JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להקמת מודל של בעלי חיים עם פגיעת ראש סגורה המשחזר את תוצאת הדימוי העצבי של פגיעה מוחית טראומטית קלה לא מסובכת עם מבנה המוח השמור בשלב החריף וניוון מוחי ארוך טווח. הדמיית תהודה מגנטית אורכית היא השיטה העיקרית המשמשת לראיות.

Abstract

פגיעה מוחית טראומטית קלה (mTBI), הידועה בשם זעזוע מוח, אחראית ליותר מ-85% מפגיעות המוח ברחבי העולם. באופן ספציפי, mTBI לא מסובך המציג ממצאים שליליים בהדמיה קלינית שגרתית בשלב האקוטי מעכב טיפול מוקדם ומתאים בחולים אלה. ידוע כי פרמטרי השפעה שונים עשויים להשפיע ואף להאיץ את התקדמות התסמינים הניורופסיכולוגיים הבאים לאחר mTBI. עם זאת, הקשר בין פרמטרי ההשפעה במהלך זעזוע מוח לתוצאה לא נבדק בהרחבה. במחקר הנוכחי תואר והודגם בפירוט מודל של בעלי חיים עם פגיעת ראש סגורה (CHI) ששונה מפרדיגמת פציעת ירידה במשקל. חולדות Sprague-Dawley זכרים בוגרים (n = 20) הוקצו באופן אקראי לקבוצות CHI עם פרמטרי השפעה שונים (n = 4 לקבוצה). מחקרי הדמיית MR אורכיים, כולל הדמיה משוקללת T2 והדמיית טנזור דיפוזיה, והערכות התנהגותיות עוקבות, כגון ציון חומרה נוירולוגי שונה (mNSS) ומבחן הליכת קרן, נערכו על פני תקופת מחקר של 50 יום. צביעה אימונוהיסטוכימית לאסטרוגליוזיס בוצעה ביום ה-50 לאחר הפציעה. ביצועים התנהגותיים גרועים יותר נצפו בבעלי חיים לאחר CHI חוזר בהשוואה לקבוצת הפציעה הבודדת והדמה. על ידי שימוש בהדמיית תהודה מגנטית אורכית (MRI), לא נצפתה חבלה מוחית משמעותית ב-24 שעות לאחר הפגיעה. עם זאת, ניוון קליפת המוח ושינוי באניזוטרופיה חלקית בקליפת המוח (FA) הודגמו ביום ה-50 לאחר הפציעה, מה שמרמז על שכפול מוצלח של mTBI קליני לא מסובך. והכי חשוב, שינויים בתוצאות נוירו-התנהגותיות ובתכונות התמונה שנצפו אחרי mTBI היו תלויים במספר הפגיעה, במרווחים בין הפציעות ובאתר הפגיעה שנבחר בבעלי החיים. מודל mTBI in vivo זה בשילוב עם MRI פרה-קליני מספק אמצעי לחקור פגיעה מוחית בקנה מידה מוחי שלם. זה גם מאפשר לחקור סמנים ביולוגיים של הדמיה הרגישים ל-mTBI על פני פרמטרי השפעה ורמות חומרה משתנים.

Introduction

פגיעה מוחית טראומטית קלה (mTBI) נצפית בעיקר אצל ספורטאים העוסקים בספורט מגע, יוצאי צבא ואנשים המעורבים בתאונות דרכים1. זה מהווה יותר מ-85% מכלל פגיעות הראש המדווחות2. האטיולוגיה העצומה של mTBI והשכיחות העולמית הגוברת שלה מדגישים את הכללת mTBI כגורם סיכון סביבתי טנטטיבי למחלה ניוונית מאוחרת3. TBI קלה לא מסובכת מאופיינת בציון תרדמת גלזגו (GCS) של 13-15, ללא חריגות מבניות שנצפו בסריקות טומוגרפיה ממוחשבת (CT) או הדמיית תהודה מגנטית (MRI). תסמינים נפוצים שחווים מטופלים עם mTBI לא מסובך כוללים כאבי ראש, סחרחורת, בחילות או הקאות ועייפות. עם זאת, הערכה אורכית של תוצאות בעקבות mTBI לא מסובך מציבה אתגרים ניכרים בשל שיעור הנשירה הגבוה בחולים4.

החששות מ-mTBI חוזרים וגברו, במיוחד בקרב קהילת הספורטאים המקצועיים של ליגת הפוטבול הלאומית (NFL), וכתוצאה מכך העלו את המודעות בקרבספורטאים לא מקצועיים. ההנחה היא שפגיעות מוחית גדלה לאחר ה-mTBI הראשוני, כאשר עלבונות לאחר מכן עלולים להחמיר את תוצאות הפציעה. ממצאים אחרונים מקבוצת המוח הגדולה ביותר שנתרמה של שחקני כדורגל לא רק קשרו השתתפות קודמת בכדורגל בחומרת אנצפלופתיה טראומטית כרונית (CTE), אלא גם הציעו מתאם בין גורמים שונים הקשורים לכדורגל לבין הסיכון והחומרה של CTE6. לפיכך, החשש מהשפעת מספר זעזועי המוח והמשטר החוזר על תוצאות הפציעות הולך וגובר. מחקר פרה-קליני חקר שינויים נוירופתולוגיים, מפל נוירו-דלקתי וליקוי נוירופסיכולוגי לאחר mTBI חוזר על ידי שימוש במודלים שונים של פגיעות ראש סגורות (CHI) 7,8,9,10,11,12,13,14 . עם זאת, חקירת פרמטרי ההשפעה על מודל ה-mTBI הלא מסובך, שעשוי לחקות מקרוב פגיעות ראש חוזרות ונשנות הקשורות לספורט וכתוצאה מכך לפגיעה תפקודית בשלב החריף וניוון מוחי בשלב הכרוני, לא נבדקה היטב.

דימות טנזור דיפוזיה (DTI), טכניקה המעריכה דיפוזיה של מולקולות מים, שימשה בדרך כלל במחקרים שחקרו את ההשפעות של mTBI. אניזוטרופיה חלקית (FA), מדד מפתח הנגזר מ-DTI, מכמת את מידת הקוהרנטיות של דיפוזיביות המים ומספק מידע לגבי הארגון המבני של אקסונים וצרורות סיבי עצב. הפרעה של ערכי FA בחומר הלבן (WM) הוצעה בעקבות mTBI במודלים שונים 8,10,11,15,16,17. בנוסף, דיפוזיות צירית (AD) ודיפוזיות רדיאלית (RD), המצביעות על שלמות אקסונלית ומיאלין, השתנו לאחר mTBI במחקרים פרה-קליניים 10,15,16,18,19,20. עם זאת, פערים בממצאי DTI בין מחקרים קודמים נובעים ככל הנראה משינויים בחומרת mTBI, הבדלים בפרמטרי השפעה, מודלים מגוונים של mTBI ונקודות זמן לא עקביות למעקב לאחר פציעה9.

מסמך הפרוטוקול הנוכחי, אם כן, שואף לבסס מודל חיות של mTBI שנועד להעריך את ההשפעות המצטברות של mTBI יחיד וחוזר על עצמו. שילבנו הערכות מקיפות ואורכיות, כולל הערכות של רווחת בעלי חיים, תוצאות התנהגותיות, פרמטרים של DTI ונפח קליפת המוח, כדי ללכוד שינויים דינמיים לאחר פציעה ולחקור את ההשפעות של פרמטרי השפעה שונים. על ידי הדגמת ליקוי תפקודי חריף ושינויים מיקרו-מבניים ארוכי טווח, מודל זה משכפל ביעילות את המאפיינים העיקריים של mTBI לא מסובך שלא טופלו במלואם במחקרים קודמים בבעלי חיים. כאן, סיפקנו פרוטוקול מפורט לפיתוח מודל mTBI לא מסובך באמצעות שיטת ירידה במשקל ראש סגורשונה 8,11 וביצוע הערכה אורכית בעקבות mTBI.

Protocol

המחקר בוצע בהתאם להמלצות הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות למחקר בבעלי חיים (מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה) והנחיות מחקר בבעלי חיים: דיווח בניסויים in vivo. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של האוניברסיטה הלאומית יאנג מינג צ'יאו טונג. 20 בעלי חיים חולקו באופן אקראי ל-5 קבוצות (n = 4 לקבוצה): (i) פגיעה בודדת בקליפת המוח התחושתית-מוטורית (SMCx/יחיד), (ii) פגיעות כפולות ב-SMCx עם מרווח של שעה אחת (SMCx/2 פגיעות/1 שעה), (iii) פגיעות כפולות ב-SMCx עם מרווח של 10 דקות (SMCx/2 פגיעות/10 דקות), (iv) פגיעות כפולות במוח המרכזי עם מרווח של שעה אחת (מרכזי/2 פגיעות/שעה), ו-(5) קבוצת הדמה עם ניתוח בלבד אך ללא השפעה ישירה על הראש, להערכת תוצאות אורך (איור 1). יש לציין כי המרווחים בין הפציעות שנבחרו למחקר זה (מרווחים של שעה לעומת 10 דקות) תוכננו לחקות את ההשפעות התת-מוחיות החוזרות ונשנות 8,10,11,13,21, שיכולות להיות עד אלף פעמים בעונה אחת, שחווים הספורטאים העוסקים בספורט מגע 22,23.

1. אינדוקציה של פגיעת ראש סגור (CHI)

הערה: חולדות ספראג-דולי זכרים בוגרים בגילאי 10 עד 12 שבועות ובמשקל של מעל 250 גרם שוכנים במחזור אור/חושך של 12/12 שעות עם גישה חופשית למזון ומים.

  1. הניחו את החולדה בתא אינדוקציה קטן והרדימו אותה בתערובת של איזופלורן (5%) ואוויר רפואי (2.5-3 ליטר לדקה). הוציאו את החולדה מהתא עד שהיא לא מגיבה לצביטה בכפה או בזנב.
  2. הניחו את החולדה על כרית החימום.
    הערה: הפעל את כרית החימום במהלך הניתוח כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של החולדות.
  3. הביאו את החולדה למסגרת סטריאוטקסית ואבטחו אותה בעזרת מוט שיניים. מתן איזופלורן ב-2% באמצעות חרוט האף המחובר עם אוויר רפואי בקצב זרימה של 1.5-2 ליטר לדקה לתחזוקה במהלך הניתוח.
  4. מקם את מוטות האוזניים. ודא שהחולדה מרוכזת וסימטרית על המסגרת הסטריאוטקסית.
    הערה: כל ההליכים הכירורגיים צריכים להתבצע בתנאים אספטיים. המכשירים עוקרו לפני הניתוח באמצעות חיטוי קיטור, וקצותיהם עוקרו בנוסף עם מעקר חרוזים במהלך ההליך. כדי למנוע זיהום, הונח וילון כירורגי על החיה. המנתח חבש כובע כדי לכסות את שיערם, מסכה כדי לכסות את פניהם, והיה מצויד בחלוק מעבדה וכפפות כירורגיות במהלך ההליך24.
  5. שים את החיישן של אוקסימטר הדופק לכף האחורית של החיה כדי לעקוב אחר קצב הנשימה, קצב הלב, רמת החמצן בדם וטמפרטורת הגוף של החיה.
  6. יש להזריק 1 מ"ל/ק"ג משקל גוף של לידוקאין (20 מ"ג/מ"ל) תת עורית לתוך צוואר החולדה כמשכך כאבים.
  7. מרחו קרם להסרת שיער על ראש החיה והמתינו 3 דקות. נגב את הקרם עם 70% ספוגיות אלכוהול איזופרופיל.
  8. נקו את האזור המגולח מספר פעמים בעזרת צמר גפן סטרילי ספוג ביוד. הסר את שאריות היוד באמצעות צמר גפן ספוג באתנול 70%.
  9. צור חתך בקו האמצע באורך של כ-2-2.5 ס"מ בעור המגולח באמצעות להב כירורגי סטרילי כדי לגשת אל פני הגולגולת.
  10. הסר את הרקמה על העצם באמצעות כרית כותנה כדי לחשוף את הגולגולת. נקו את משטח הגולגולת באמצעות צמר גפן ספוג במי מלח 0.9%, ולאחר מכן נקו אותו עם כרית כותנה יבשה.
    הערה: כעת ניתן לזהות בקלות את תפרי הגולגולת וגם ברגמה ולמבדה.
  11. זהה את הברגמה כנקודת הייחוס כדי לברר עוד יותר את אזור הפגיעה על סמך הקואורדינטה.
    הערה: בפרוטוקול זה, שתי קבוצות של קואורדינטות משמשות לאינדוקציה של CHI: (-2.5, -2.0) (2.5 מ"מ לרוחב 2.0 מ"מ אחורי הברגמה) על גבי קליפת המוח התחושתית-מוטורית (SMCx), כמו גם (0,-3.0) על גבי המוח המרכזי (מרכזי).
  12. זהה את הקואורדינטות הנבחרות על פני הגולגולת וצמד קסדת נירוסטה עגולה (קוטר 10 מ"מ ועובי 1 מ"מ) על השטח המיועד באמצעות צמנט דנטלי. הסר את כרית החימום ואת אוקסימטר הדופק.
  13. הזיזו את המכשיר הסטריאוטקטי ואת החולדה על שולחן ההרמה (אורך 14 ס"מ, רוחב 8 ס"מ ועומק 6.15 ס"מ) מתחת לפגיעה ב-CHI.
  14. הרם את גוף החולדה באמצעות ספוג קצף (19 ס"מ אורך, 10 ס"מ רוחב ו-4 ס"מ עומק, בצפיפות של 18 ק"ג/מ"ק).
  15. הסר את החולדה מסורגי האוזניים של המסגרת הסטריאוטקסית. השאירו את החולדה ללא תנועה על מוט השן המחובר לקונוס האף, והעבירו 2% איזופלורן. ודא שהראש והגוף מיושרים בכיוון הרוסטרלי-זנבי.
  16. כוונן את שולחן ההרמה כדי להבטיח שאין רווח בין פגיעת ה-CHI לקסדה. כבה את איזופלורן 5 שניות ממש לפני הפגיעה.
    הערה: כדי לציין את רפלקס היישור עקב פגיעה מוחית, בוצעה הפסקה זמנית של איזופלורן25.
  17. זרוק פליז 600 גרם מגובה של 1 מ' דרך צינור נירוסטה (גובה 1 מ' עם קוטר פנימי של 20 מ"מ לפינוי עמוד ממשקולות פליז אל חלד) אל הפגיעה המאובטחת עם קצה עגול המכוון אל קסדת המתכת.
    הערה: בעלי חיים בקבוצת הדמה לא חוו פגיעה, מכיוון שטיפת הפליז שוחררה מבלי ליצור מגע עם הקסדה שעל ראש החולדה.
  18. הורד את שולחן ההרמה. הסר את החולדה מהמסגרת הסטריאוטקסית והנח את החולדה במצב שכיבה על כרית חימום.
  19. רשום את זמן רפלקס היישור, שהוא הזמן שבו החיה מנסה לעבור ממצב שכיבה למצב שכיבה26,27.
    הערה: בעלי החיים שהיו נתונים ל-CHI החוזר ונשנה הורדמו שוב 3 דקות לפני הפגיעההשנייה . עבור בעלי החיים בקבוצת SMCx/כפול/10 דקות שלא התהפכו בחזרה למצב הנטייה בזמן, הזמן המקביל של רפלקס היישור נרשם כ-420 שניות.
  20. לאחר הקלטת רפלקס היישור, יש להרדים את החולדה באיזופלורן שוב באמצעות שלב 1.1.
  21. שתק את החולדה עם המסגרת הסטריאוטקסית באמצעות שלב 1.2.
    הערה: לאחר אישור יציבות הקסדה על גבי הגולגולת, חזור שוב על שלבים 1.13-1.17 כדי לבצע את הפגיעההשנייה .
  22. הסר את הקסדה. הסר את כל רקמת החיבור והמלט על גבי הגולגולת.
  23. מכסים את הגולגולת במלט הדנטלי ומניחים לה להתייבש. בדוק שהמלט הדנטלי נוקשה וקשה באמצעות גב הפינצטה.
    הערה: המלט הדנטלי הונח על גבי הגולגולת כדי למנוע חפצי רגישות הנגרמים על ידי ממשקי גולגולת-אוויר או גולגולת-דם בין הגולגולת לקרקפת לאחר הניתוח.
  24. סגור את החתך באמצעות 4-0 תפרי ניילון כירורגיים עם 4-5 קשרים עצמאיים.
    הערה: אורך הפצע הוא כ-2-2.5 ס"מ. ודא כי לתפרי הניתוח אין פעולה נימית והם עשויים מחומר משי או ניילון. אין לתפור את החתך באמצעות קשר אחד בודד כדי למנוע את פתיחת הפצע על ידי גירוד החיה.
  25. מרחו אנטיביוטיקה מקומית (קרם דרמנסט) על מקום הניתוח כדי למנוע זיהומים.
  26. יש להזריק 1 מ"ל/ק"ג משקל גוף של קרפרופן (50 מ"ג/מ"ל) תת עורית לתוך הצוואר כמשככי כאבים לאחר הניתוח.
  27. הניחו את החולדה בכלוב נקי על כרית חימום עד שהיא חוזרת להכרה. ברגע שהחולדה יושבת זקופה, החזירו אותה לכלוב הביתי.
  28. יש לתת דרך הפה 5 מ"ל של אצטמינופן (24 מ"ג/מ"ל) מעורבב ב-200 מ"ל מים לבעל החיים מדי יום כמשכך כאבים במשך 3 ימים רצופים לאחר הניתוח.

2. הדמיית תהודה מגנטית (MRI)

הערה: תמונה משוקללת T2 והדמיית דיפוזיה-טנזור מבוצעות באמצעות מערכת PET/MR 7T עוקבת לפני CHI, כמו גם ב-1 ו-50 יום לאחר הפציעה (איור 1). MRI בסיסי בוצע תוך שבוע לפני הליך CHI. עבור ההערכות ב-1 ו-50 יום לאחר ה-CHI, ההערכות ההתנהגותיות נערכו בבוקר, ולאחר מכן סריקות MRI אחר הצהריים באותו היום.

  1. להרדים את החולדה בתא אינדוקציה קטן מלא בתערובת של איזופלורן (5%) ואוויר רפואי (2.5-3 ליטר לדקה).
  2. ברגע שהחולדה אינה מגיבה לצביטה בכפה או בזנב, השהה זמנית את ההרדמה בעת העברתה לעריסת החיה במצב נטייה עם הראש תחילה.
  3. מקם את החולדה במחזיק הראש המחובר עם חרוט אף, ומספק 2% איזופלורן עם אוויר רפואי בקצב זרימה של 1.5-2 ליטר לדקה לתחזוקה במהלך קליטת התמונה.
  4. קבע את הראש בעזרת פיסת סרט קטנה כדי למנוע תנועה במהלך הסריקה.
    הערה: מרחו מעט משחת שיניים על ראש החולדה ביום הראשון לאחר ה-CHI כדי למנוע חפצי רגישות מגנטית עקב הסרת הקרקפת28,29.
  5. הנח כרית לחץ מתחת לבית החזה של החולדה כדי לפקח על הנשימה. הדביקו את תפסי האוקסימטר לגפה האחורית כדי לעקוב אחר קצב הלב.
  6. הכנס את הגשושית הרקטלית כדי למדוד את טמפרטורת פי הטבעת. מכסים את החולדה בשמיכת חימום במים חמים במחזור ועטיפת רקמות במהלך הניסוי כדי לשמור על טמפרטורת הגוף.
    הערה: לאורך כל הניסוי, עקוב אחר מצבים פיזיולוגיים, כולל דופק, קצב נשימה וטמפרטורת פי הטבעת. לפני הסריקה, בדוק את כל האותות הפיזיולוגיים של החולדה כדי להבטיח את איכות מוניטור הסימנים החיוניים.
  7. השתמש במערכת מיקום הלייזר של סורק PET/MR כדי לסמן את מרכז הראש ליישור מדויק.
  8. העבר את החיה לתוך קדח ה-MRI באופן אוטומטי באמצעות מערכת הובלת בעלי חיים ממונעת עד שמרכז הראש מתיישר עם מרכז האיזו של הסורק.
    הערה: מערכת הובלת בעלי חיים ממונעת המשולבת במערכת PET/MR מבטיחה מיקום מדויק של בעלי חיים ומייעלת את זרימת העבודה בעת מעבר בין שיטות הדמיה.
  9. השג רצף MRI.
    1. ביצוע לוקליזציה ראשונית והתאמה כוללת.
    2. השתמש בפרוסה הסגיטלית האמצעית ויישר את הפרוסהה-8 מהחלק הקדמי עם הפרוסה של הקומיסורה הקדמית.
      הערה: פרוסות העטרה ממוקמות בניצב למישור האופקי המוגדר על ידי הקו המחבר בין הקומיסורה הקדמית לבסיס המוח הקטן, המתאים לזווית של כ-15 מעלות ביחס לציר הארוך של הקורפוס קלוסום. הפרמטרים העיקריים של סריקת T2-RARE עבור הפרוסה הסגיטלית האמצעית הם כדלקמן: זמן חזרה (TR) = 2500 אלפיות השנייה, זמן הד (TE) = 44 אלפיות השנייה, שדה ראייה (FOV) = 3.5 ס"מ, גודל מטריצה = 256 256, עובי פרוסה = 1 מ"מ, מספר פרוסות = 1, גורם RARE = 8, רוחב פס = 75 קילו-הרץ, מספר ממוצעים = 1, זמן הרכישה = 1 דקה 20 שניות.
    3. השתמש ברכישה מהירה עם שיפור הרפיה (RARE) עם דיכוי שומן ורצועת רוויה מתחת למוח כדי לקבל תמונות משוקללות T2 עבור התייחסות אנטומית (איור 2).
      הערה: הפרמטרים העיקריים של סריקת T2-RARE הם כדלקמן: זמן חזרה (TR) = 3600 ms, זמן הד (TE) = 40 ms, שדה ראייה (FOV) = 2 ס"מ, גודל מטריצה = 256 256, עובי פרוסה = 1 מ"מ, מספר פרוסות = 16, גורם RARE = 8, רוחב פס = 75 kHz, מספר ממוצעים = 8, זמן הרכישה = 7 דקות 40 שניות.
    4. השתמש ב-EPI ספין-הד של 4 זריקות כדי לרכוש תמונות טנזור דיפוזיה (איור 2).
      הערה: הפרמטרים העיקריים של סריקת ה-DTI הם כדלקמן: TR = 3000 ms, TE = 28 ms, שדה ראייה (FOV) = 2 ס"מ, גודל מטריצה = 96 96, עובי = 1 מ"מ, מספר פרוסות = 16, משך הדופק (δ) = 5 ms, זמן בין שני הפולסים (Δ) = 15 ms, מספר B0 = 5, מספר כיוונים = 30, ערך b = 1000 s/mm3, רוחב פס = 150 קילו-הרץ, מספר הממוצע = 4, זמן הרכישה = 14 דקות.
    5. סיים את פרוטוקול הסריקה. החלק את עריסת החיה החוצה מהמגנט. הסר את החיה מהעריסה.
    6. העבירו את החולדה לכלוב נקי עם כרית חימום מתחתיה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף שלה. החזירו את החולדה לכלוב הבית שלה ברגע שהיא חוזרת להכרה.
  10. עיבוד מקדים של תמונה
    הערה: השתמש בתוכנת MRtrix3, מיפוי פרמטרי סטטיסטי (SPM) וסקריפטים מותאמים אישית של MATLAB לעיבוד וניתוח נתונים.
    1. הפחתת רעש של תמונות DTI באמצעות הפקודה MRtrix3 (dwidenoise)30.
    2. הסר את חפצי הצלצול של גיב מתמונות DTI באמצעות הפקודה MRtrix (mrdegibbs)30.
    3. רשום תמונות DTI לתמונות משוקללות T2 של הנושא היחיד על פני סריקות אורך באמצעות פונקציות SPM (spm_coreg.m ו-spm_powell.m).
    4. בצע הפשטת גולגולת על תמונות משוקללות T2 על ידי עיצוב ידני של אזור המוח פרוסה אחר פרוסה, ולאחר מכן הסרת פיקסלים בעוצמה מתחת לסף המחושב שנקבע על ידי שיטת אוטסו31 (סקריפט MATLAB מותאם אישית thr_otsu2.m).
    5. לבצע רישום צולב בין בעלי חיים באותה קבוצת ניסוי באמצעות פונקציות SPM (spm_coreg.m ו-spm_powell.m). החל את מסכת המוח על תמונות ה-DTI המתאימות.
      הערה: הפשטת הגולגולת מתבצעת כדי לקצר את זמן העיבוד של המחשב.
    6. חשב מפות טנזור על סמך DTI (סקריפט MATLAB מותאם אישית, tensormap.m).
    7. חשב מפות FA (סקריפט MATLAB מותאם אישית, calFA.m)
      הערה: כל הסקריפטים המותאמים אישית של MATLAB זמינים דרך מסד הנתונים הבא (https://doi.org/10.57770/9ZESXD).
  11. ניתוח תמונה-FA
    1. צייר אזורי עניין (ROIs) בקליפת המוח ובקורפוס קלוסום (CC) עבור שלוש פרוסות התמונה העוקבות מתחת לקואורדינטות של CHI.
      הערה: כל ההחזר על ההשקעה צויר באופן ידני ונבדק ויזואלית לאיתור שגיאות גסות על ידי 2 חוקרים מנוסים עיוורים לקבוצות הניסוי.
    2. חלץ וממוצע את ערך ה-FA מהחזר על ההשקעה.
      הערה: עבור הקורפוס קלוסום מתחת לקליפת המוח, פיקסלים עם ערכים של FA < 0.35 לא נכללו בהחזר ההשקעה שנבחר כדי למנוע השפעות נפח חלקיות. עבור קליפת המוח, כל הפיקסלים עם ערכים של FA < 0.35 בהחזר ההשקעה גויסו לניתוח.
  12. ניתוח תמונה - נפח
    1. צייר ידנית החזר ROI המכסים את האזורים בקליפת המוח עבור 11 פרוסות תמונה רצופות ב-Bregma -7 עד +3 מ"מ.
      הערה: כל ההחזר על ההשקעה נלקח באופן ידני על ידי 2 חוקרים מנוסים שהיו עיוורים לקבוצות הניסוי.
    2. סכם את סך הפיקסלים של ההחזר על ההשקעה על פני פרוסות והפוך אותם לנפח על ידי הכפלת עובי הפרוסה (1 מ"מ).
    3. נרמל את עוצמת הקול בקליפת המוח לאחר CHI עם הנפח המתאים לפני CHI של כל חיה.
      הערה: נרמל את הנתונים כדי לבטל הבדלים אינדיבידואליים בנפח המוח בין בעלי חיים לפני ההצגה.

3. הערכת התנהגות

הערה: הניסויים ההתנהגותיים מבוצעים באמצעות מבחן שיווי משקל הליכת אלומה ו-mNSS לפני CHI, כמו גם ב-1 ו-50 יום לאחר CHI (איור 1). כל ההערכה בוצעה על ידי לפחות שני משקיפים כדי להבטיח את הדיוק, העקביות והאובייקטיביות של הנתונים שנאספו.

  1. מבחן איזון הליכה בקורה
    1. הפעל את מצלמת הווידיאו והפעל את הטיימר.
    2. הניחו את החולדות בקצה אחד של קורת האיזון (3 ס"מ עומק, 3 ס"מ רוחב, 80 ס"מ אורך ו-60 ס"מ מעל הרצפה).
    3. עצור את הטיימר ברגע שהחולדה משלימה הלוך ושוב, נופלת או קופאת מעל 3 דקות.
      1. במהלך הניסוי, התבונן במצב החיה לצורך ההערכה באמצעות mNSS 11,32,33,34. פעל לפי התקנים הבאים להערכה:
      2. אם החולדה שומרת על שיווי משקל עם יציבה יציבה על הקורה, הקצה ציון 0.
      3. אם החולדה תופסת את צד הקורה, הקצה ציון של 1.
      4. אם החולדה נופלת עם איבר אחד מהקורה, הקצה ציון של 2.
      5. אם החולדה נופלת עם שתי גפיים או מסתובבת על הקורה (>60 שניות), הקצה ציון 3.
      6. אם החולדה מנסה לאזן על הקורה אך נופלת (>40 שניות), הקצה ציון של 4.
      7. אם החולדה מנסה לאזן על הקורה אך נופלת (>20 שניות), הקצה ציון 5.
      8. אם החולדה לא מנסה לאזן או להיתלות על הקורה ונופלת תוך 20 שניות, הקצה ציון של 6.
      9. אם החולדה לא מצליחה להשלים את המשימה, קחו בחשבון שהיא לקחה את הזמן המקסימלי של 3 דקות והקצו לה ציון 6.
    4. קבעו ימי בדיקה בנקודות זמן ספציפיות.
      הערה: אל תכלול חולדות שלא השלימו את הליכת הקורה הלוך ושוב במשך שני ניסויים לפני CHI מהניתוח הבא והערכת התנהגות מעקב.
  2. ציון חומרה נוירולוגי שונה (mNSS)
    הערה: הערכת mNSS כוללת בדיקות מוטוריות, בדיקות חושיות, היעדר רפלקס, תנועות חריגות, איזון קרן והליכה על הרצפה 32,33, שבוצעה במהירות על בסיס יומי.
    1. בצע בדיקות מוטוריות.
      1. הרם את החולדה בבסיס הזנב והתבונן ברפלקסים של הגפיים שלה במשך כ-15 שניות כדי להעריך את הכיפוף וההארכה הנכונים.
      2. אם נצפתה כיפוף רגיל בגפה הקדמית, הקצה ציון 0. אם לא נצפתה כיפוף, הקצה ציון של 1.
      3. אם נצפתה כיפוף רגיל בגפה האחורית, הקצה ציון של 0. אם לא נצפתה כיפוף, הקצה ציון של 1.
      4. אם הראש נע >10° לציר האנכי תוך 30 שניות לאחר הרמת החולדה בזנב, הקצה ציון 0. אם לא, הקצה ציון של 1.
        הערה: מקסימום 3 ציונים יוקצו במפגש זה של המבחן.
    2. בצע בדיקות מיקום גפיים.
      הערה: בדיקת המיקום מבוצעת כדי להעריך את התיאום בין תפקוד חושי (חזותי, מישוש ופרופריוספציה) לבין תפקוד מוטורי.
      1. הורד לאט את החולדה לכיוון פני השולחן. שימו לב אם כפות החולדות הגיעו ונמתחו לעבר פני השטח.
      2. אם החולדות הגיעו לפני השטח עם שתי הגפיים מתוחות וקדימה, הקצה ציון 0. אם יש עיכוב או אין תגובה, הקצה ציון של 1.
      3. הניחו את החולדה על פני השטח ומשכו את הכפה אל קצה השולחן. שים לב אם כפו חוזרת למצב רגיל על פני השולחן.
      4. אם נצפות תגובות מיקום מיידיות ונורמליות, הקצה ציון 0. אם נצפות תגובות מיקום מאוחרות, הקצה ציון של 1. אם אין תגובה, הקצה ציון של 2.
        הערה: מקסימום 3 ציונים יוקצו במפגש זה של המבחן.
    3. התבונן בהיעדר משקף ותנועות חריגות.
      1. שימו לב לנענועי ראש כדי להעריך את רפלקס האפרכסת בעת נגיעה בבשר השמיעה עם קצה הכותנה של צמר גפן.
      2. אם נצפה רפלקס נורמלי, הקצה ציון 0. אם לא נצפה רפלקס, הקצה ציון של 1.
      3. העריכו את נוכחות רפלקס הקרנית על ידי נגיעה בקרנית עם קצה הכותנה של צמר גפן.
      4. אם מתקבלת תגובה נורמלית, הקצה ציון 0. אם לא מתעוררת תגובה למצמוץ, הקצה ציון של 1.
      5. עשו מחיאות כפיים קצרות וחזקות. שימו לב לנוכחות רפלקס הבהלה.
      6. אם נצפה רפלקס, הקצה ציון 0. אם לא נצפה רפלקס, הקצה ציון של 1.
      7. שימו לב אם לחולדה יש התקפים, מיוקלונוס או מיודיסטוניה.
      8. אם אחד מהם מתרחש, הקצה ציון של 1.
        הערה: מקסימום 4 ציונים יוקצו במפגש זה של המבחן.
    4. בצע את בדיקת איזון האלומה, כפי שתואר קודם לכן (שלב 3.1).
      הערה: מקסימום 6 ציונים יוקצו במפגש זה של המבחן.
    5. בצע מבחן הליכה על הרצפה.
      1. הכינו את זירת השטח הפתוח (75 ס"מ אורך, 50 ס"מ רוחב ו-40 ס"מ עומק). ודא שהוא נקי וללא כל רמזי ריח קודמים.
      2. מקמו חולדה במרכז זירת השדה הפתוח והתבוננו כיצד החולדה הולכת בזירה.
      3. אם החולדה מבצעת הליכה רגילה, הקצה ציון 0.
      4. אם החולדה לא יכולה ללכת ישר, הקצה ציון של 1.
      5. אם החולדה נופלת לצד הפרטי לאחר הנחתה על הרצפה, הקצה ציון 3.
        הערה: מקסימום 3 ציונים יוקצו במפגש זה של המבחן.
    6. סכם את כל התוצאות; הציון המקסימלי האפשרי הוא 18.
      הערה: הציון הגבוה יותר מצביע על תוצאה גרועה יותר.

4. אימונוהיסטולוגיה

  1. בצע זלוף טרנס-קרדיולוגי35.
    הערה: זלוף טרנס-קרדיולוגי מבוצע לאחר סריקת ה-MRI 50 יום לאחר ה-CHI (איור 1).
    1. הניחו את החולדה בתא אינדוקציה קטן והרדימו אותה עם איזופלורן (5%) עד שהיא לא מגיבה לכפה או לצביטה בזנב.
    2. יש לתת 50 מ"ג/ק"ג משקל גוף של זולטיל (50 מ"ג/מ"ל) ו-10 מ"ג/ק"ג משקל גוף של קסילזין (רומפון, 23.32 מ"ג/מ"ל) באמצעות הזרקה תוך צפקית להרדמה עמוקה.
    3. הניחו את החולדה במצב שכיבה.
    4. בצע חתך רוחבי באורך של כ-4-5 ס"מ מתחת לבית החזה בעזרת מספריים.
    5. אתר את הסרעפת וחתוך אותה כדי לחשוף את הלב.
    6. השתמש במלקחיים המוסטטיים כדי להדק את עורק הריאה ולאחר מכן בצע חתך באורך של כ-0.5-1 ס"מ בפרוזדור הימני.
    7. חבר את המחט לצינור המחובר למשאבת העירוי.
    8. הכנס את המחט לחדר השמאלי.
    9. שטפו את החיה באמצעות זלוף טרנס-לבבי (40 מ"ל/דקה) עם 500 מ"ל של 0.9% מי מלח עד לניקוי הדם.
    10. לחלחל את החיה באמצעות זלוף טרנס-לבבי (40 מ"ל/דקה) עם 500 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (PFA) לקיבוע.
    11. הסר את ראש החולדה, וקלף בזהירות את רקמת המוח מהגולגולת.
    12. שמור את המוח בכ-20 מ"ל של 4% PFA בבקבוק למשך 48 שעות לאחר הקיבוע.
  2. בצע עיבוד רקמות וצביעה IHC 36,37.
    הערה: בצע צביעה אימונוהיסטוכימית על קטעי רקמה קבועים בפורמלין, משובצים בפרפין באמצעות ערכת מערכת הזיהוי המשנית של אימונופרוקסידאז.
    1. השתמש בקטעי רקמה קבועים בפורמלין ובפרפין.
    2. בצע דה-פראפיניזציה וטפל בשקופיות עם 3% H2O2 כדי לחסום פעילות פרוקסידאז אנדוגנית. בצע אחזור אנטיגן באמצעות מאגר ציטראט ב-90 מעלות צלזיוס.
    3. בצע צביעה אימונוהיסטוכימית באמצעות ערכת מערכת הזיהוי המשנית של אימונופרוקסידאז.
      הערה: הליכי הצביעה מתבצעים בהתאם להמלצות היצרן.
    4. השתמש בהמטוקסילין כדי להכתים דגימות.
    5. הרכיבו דגימות עם מגיב נגד דהייה.
    6. השתמש בנוגדנים לחלבון חומצי סיבי (GFAP) נגד גליה לצביעה אימונוהיסטוכימית.
    7. רכשו את התמונות של החזר ROI באמצעות סורק שקופיות מיקרוסקופ אור (איור 6).

5. ניתוח סטטיסטי של התנהגות ותוצאות תדמיתיות

הערה: במחקר הנוכחי בוצע ניתוח סטטיסטי ב-SPSS; עם זאת, ניתן לבצע את הניתוח הסטטיסטי בארגזי כלים סטטיסטיים אחרים.

  1. טען את הנתונים בפורמט הרחב בקובץ SPSS *.sav.
  2. לבצע ניתוח מדידות חוזרות של שונות (ANOVA) כדי להשוות את תוצאות ההתנהגות (משקל מנורמל, mNSS ומשך הליכת האלומה) והתמונה (ערכי FA בקליפת המוח וב-CC) לאורך זמן בין קבוצות.
    1. לחץ על נתח > מודל ליניארי כללי > מדידות חוזרות.
    2. הקצה שם בתיבה שם גורם בתוך הנושא (למשל, זמן) ושים '3' בתיבה מספר רמות (שלוש רמות עם נקודות זמן שונות למעקב). הקצה שם בתיבה Measure Name (לדוגמה, mNSS) בתיבת הדו-שיח Repeated Measures Define Factor(s).
    3. טען את המשתנים בתוך הנבדק (נתונים שנרכשו בטרום, D1 ו-D50 לאחר CHI) שיש לבדוק וציין את הגורם בין הנבדקים (למשל, קבוצות בעלי חיים עם פרמטרי השפעה שונים) בתיבת הדו-שיח מדידות חוזרות .
    4. בחר בונפרוני כמבחן פוסט הוק עבור גורמי (ים) (למשל, קבוצות בעלי חיים) בתיבת הדו-שיח של השוואות מרובות פוסט-הוק עבור אמצעים נצפים .
      הערה: כדי לתקן השוואות מרובות, השגיאה מסוג I הותאמה באמצעות תיקוני Bonferroni (0.05/3) עבור ההשוואות לאורך זמן. מובהקות סטטיסטית הוגדרה כ-p < 0.05 (מותאם SPSS).
  3. בצע ניתוח ANOVA חד כיווני כדי להשוות את רפלקס היישור והשינוי בנפח קליפת המוח בין הקבוצות.
    1. לחץ על נתח > השווה אמצעים > ANOVA חד-כיווני.
    2. טען את המשתנים (רפלקס יישור ושינוי נפח קליפת המוח) ברשימה התלויה ואת הקבוצות כגורם בתיבת הדו-שיח ANOVA חד-כיוונית .
    3. בחר Bonferroni כבדיקת פוסט הוק בתיבת הדו-שיח ANOVA חד-כיווני: השוואות מרובות פוסט הוק .
      הערה: כדי לתקן השוואות מרובות, שגיאה מסוג I הותאמה באמצעות תיקוני Bonferroni (0.05/5) עבור ההשוואות בין הקבוצות. מובהקות סטטיסטית הוגדרה כ-p < 0.05 (מותאם SPSS).

תוצאות

איור 2 מציג MRI אורכי מבעל חיים מייצג עם CHI מזויף וחוזר ב-SMCx. לא נמצא שבר משמעותי בגולגולת או חבלה מוחית בתמונות משוקללות T2 ב-1 ו-50 יום לאחר CHI. לא נמצאה בצקת או עיוות משמעותי של זיכרון העבודה במפות FA ב-1 ו-50 יום לאחר CHI. כל בעלי החיים שנחשפו ל-CHI במחקר זה שרדו את כל ...

Discussion

מחקר זה נועד לבסס מודל של בעלי חיים של פגיעה מוחית טראומטית קלה (mTBI) כדי להעריך את ההשפעות המצטברות של פגיעות בודדות וחוזרות על עצמן, כמו גם את התוצאות של השפעות על אזורי מוח שונים. מודל פציעת הראש הסגור (CHI), המותאם מפרדיגמת פציעות ירידה במשקל בראש סגור, תוכנן לחקות זעזועי ?...

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים פוטנציאליים לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר מהמועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה (NSTC) של טייוואן (NSTC 113-2314-B-A49-047).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetaminophenCenter Laboratories IncN02BE01
Antibiotics (Dermanest cream)Commwell Pharmaceutial Co., Ltd49391
Antigen Retrival buffer (100x Citrate buffer)AbcamAB93678
Anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibodyBioworld Technology, IncBS6460
Balance beamCustom madeCustom made3 cm depth, 3 cm width, 80 cm length, and 60 cm above the floor
Behavior apparatus
Circular helmetCustom madeCustom madeStainless steel, 10-mm diameter, 1-mm thickness
Closed-head injury
Closed-Head injury impactorCustom madeCustom madeA stainless steel tube (1-m height with 20-mm inner diameter), a secured impactor with a round tip (stainless steel, 10-mm tip diameter) at the bottom of the tube, a weight (stainless steel, 600 g). 
FormalinBioworld Technology, IncC72
Gas Anesthesia Instrument (Vaporizer)RWD Life Science Co.R580S Animal Anesthesia Vaporizers and Accessories
HematoxylinBioman Scientific Co., Ltd17372-87-1
Immunohistology
Immunoperoxidase Secondary Detection system kitBio-Check Laboratories LtdK5007
Isoflurane Panion & BF Biotech Inc.8547
LidocaineStep Technology Co., LtdN01BB02
light microscope slide scannerOlympusBX63
MR-compatible small animal monitoring and gating systemSA InstrumentsModel 1025 The monitoring kit with the respiratory pillow, ECG electrodes, and rectal probe 
MRI
MRI operating councilBrukerBiospecParavision 360 software.
MRI SystemBrukerBiospecPET/MR scanner (PET inline), 7 T, 105 cm  inner bore diameter with gradient set. 
Open field arenaCustom madeCustom made75 cm length, 50 cm width, and 40 cm depth
Pulse oximeterSTARR Life Sciences Corp. MouseOx PlusMouse & Rat Pulse Oximeter
Rat AdaptorsRWD Life Science Co.68021
SPSS Statistics 29IBMVersion 29.0
Stereotaxic frameRWD Life Science Co.G1124901-001
Volume coilBrukerBiospec40-mm inner diameter, transceiver for radiofrequency excitation and signal receiving.
XylazineBayer Taiwan Company Ltd
ZoletilVirbacBN8M3YA

References

  1. Roozenbeek, B., Maas, A. I., Menon, D. K. Changing patterns in the epidemiology of traumatic brain injury. Nat Rev Neurol. 9 (4), 231-236 (2013).
  2. Sosin, D. M., Sniezek, J. E., Thurman, D. J. Incidence of mild and moderate brain injury in the United States, 1991. Brain Inj. 10 (1), 47-54 (1996).
  3. Hayes, J. P., et al. Mild traumatic brain injury is associated with reduced cortical thickness in those at risk for Alzheimer's disease. Brain. 140 (3), 813-825 (2017).
  4. Richter, S., et al. Handling of missing outcome data in traumatic brain injury research: A systematic review. J Neurotrauma. 36 (19), 2743-2752 (2019).
  5. Aungst, S. L., Kabadi, S. V., Thompson, S. M., Stoica, B. A., Faden, A. I. Repeated mild traumatic brain injury causes chronic neuroinflammation, changes in hippocampal synaptic plasticity, and associated cognitive deficits. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (7), 1223-1232 (2014).
  6. Mez, J., et al. Clinicopathological evaluation of chronic traumatic encephalopathy in players of American football. JAMA. 318 (4), 360-370 (2017).
  7. Bodnar, C. N., Roberts, K. N., Higgins, E. K., Bachstetter, A. D. A systematic review of closed head injury models of mild traumatic brain injury in mice and rats. J Neurotrauma. 36 (11), 1683-1706 (2019).
  8. Cheng, C., Lu, C. F., Hsieh, B. Y., Huang, S. H., Kao, Y. J. Anisotropy component of DTI reveals long-term neuroinflammation following repetitive mild traumatic brain injury in rats. Eur Radiol Exp. 8 (1), 82 (2024).
  9. Hoogenboom, W. S., Branch, C. A., Lipton, M. L. Animal models of closed-skull, repetitive mild traumatic brain injury. Pharmacol Ther. 198, 109-122 (2019).
  10. Hoogenboom, W. S., et al. Evolving brain and behaviour changes in rats following repetitive subconcussive head impacts. Brain Commun. 5 (6), fcad316 (2023).
  11. Kao, Y. J., et al. Behavioral and structural effects of single and repeat closed-head injury. AJNR Am J Neuroradiol. 40 (4), 601-608 (2019).
  12. Yu, F., et al. Repetitive model of mild traumatic brain injury produces cortical abnormalities detectable by magnetic resonance diffusion imaging, histopathology, and behavior. J Neurotrauma. 34 (7), 1364-1381 (2017).
  13. Mountney, A., et al. Functional and molecular correlates after single and repeated rat closed-head concussion: Indices of vulnerability after brain injury. J Neurotrauma. 34 (19), 2768-2789 (2017).
  14. Prins, M. L., Alexander, D., Giza, C. C., Hovda, D. A. Repeated mild traumatic brain injury: mechanisms of cerebral vulnerability. J Neurotrauma. 30 (1), 30-38 (2013).
  15. Obenaus, A., et al. Progressive lifespan modifications in the corpus callosum following a single juvenile concussion in male mice monitored by diffusion MRI. bioRxiv. , (2023).
  16. Obenaus, A., et al. A single mild juvenile TBI in male mice leads to regional brain tissue abnormalities at 12 months of age that correlate with cognitive impairment at the middle age. Acta Neuropathol Commun. 11 (1), 32 (2023).
  17. Soni, N., Mohamed, A. Z., Kurniawan, N. D., Borges, K., Nasrallah, F. Diffusion magnetic resonance imaging unveils the spatiotemporal microstructural gray matter changes following injury in the rodent brain. J Neurotrauma. 36 (8), 1306-1317 (2019).
  18. Clement, T., et al. Juvenile mild traumatic brain injury elicits distinct spatiotemporal astrocyte responses. Glia. 68 (3), 528-542 (2020).
  19. Tu, T. W., et al. Radiological-pathological correlation of diffusion tensor and magnetization transfer imaging in a closed head traumatic brain injury model. Ann Neurol. 79 (6), 907-920 (2016).
  20. Zamani, A., et al. White matter changes following experimental pediatric traumatic brain injury: an advanced diffusion-weighted imaging investigation. Brain Imaging Behav. 15 (6), 2766-2774 (2021).
  21. Lavender, A. P., et al. Repeated long-term sub-concussion impacts induce motor dysfunction in rats: A potential rodent model. Front Neurol. 11, 491 (2020).
  22. Bailes, J. E., Petraglia, A. L., Omalu, B. I., Nauman, E., Talavage, T. Role of subconcussion in repetitive mild traumatic brain injury. J Neurosurg. 119 (5), 1235-1245 (2013).
  23. Nowak, M. K., et al. Neuro-ophthalmologic response to repetitive subconcussive head impacts: A randomized clinical trial. JAMA Ophthalmol. 138 (4), 350-357 (2020).
  24. Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. 47, e2586 (2011).
  25. Dewitt, D. S., Perez-Polo, R., Hulsebosch, C. E., Dash, P. K., Robertson, C. S. Challenges in the development of rodent models of mild traumatic brain injury. J Neurotrauma. 30 (9), 688-701 (2013).
  26. Masse, I. O., et al. A novel and translational rat model of concussion combining force and rotation with in vivo cerebral microdialysis. J Vis Exp. (149), e59585 (2019).
  27. Mychasiuk, R., et al. A novel model of mild traumatic brain injury for juvenile rats. J Vis Exp. (94), e51820 (2014).
  28. Li, R., et al. Restoring susceptibility induced MRI signal loss in rat brain at 9.4 T: A step towards whole brain functional connectivity imaging. PLoS One. 10 (4), e0119450 (2015).
  29. Mandeville, J. B., et al. Dynamic functional imaging of relative cerebral blood volume during rat forepaw stimulation. Magn Reson Med. 39 (4), 615-624 (1998).
  30. Braeckman, K., Descamps, B., Vanhove, C. Advanced diffusion imaging in the hippocampus of rats with mild traumatic brain injury. J Vis Exp. 150, e60012 (2019).
  31. Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. Automatica. 11 (285-296), 23-27 (1975).
  32. Chen, J., et al. Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats. Stroke. 32 (4), 1005-1011 (2001).
  33. Li, Z., et al. Progesterone increases circulating endothelial progenitor cells and induces neural regeneration after traumatic brain injury in aged rats. J Neurotrauma. 29 (2), 343-353 (2012).
  34. Moreira, N., et al. Ivermectin reduces motor coordination, serum testosterone, and central neurotransmitter levels but does not affect sexual motivation in male rats. Reprod Toxicol. 74, 195-203 (2017).
  35. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65, e3564 (2012).
  36. Kalman, M., Hajos, F. Distribution of glial fibrillary acidic protein (GFAP)-immunoreactive astrocytes in the rat brain. I. Forebrain. Exp Brain Res. 78 (1), 147-163 (1989).
  37. Takamiya, Y., Kohsaka, S., Toya, S., Otani, M., Tsukada, Y. Immunohistochemical studies on the proliferation of reactive astrocytes and the expression of cytoskeletal proteins following brain injury in rats. Brain Res. 466 (2), 201-210 (1988).
  38. Chary, K., et al. Microstructural tissue changes in a rat model of mild traumatic brain injury. Front Neurosci. 15, 746214 (2021).
  39. Neale, K. J., et al. Repeated mild traumatic brain injury causes sex-specific increases in cell proliferation and inflammation in juvenile rats. J Neuroinflammation. 20 (1), 250 (2023).
  40. Bolton-Hall, A. N., Hubbard, W. B., Saatman, K. E. Experimental designs for repeated mild traumatic brain injury: Challenges and considerations. J Neurotrauma. 36 (8), 1203-1221 (2019).
  41. Marmarou, A., et al. A new model of diffuse brain injury in rats. Part I: Pathophysiology and biomechanics. J Neurosurg. 80 (2), 291-300 (1994).
  42. Berman, R., et al. Loss of consciousness and righting reflex following traumatic brain injury: Predictors of post-injury symptom development (a narrative review). Brain Sci. 13 (5), 750 (2023).
  43. LaPlaca, M. C., et al. Preclinical common data elements for traumatic brain injury research: progress and use cases. J Neurotrauma. 38 (10), 1399-1410 (2021).
  44. Shultz, S. R., et al. Clinical relevance of behavior testing in animal models of traumatic brain injury. J Neurotrauma. 37 (22), 2381-2400 (2020).
  45. Mandino, F., et al. Animal functional magnetic resonance imaging: Trends and path toward standardization. Front Neuroinform. 13, 78 (2019).
  46. Kahriman, A., Bouley, J., Bosco, D. A., Shazeeb, M. S., Henninger, N. Differential association of baseline body weight and body-weight loss with neurological deficits, histology, and death after repetitive closed head traumatic brain injury. Neurosci Lett. 771, 136430 (2022).
  47. Choi, S., et al. DTI at 7 and 3 T: systematic comparison of SNR and its influence on quantitative metrics. Magn Reson Imaging. 29 (6), 739-751 (2011).
  48. Yao, X., et al. Effect of increasing diffusion gradient direction number on diffusion tensor imaging fiber tracking in the human brain. Korean J Radiol. 16 (2), 410-418 (2015).
  49. Bielanin, J. P., Metwally, S. A. H., Paruchuri, S. S., Sun, D. An overview of mild traumatic brain injuries and emerging therapeutic targets. Neurochem Int. 172, 105655 (2024).
  50. Kim, E., Yoo, R. E., Seong, M. Y., Oh, B. M. A systematic review and data synthesis of longitudinal changes in white matter integrity after mild traumatic brain injury assessed by diffusion tensor imaging in adults. Eur J Radiol. 147, 110117 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE218

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved