun. 11 (1), 3416(2020).
  49. Azouz, N. P., et al. The antiprotease SPINK7 serves as an inhibitory checkpoint for esophageal epithelial inflammatory responses. Sci Transl Med. 10 (444), 9736(2018).
  50. Azouz, N. P., et al. Functional role of kallikrein 5 and proteinase-activated receptor 2 in eosinophilic esophagitis. Sci Transl Med. 12 (545), 7773(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved