השתלת מכשירים אופטואלקטרוניים בחוט השדרה המכרסם

Summary

פרוטוקול זה מפרט הליך כירורגי לביצוע ניתוחי חוט שדרה ולהשתלה ואבטחה של שוק אופטי מעל חוט השדרה במכרסמים.

Abstract

נוירומודולציה יכולה לספק יישומים אבחוניים, מודולטוריים וטיפוליים. בעוד עבודה נרחבת נעשתה במוח, אפנון של חוט השדרה נותר יחסית לא נחקר. רקמת חוט השדרה העדינה והניידת מטבעה מטילה אילוצים שהופכים את ההשתלה המדויקת של בדיקות עצביות למאתגרת. למרות ההתקדמות האחרונה במכשירי נוירומודולציה, במיוחד ביואלקטרוניקה גמישה, ההזדמנויות להרחיב את השימוש בהם בחוט השדרה הוגבלו על ידי המורכבות הכירורגית של השתלת מכשירים. כאן, אנו מספקים סדרה של פרוטוקולים כירורגיים המותאמים במיוחד להשתלת מכשיר אופטואלקטרוני בהתאמה אישית המתממשק עם חוט השדרה במכרסמים. השלבים למיקום ועיגון שוק אופטי על מקטע מסוים של חוט השדרה באמצעות שתי שיטות השתלה כירורגיות שונות מפורטים כאן. שיטות אלה מותאמות למגוון רחב של מכשירים ויישומים, אשר עשויים לדרוש או לא לדרוש מגע ישיר עם חוט השדרה לצורך גירוי אופטי. כדי להבהיר את המתודולוגיה, האנטומיה של החוליות מוזכרת תחילה כדי לזהות ציוני דרך בולטים לפני ביצוע חתך בעור. השלבים הכירורגיים לאבטחת שוק אופטי מעל עמוד השדרה הצווארי במכרסמים מודגמים. לאחר מכן מתוארים נהלים לאבטחת המכשיר האופטו-אלקטרוני המחובר לשוק האופטי בחלל תת עורי הרחק מחוט השדרה, תוך מזעור מגע ישיר מיותר. מחקרים התנהגותיים שהשוו בין בעלי חיים שקיבלו את השתלים לבין אלה שעברו ניתוחי דמה מצביעים על כך שהשוקיים האופטיים לא השפיעו לרעה על תפקוד הגפיים האחוריות או הקדמיות שבעה ימים לאחר ההשתלה. העבודה הנוכחית מרחיבה את ארגז הכלים של נוירומודולציה לשימוש במחקרים עתידיים שמטרתם לחקור התערבויות שונות בחוט השדרה.

Introduction

חוט השדרה מאפשר מגוון תפקודים חיוניים של מערכת העצבים המרכזית, החל מתיאום התנהגויות מוטוריות ועד ויסות תהליכים הומיאוסטטיים כגון נשימה ^1,2. הבהרת תפקידה של רשת המעגלים המתוחכמת על פני חוט השדרה דורשת ממשקים, בין אם לגירוי חשמלי, הקלטה, אספקת תרופות או גירוי אופטי לאזורים ממוקדים 3,4,5,6. למרות שפותחו מכשירים המאפשרים חקירות כאלה 7,8,9,10,11, נדרשות טכניקות כירורגיות מיוחדות להשתלתם הכרונית בחוט השדרה 4. בפרט, חוט השדרה והחוליות הקשורות אליו הגבירו את הרגישות לעיוותים מכניים הנגרמים על ידי תנועות טבעיות כגון הארכה וכיפוף ^8,12,13. מאפיינים ייחודיים אלה של חוט השדרה הופכים את זה למאתגר באופן מהותי להבטיח שהגשושיות המושתלות יישארו יציבות, מתפקדות ומאובטחות במקטע מסוים לאורך תקופות זמן ממושכות.

כאן מתואר פרוטוקול כירורגי להחדרה ואבטחה של שוק אופטי במקטע ממוקד של חוט השדרה (איור 1A). מכיוון שהתממשקות עם אזור צוואר הרחם בפרט הוכחה כמציבה אתגרים ייחודיים⁹, שלבי ההשתלה מודגמים באופן ספציפי מעל אזור צוואר הרחם C5. יש להניח כי מורכבותו של עמוד השדרה הצווארי נובעת ממיקומו העמוק יותר ומשפע השרירים, מאפיין שאינו בולט לאורך שאר חוט השדרה. בכל מקרה, ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה נועדו להיות ניתנים להתאמה לניתוחים באזורי חוט השדרה השונים. הוראות הדרגתיות מסופקות כדי לאתר ולזהות מקטעי חוט שדרה באמצעות "ציוני דרך" אנטומיים בולטים שניתן לזהות מעל העור (איור 1B). לאחר מכן הפרוטוקול מבהיר שתי טכניקות להשתלה כירורגית: אחת המותאמת לבדיקות הדורשות מגע ישיר עם חוט השדרה, והשנייה לבדיקות שאינן דורשות מגע ישיר. השלבים המתוארים נועדו להיות משוכפלים על ידי כל חוקר עם הכשרה בניתוח הישרדות מכרסמים.

פרוטוקול זה כולל הוראות שלב אחר שלב להשתלת מכשיר אופטואלקטרוני (18 מ"מ x 13 מ"מ) עם שוק אופטי גמיש מחובר מעל רמת צוואר הרחם C5. המכשיר המושתל מאובטח תת עורית קאודלית ל- C5 ומורכב ממחוון דיודה פולטת אור מיקרוסקולית (μLED), המאיר כאשר מתרחש גירוי אופטי של חוט השדרה, ומספק משוב חי של פונקציונליות המכשיר. השפעת השוק האופטי המושתל על התפקוד המוטורי הטבעי הוערכה על מכרסמים שקיבלו שתלים והושוותה למכרסמים שעברו ניתוחי דמה. התוצאות מצביעות על כך שהבדיקות אינן משפיעות לרעה על תפקוד הגפה האחורית והגפיים הקדמיות הטבעיות של בעל החיים שבעה ימים לאחר ההשתלה.

Protocol

כל ההליכים נערכו על פי הנחיות המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים ובפיקוח הוועדה לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת קולומביה הבריטית. נקבות חולדות ארוכות-אוונס, במשקל 350-450 גרם ובגילאי 6-8 חודשים, שוכנו בקבוצה (21 מעלות צלזיוס; מחזור אור של 12 שעות: 12 שעות) וקיבלו גישה לתזונה סטנדרטית של מכרסמים לפני ואחרי הניתוח. פרטי הריאגנטים והציוד ששימשו למחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנה טרום ניתוחית

1. לעקר את כל כלי הניתוח באמצעות autoclave.
2. להרדים את בעל החיים עם איזופלורן (5% לזירוז ו-2% לתחזוקה) המועבר בחמצן בקצב זרימה של 1 ליטר/דקה.
3. העבירו את בעל החיים מתא האינדוקציה לכרית חימום וחברו מיד את חרוט האף האיזופלוראני. ודא כי בעל החיים נמצא תחת מישור כירורגי של הרדמה על ידי הבטחת אובדן מוחלט של רפלקס צביטת הבוהן בשתי הרגליים.
4. גלחו את החלק האחורי של החולדה החל מבסיס האוזניים, כפי שמוצג באיור 2A.
5. יש למרוח כמות נדיבה של משחת עיניים סטרילית על העיניים ולהזריק בופרנורפין (מדולל ל-0.03 מ"ג/ק"ג) ו-10 מ"ל צלצולים מניקים תת עורית (מחוממים לטמפרטורת הגוף).
6. נגבו את האזור המגולח בפילינג כירורגי מחטא (כלורהקסידין) ולאחר מכן באיזופרופיל אלכוהול בתנועה סיבובית המתחילה ממרכז האזור המגולח ומרחיבה את קוטר המעגל. חזור על תהליך הסבון / אלכוהול פעמיים נוספות.
7. אבטחו את החיה במסגרת סטריאוטקסית, ומקמו את הראש באמצעות מוטות אוזניים משומנים ליציבות (איור 2A).
   הערה: לאורך כל ההליך, ספק תמיכה תרמית באופן עקבי, ודא את עומק ההרדמה באמצעות רפלקס צביטת הבוהן ועקוב אחר סימנים חיוניים.
8. הניחו וילון כירורגי סטרילי על גבי החיה.

2. חשיפה לחוט השדרה הצווארי

1. באמצעות מלקחיים סטריליים, להתחיל על ידי מישוש הבסיס של הגולגולת. חוש לתהליך ספינוס בולט המשתרע באופן רוסטרוקאודלי ליד בסיס הגולגולת; זהו C2¹⁴ (איורים 1B ואיור 2B).
2. המשיכו עם מישוש קאודלי ל-C2 כדי למצוא תהליך ספיני חד ומחודד במיוחד, שניתן לזהותו כ-T2¹⁵ (איורים 1B ואיור 2C).
3. באמצעות אזמל, צרו חתך בעור, החל מ-C2 ונמתח בצורה קאודלית לאורך כ-1.5 ס"מ (איור 2D).
   הערה: גודל החתך עשוי להשתנות בין בעלי חיים בגדלים שונים. הקפידו מראש על זיהוי ציוני הדרך האנטומיים והתקדמו בהתאם.
4. חותכים בזהירות דרך שכבת השומן התת עורית עם האזמל כדי לחשוף את השרירים הגביים השלמים שמתחתיו.
5. ברגע שהשרירים הגביים נחשפים, בצעו דיסקציה קהה על-ידי משיכתם מקו האמצע באמצעות שני מלקחיים אדסון (איור 2E).
   הערה: חשוב לבצע דיסקציה קהה (משיכת סיבי השריר זה מזה) ולא לחתוך את השרירים כדי למזער דימום. חשיפה מספקת של השרירים הגביים אמורה לחשוף שריר בצורת כדור (איור 2G). שריר זה מכסה לחלוטין את C2 ומכסה חלקית C3.
6. בעזרת רונג'ורים ומלקחיים סטריליים, מרימים דש עור מיד לאזור החתוך. השתמשו ברונג'ורים כדי ליצור כיס תת-עורי קטן – זה יהיה המיקום של המכשיר (איור 2F).
   הערה: הכיס התת עורי צריך להיות גדול יותר מהמכשיר עצמו. מומלץ שהמנתחים/ות ימקמו את עצמם מחדש כך שיעמדו מול בעל החיים קדמית כדי לשפר את השליטה והנראות בעת פתיחת הכיס התת עורי.
7. הניחו מעצור כדי לחשוף את עמוד השדרה (איור 2G).
8. באמצעות רונגורים, הסר את כל השרירים או הרקמות שנותרו המכסים את החוליות והתחל לזהות את מקטעי חוט השדרה. מיד לשריר בצורת כדור נמצא C4, ואחריו C5 ו-C6 (איור 2G-I). לאחר שתסיים, לשטוף את אזור הניתוח עם מלוחים סטריליים ולייבש עם גזה סטרילית.
   הערה: השריר בצורת כדור עוטף באופן מלא את C2 ומשתרע חלקית על C3. מקטע חוט השדרה ישירות אליו, עם מגע מינימלי, מוגדר כ- C4.
9. בצע laminectomies בהתאם למטרה המיועדת של הבדיקה.
   1. עבור בדיקה מתחת ללמינה, בצעו למינקטומיה צידית ב-C5 וב-C6, ויצרו פתח רוחבי בלמינה לצורך מיקום עתידי של הבדיקה (איור 2H, איור משלים 1A).
   2. עבור בדיקה מעל הלמינה, בצעו כריתת למינקטומיה מדיאלית של C5, וודאו שאתם לא מסירים את ההיבטים הרוחביים של התהליך הספינוסי – רק חושפים מסלול מדיאלי למיקום הגשושית (איור 2I, איור משלים 1B).
   3. לאחר כריתת הלמינקטומיה, שטפו את האזור במי מלח סטריליים וייבשו בגזה סטרילית כדי להסיר פסולת עצם.
      הערה: בעת ביצוע למינקטומיה, זה קריטי לדחוף את rongeurs כלפי מעלה כנגד העצם ולהימנע כל תנועות כלפי מטה כדי למנוע נזק לכבל.

3. מיקום אפידורלי של המכשיר

1. החזיקו את המכשיר הסטרילי עם מלקחיים סטריליים בעלי קצה פלסטיק (איור 3A) והניעו אותו בתוך הפתח התת עורי שנוצר מוקדם יותר בשלב 2.9.
   הערה: חשוב להימנע מלגעת במכשיר עם כפפות/כלים לא סטריליים כדי לשמור על סטריליות המכשיר. השתמש במלקחיים סטריליות ייעודיות למיקום המכשיר ולמיקום מתחת לעור.
2. תפרו או הדביקו את המכשיר לשכבת השריר השכנה כדי לשמור עליו מאובטח (איור 3B).
   הערה: השתמש בתפרים שאינם נספגים אם אתה תופר את המכשיר לשרירים. אחרת, המכשיר נוטה לתנועה לאחר ספיגת התפרים בגוף. אם אתם משתמשים בדבק, ודאו יציבות ותאימות ביולוגית לטווח ארוך של הדבק/דבק. הימנע מהצמדת המכשיר לשכבת השומן/שומן התת עורית כדי להבטיח נקודות עיגון אמינות.
   1. תכנן את מיקום גוף ההתקן לפני שתמשיך בשלב זה. מכיוון שהמכשיר יהיה מהודק לצמיתות, בעיות במיקום הבדיקה (שלב 3.4) יכולות להתעורר אם המכשיר ממוקם קרוב מדי או רחוק מדי מהרמה הרצויה בחוט השדרה.
3. הנח את המשענת סביב חוט השדרה ופתח חלון מתאים כדי למקם את הבדיקה על חוט השדרה.
4. מיקומי בדיקות:
   1. מיקום הגשושית מתחת ללמינה: הכניסו בזהירות את הגשושית באמצעות מלקחיים עם קצה פלסטיק מתחת ללמינה (C5 ו-C6) על-ידי החלקה שלה דרך התעלות הרוחביות שנעשו בשלב 2.9.1 (איור 3D).
   2. מיקום בדיקה מעל חוט השדרה:
      1. כוונן את הגשושית באמצעות מלקחיים עם קצה פלסטיק כדי ליישר ולמקם את קצה הבדיקה על גבי החלון המדיאלי שנוצר ב-C5 בשלב 2.9.2 (איור 3C).
5. במיכל סטרילי, קטן ורצוי קרמי מכינים את המלט על ידי ערבוב כף מדידה אחת של אבקת צמנט דנטלית, 3 טיפות שומן היי-טק וטיפה אחת של זרז. מערבבים עם קיסמים סטריליים עד לקבלת מרקם צמיגי.
   הערה: מומלץ מאוד שאדם אחד שאינו מבצע את הניתוח יכין את המלט כך שהמנתח יוכל להחזיק את הבדיקה במקומה ולייבש את האזור הרצוי מיד לפני מריחת המלט. שלב זה הוא תלוי זמן. יש לוודא כי המנתח ממקם את הבדיקה לפני הכנת המלט. לאחר יישום הזרז, המלט יתעבה יותר מדי כדי להיקשר ביעילות עם העצם אם יש עיכוב. יש לתרגל עם המלט לפני הניתוח כדי להבטיח את העקביות הנכונה לפני הנחתו על הבדיקה/עצם.
6. יבש את אזור הצמנט המיועד בחוליות לחלוטין כדי ליצור נקודת עיגון אמינה. יש למרוח 1-2 טיפות של מלט דנטלי בקצה הבדיקה, אותן יש להניח על גבי מפלס החוליה המיועד, במקרה זה, C4 (איור 3C,D).
   הערה: קריטי שהחוליות יהיו יבשות ככל האפשר לפני המלט. אחרת, המלט לא יידבק, והבדיקה לא תהיה מאובטחת.
7. עצרו למשך 30 שניות וגעו בעדינות במלט כדי לוודא שהוא נרפא.
8. אם המלט לא נרפא לחלוטין, המתינו 20 שניות נוספות ומרחו מחדש מלט טרי עד שהבדיקה מאובטחת היטב לעצם.
   הערה: המלט נקשר כראוי כאשר הוא הופך קשה ונוקשה למגע.
   זהירות: מריחת הצמנט בעודו נוזלי מדי עלולה לגרום לו לחלחל לרקמת חוט השדרה שבין החוליות. במקרה כזה, יש להמתין כ-10 שניות עד שהמלט יתעבה למרקם דמוי חניכיים לפני שתשתמשו בעדינות במלקחיים כדי להסיר מלט שבא במגע עם חוט השדרה.

4. הליכים לאחר הניתוח

1. לאחר סיום הניתוח, תפרו את מקום החתך באמצעות 5-0 תפרים ויקריליים. הסר בעדינות את בעל החיים מהמנגנון הסטריאוטקסי והעבר אותו לתא התאוששות מחומם. במשך 3-5 הימים הראשונים לאחר הניתוח, ספקו לבעל החיים צ'או רך ולח, פינוקים ומי הידרוג'ל.
2. יש לעקוב ביסודיות אחר בעל החיים פעמיים ביום במהלך השבוע הראשון שלאחר הניתוח. יש לתת זריקות בופרנורפין וזריקות רינגר חמות פעמיים ביום במשך היומיים הבאים, או יותר אם סימני הכאב נמשכים. יש להמשיך בבדיקות יומיות עד שבעל החיים אינו מראה בעיות בריאותיות קליניות. לאחר מכן, בדוק את בעל החיים לפחות פעם בשבוע.
3. (אופציונלי) שרטט את היקף המכשיר על העור לאחר הניתוח וסגירת החתך לקבלת אינדיקציה חזותית של מיקום המכשיר בגוף (איור 4A).
   הערה: שלב זה שימושי במיוחד כאשר ההתקן דורש גישה חיצונית, כגון התקנים הזקוקים להפעלה אלחוטית באמצעות משדר חיצוני שבו צימוד האנטנה הוא קריטי, או משאבות להעברת תרופות שיש למלא מחדש דרך העור 16,17,18.

תוצאות

מכשיר אופטו-אלקטרוני עם התרשים הפונקציונלי המפורט שלו שמוצג באיור 2 המשלים הושתל בארבע חולדות לונג אוונס. איור משלים 3 מראה את המכשיר האופטו-אלקטרוני הסופי המוכן להשתלה. שלושה בעלי חיים נוספים עברו ניתוחי דמה, שכללו כריתת למינקטומיה מדיאלית ב-C5 ללא השתלת מכשיר. המכשיר האופטואלקטרוני כלל בדיקה גמישה עם μLED מוטבע בקצה אשר הופעל על ידי מנהל התקן LED משולב. מנהל ההתקן LED נשלט על ידי מיקרו-בקר עם קושחה ניתנת לתכנות. הוא כלל גם גוף מכשיר שנתפר לשכבת השריר מיד מתחת לעור. שכבה של Parylene-C (~ 10 מיקרומטר) מופקדת על המכשיר כולו באמצעות שקיעת אדים כימית (CVD). שכבה שנייה של פולידימתילסילוקסאן (PDMS) (~800 מיקרומטר) כיסתה את גוף המכשיר האופטו-אלקטרוני (איור משלים 3) כדי ליצור ממשק רך עם הרקמה. קצה הגשושית היה מאובטח ב-C4 כאשר ה-μLED מרחף מעל C5. במכשיר נעשה שימוש במחוון μLED (שאורו נראה מתחת לעור) שהודלק בו זמנית עם μLED של השוק האופטי לאימות חי של פונקציונליות המכשיר. החיות היו במעקב במשך 7 ימים לאחר הניתוח כדי לאשר את האמינות המתמשכת של הביצועים שלהן לאורך זמן (איור 4B).

התפקודים המוטוריים של בעלי החיים הוערכו באמצעות סולם דירוג מנוע שדה פתוח^{מרטינז 19}. כדי להעריך את התנהגות השדה הפתוח, שני משקיפים מיומנים שלא היו מודעים לקבוצות הטיפול ערכו את הבדיקות לפני הניתוח וכן בימים השלישי, החמישי והשביעי לאחר הניתוח. לאחר איסוף הנתונים, נערכה בדיקת Mann-Whitney U כדי לקבוע הבדלים בכל נקודת זמן הן בציוני הגפה הקדמית והן בציוני הגפה האחורית בין קבוצת השתל לבין קבוצת הדמה. הניתוח שלנו מצביע על ציון תפקוד דומה של הגפיים הקדמיות בקבוצות שתלים ודמה ביום השביעי (איור 5A). באופן דומה, לא היו הבדלים מובהקים סטטיסטית בין הקבוצות בציוני הגפיים האחוריות בכל נקודות הזמן (איור 5B).

אימות לאחר המוות בוצע 7 ימים לאחר ההשתלה כדי לאשר אם הבדיקה וגוף המכשיר נשארו במקומם. לא נמצא ניתוק נראה לעין של התפר או המכשיר. יתר על כן, משיכת גוף המכשיר לא גרמה לניתוקו מהרקמה (איור משלים 4A). השרירים שנותחו ונתפרו בעבר נחשפו לאחר מכן מעל חוט השדרה, ואושר כי הגשושיות נותרו מהודקות היטב מעל חוט השדרה (איור משלים 4B). בדומה לגוף המכשיר, ראש הגשושית נמשך לאחור ברצף כנגד נקודת הצמנט כדי להעריך את חיבורו למפרק המכני של הגשוש-למינה.

איור 1: סקירה סכמטית של השתלת מכשירים וציוני דרך אנטומיים. (A) הדגמת מיקום הבדיקה מעל חוט השדרה ומיקום תת עורי של המכשיר. (B) מודל תלת-ממדי המציין את ציוני הדרך המשמשים לקביעת רמות חוט השדרה. תהליכי עמוד השדרה C2, T2 ו- T10 מוצגים לעיון. צבעים כהים יותר מציינים את הרמה המתאימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: חשיפת חוט השדרה והכנת כיס תת-עורי. (A) הסטריאוטקסיק ממוקם על החיה. (B) תהליך עמוד השדרה C2 ו-(C) תהליך עמוד השדרה T2 מזוהים באמצעות מישוש. (D) חתך דרך העור ושכבת השומן התת עורית נעשה כדי לחשוף את השרירים הגביים בנקודת העניין ברמה הצווארית. (E) באמצעות דיסקציה קהה של השרירים הגביים, חוליות הצוואר נחשפות. (F) נוצר כיס תת-עורי כדי לאבטח את המכשיר המושתל הקאודלי לאתר החתך. (G) לאחר דיסקציה נאותה מונח מחזיר לאחור כדי לחשוף את חוליות הצוואר ואת השריר בצורת כדור, מכסה לחלוטין את C2 ומסווה חלקית את C3. הקו המקווקו מציין את השריר בצורת הכדור. לאחר חשיפת חוט השדרה הצווארי, או (H) שתי למינקטומיות לרוחב ב- C5 ו- C6 נעשות למיקום הבדיקה מתחת לחוליות, או (I) כריתת למינקטומיה מדיאלית מתבצעת ב- C5 למיקום בדיקה מעל החוליות. כוכביות מציינות את האתר של למינקטומיה לרוחב. פסי קנה מידה = 3 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: השתלת מכשיר ומיקום בדיקה. (א) המכשיר מונח בכיס התת עורי. (B) המכשיר נתפר לשרירים. (C) הבדיקה מאובטחת על גבי למינה C5, שעברה כריתת למינקטומיה מדיאלית. (D) המכשיר ממוקם מתחת ללמינה C5 ו-C6 שעברו שתיהן למינקטומיה לטרלית. גם ב-(C) וגם ב-(D), קצה הגשושית מקובע ב-C4 שלם. פסי קנה מידה = 3 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: מכשיר סימון ואימות פונקציונליות לאחר ניתוח. (א) ניתן לסמן את מיקום המכשיר על פני העור לאחר התפירה כדי להקל על זיהויו לאחר הניתוח. (B) האיור מתאר חיה לאחר ההשתלה. הפונקציונליות של המכשיר אומתה על ידי התבוננות במחוון μLED הנראה מתחת לעור, המאשר את הפעולה המוצלחת של המכשיר (הבליטה בצד ימין של החיה היא המקום שבו גוף המכשיר מושתל). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: ציוני התנהגות בשדה הפתוח של מרטינז בקבוצות דמה ושתלים עבור ביצועי הגפיים הקדמיות והאחוריות לאורך זמן. התרשימים ממחישים את הציונים ההתנהגותיים הממוצעים עבור (A) גפה קדמית ו-(B) הערכות שדה פתוח בגפיים האחוריות על פני ארבע נקודות זמן: 0 (נקודת התחלה), 3 ימים, 5 ימים ו-7 ימים לאחר ההשתלה (DPI). קווי שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע (SEM). הבדלים משמעותיים (p < 0.05) בין קבוצת הדמה לבין קבוצת השתלים מסומנים בכוכביות (*) בנקודות זמן ספציפיות. מקרא האיור מציין את קבוצות הדמה המוצגות על ידי הקו המקווקו, בעוד שקבוצת השתלים מוצגת על ידי הקו המלא. גודל דגימת הדמה היה n = 3, והשתל היה n = 4. מבחן Mann-Whitney U הלא-פרמטרי שימש להערכת משמעות ההבדלים בין קבוצות בכל נקודת זמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: איור של למינקטומיה. קווים מקווקווים מציינים את האזורים שיש לבצע עבור (A) שתי למינקטומיות לרוחב עבור מיקום הבדיקה מתחת לחוליות, ו-(B) למינקטומיה מדיאלית עבור מיקום הבדיקה מעל החוליות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

תרשים משלים 2: סכמה של המכשיר האופטו-אלקטרוני. דיאגרמת הבלוק המפורטת של המכשיר מוצגת. הבלוק השמאלי העליון מתאר מיכל LC תהודה של אנטנת מקלט חשמל אלחוטי. ההספק המתקבל מתוקן ומוזן לווסת מתח נשירה נמוך (LDO). יחידת מיקרו-בקר מפעילה באופן אוטומטי את ההתקן בהתבסס על הפרמטרים המתוכנתים, ומנהל התקן LED מפעיל את כל נורות ה-μLED המוטבעות בבדיקה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

תרשים משלים 3: מכשיר אופטו-אלקטרוני. המכשיר האופטו-אלקטרוני הסופי עם אנקפסולציה תואמת ביולוגית המחובר לשוק אופטי הכולל 1 μLED בקצהו. המלבן המקווקו מתאר את המיקום של μLED. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

תרשים משלים 4: אימות לאחר המוות של יציבות המכשיר. שבעה ימים לאחר ההשתלה, (A) גוף המכשיר נשאר תפור לשריר באותה תנוחה שבה הושתל ו-(B) הגשושית הצמנטית נשארה מאובטחת על גבי הלמינה C4. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

נוירומודולציה והתערבויות טיפוליות של חוט השדרה דורשות לעתים קרובות מיקום של בדיקות במקטעים מדויקים וממוקדים 3,4,7,13. בהתחשב בניידות המובנית של חוט השדרה, הגשושית חייבת להיות מאובטחת באופן אמין כדי לאפשר מחקרים כרוניים. בהתבסס על היישום הספציפי, ייתכן שיהיה חשוב לשלוט אם הבדיקה נמצאת במגע פיזי עם חוט השדרה, או אם ניתן להפחית את המגע כדי להפחית את תגובת הרקמה הדלקתית במידת האפשר. לכן, מתוארים צעדים כירורגיים עבור כל אחת משתי השיטות. הפרוטוקול מפרט באופן ספציפי כיצד למקם בדיקה בקטע הצווארי של חוט השדרה ב- C5. עם זאת, באמצעות ציון הדרך המתואר עבור T2 או T10 של חוט השדרה, הבדיקה יכולה להיות ממוקמת באופן דומה במיקום מדויק מעל אזור החזה או המותני על ידי ספירה לאחור של החוליות מ T2 או T10, בהתאמה, ברגע שהם נחשפים. יתר על כן, כדי למזער את הנזק לרקמת חוט השדרה, אבטחנו את גוף המכשיר, שהוא לעתים קרובות גדול ונוקשה יותר בהשוואה לבדיקה המחוברת, בחלל תת עורי הרחק מחוט השדרה.

ישנן כמה נקודות קריטיות להשתלת המכשיר המשולב עם הבדיקה. ראשית, קריטי להחליט על מיקום גוף המכשיר לפני ביסוס הבדיקה. זה מבטיח שהמרחק בין קצה הגשושית לגוף המכשיר מותאם כדי להפחית את המתח על הגשוש, כמו גם להימנע מאורך בדיקה נוסף, אשר יכול, למשל, לגרום לפיתול או תזוזה של הגשוש. בעיקרו של דבר, המטרה היא להבטיח שאורך הבדיקה יהיה דומה למרחק מהחלל התת-עורי שבו ממוקם גוף המכשיר לאזור חוט השדרה הממוקד שבו הגשושית צמנטית. על ידי ביצוע הליכי ניתוח סופניים בהם נבדקים אורכי בדיקה שונים, ניתן לקבוע את הגודל האופטימלי עבור מקטע ממוקד.

כדי לשמור על סטריליות, יש לטפל במכשיר בזהירות כדי למנוע מגע עם השכבה החיצונית של העור במהלך החדרתו לכיס התת עורי. מגע כזה עלול לפגוע בסטריליות המכשיר, מה שעלול להוביל להדבקה לאחר הניתוח. בנוסף, חשוב למזער את כמות הכוח המופעל על המכשיר בעת החזקתו במלקחיים כדי למנוע פגיעה בציפוי שלו, שהוא בדרך כלל שכבה דקה מגנה, מעליבה וסטרילית^20,21. הסרת הציפוי עשויה לקצר באופן דרסטי את תוחלת החיים של המכשיר למשל על ידי קיצור המעגל, גרימת התחשמלות לבעל החיים ו/או גרימת תגובה דלקתית בגוף. טיפול במכשיר עם מלקחיים בקצה פלסטיק עשוי לסייע בהפחתת סיבוכים כאלה.

בעת תפירת המכשיר לרקמה רכה, חשוב להימנע מתפירה לרקמת שומן תת עורית. כפי שנצפה בניסויים ראשוניים, שכבות שומן אינן מהוות נקודת עיגון אמינה לתפרים מכיוון שהן נוטות להיקרע. במקום זאת, גוף המכשיר נתפר לשכבת שריר סמוכה בחלל התת עורי באמצעות תפרים שאינם נספגים למיקום קבוע של המכשיר בגוף. מצד שני, כאשר מאבטחים את הגשושית לתהליכים עמוד השדרה, חשוב לוודא שהאתר אליו מאובטחת הגשושית יבש לפני החלת המלט. עצם/בדיקה רטובה מאריכה את זמן הריפוי ועלולה לגרום לכישלון מוחלט של התהליך.

ישנם כמה שיקולים קריטיים הקשורים למכשיר מושתל שיש להתייחס אליהם בזהירות לפני ניתוח ההשתלה. (1) חלקים פעילים חשמלית של המכשיר חייבים להיות עטופים בשכבת פסיבציה מבודדת. כל חסך בשכבה הפסיבית עלול לגרום לכשל תפקודי במכשיר. (2) יש לעקר היטב את המושתל בהתאם לפרוטוקול בעלי החיים של המתקן. (3) הצומת בין המכשיר לבין הגשושיות העצביות או השוקיים המגרים חייב להיווצר היטב. החיבור יעבור לחץ מכני חוזר עקב תנועות קבועות של בעלי חיים. (4) הגשושיות העצביות או שוקי הגירוי המחוברים למכשיר חייבים להיות גמישים ונמתחים מספיק כדי למנוע הצמדה בנקודות שונות.

ניתן להרחיב את הפרוטוקול המתואר למכשירי השתלה במודלים של בעלי חיים בגדלים שונים. לאחר זיהוי ציוני הדרך האנטומיים, ניתן להתאים אישית באופן שיטתי את שיטות הניתוח המתוארות כדי לאבטח כל בדיקה עצבית או שוקיים מגרים במקטעים ממוקדים של חוט השדרה ולהשתיל את מודולי הבקרה הקשורים אליהם. עם זאת, בהתאם ליישום, התקנים שונים יכולים להיות בגדלים, חומרים ועוביים שונים מזה שהושתל במאמר זה; לדוגמה, התקנים המחוברים למודול בקרה חיצוני דורשים שיקולים נוספים. בנוסף, יש לציין כי בעוד פרוטוקול זה מותאם לגירוי אופטוגנטי, יישומים נוירומודולטוריים אחרים, כגון מתן תרופות או גירוי/הקלטה חשמלית, דורשים הליכים כירורגיים שונים במקצת. באופן ספציפי, יישומים אלה זקוקים להשתלה תת-דוראלית כדי להבטיח מגע ישיר עם חוט השדרה מתחת לדורה^{מאטר 7}. עם זאת, עבור אופטוגנטיקה, מגע אינטימי עם הרקמה הוא בדרך כלל מיותר מכיוון שהמכרסם dura mater אינו מעכב באופן משמעותי את חדירת האור, מה שמאפשר למקם מקורות אור אפידורליים¹⁰.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adson Forceps	Fine Science Tools	11027-12
Alm 3 Point Retractor	Fine Science Tools	17010-10
Buprenorphine / Vetergesic	CDMV	124918	Manufacturer provides at 0.3 mg/mL but must be diluted to 0.03 mg/kg for use in rats
Chlorhexidine 2% Solution	Partnar	PCH-020
Curved Long Hemostat Forceps	KaamKaaj Tools	14.5	Curved Long Hemostat Forceps with A Stainless Steel Ratchet Locking Tweezer
CVD Parylene Machine: SCS Labcoter 2	Specialty Coating Systems	PDS 2010
Dental Cement - Catalyst	Parkell, Inc	S371
Dental Cement - Metabond	Parkell, Inc	S398
Dental Cement - Powder	Parkell, Inc	S396
Forceps with Replaceable Plastic Tips	Fine Science Tools	11980-13
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16121-14
Isoflurane USP	Fresenius Kabi	CP0406V2	Provided at 5% for induction and 2% for mainentance through precision vaporizer
Isopropyl Alcohol 70%	McKesson	350600
Lacri-Lube Sterile Eye Ointment	Refresh
Long Evans Rats	Charles River Laboratories	6
Low temperature solder paste	Chip Quik Inc.	11.38
Magnets	Radial Magnets, Inc.	0.53	Magnet Neodymium Iron Boron (NdFeB) N35 (3.00 mm x 1.00 mm)
Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters	Fine Science Tools	12002-12
PDMS: SYLGARD 184	Sigma Aldrich	761036
Scalpel Blades - #15	Fine Science Tools	10015-00
Scalpel Handle - #3	Fine Science Tools	10003-12
Solder flux	Chip Quik Inc.	14.25
Stereotaxic Frame	David Kopf Instruments	Model 900
Sterile Kwik-Sil Adhesive	World Precision Instruments	KWIK-SIL-S
UV Flashlight	Vansky	19.99
Wireless Charger	Nilkin	NKT06
Wireless Charging coil	TDK Corporation	WT202012-15F2-ID