Développement d’un modèle simple de traumatisme craniocérébral léger modifié par la méthode de chute de poids et mis en évidence par imagerie par résonance magnétique

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour établir un modèle animal de traumatisme crânien fermé reproduisant le résultat de la neuroimage d’une lésion cérébrale traumatique légère non compliquée avec la structure cérébrale préservée dans la phase aiguë et l’atrophie cérébrale à long terme. L’imagerie par résonance magnétique longitudinale est la principale méthode utilisée pour la preuve.

Résumé

Les lésions cérébrales traumatiques légères (TCL), connues sous le nom de commotions cérébrales, représentent plus de 85 % des lésions cérébrales dans le monde. Plus précisément, les traumatismes crâniens légers non compliqués qui montrent des résultats négatifs à l’imagerie clinique de routine en phase aiguë entravent les soins précoces et appropriés chez ces patients. Il a été reconnu que différents paramètres d’impact peuvent affecter et même accélérer la progression des symptômes neuropsychologiques ultérieurs après un TCL. Cependant, l’association des paramètres d’impact pendant la commotion cérébrale avec l’issue n’a pas été examinée en profondeur. Dans la présente étude, un modèle animal avec un traumatisme crânien fermé (CHI) modifié à partir du paradigme de la perte de poids a été décrit et démontré en détail. Des rats Sprague-Dawley mâles adultes (n = 20) ont été répartis au hasard dans des groupes d’IRC avec différents paramètres d’impact (n = 4 par groupe). Des études d’imagerie IRM longitudinales, y compris l’imagerie pondérée en T2 et l’imagerie du tenseur de diffusion, ainsi que des évaluations comportementales séquentielles, telles que le score de gravité neurologique modifié (mNSS) et le test de marche en faisceau, ont été menées sur une période d’étude de 50 jours. Une coloration immunohistochimique pour l’astrogliose a été réalisée le 50e jour après la blessure. Une moins bonne performance comportementale a été observée chez les animaux après un CHI répétitif par rapport au groupe de blessure unique et de simulacre. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) longitudinale a permis d’observer une contusion cérébrale significative 24 heures après la blessure. Néanmoins, une atrophie corticale et une altération de l’anisotropie fractionnelle corticale (AF) ont été démontrées au 50e jour après la blessure, suggérant la réplication réussie d’un TCL clinique non compliqué. Plus important encore, les changements dans les résultats neurocomportementaux et les caractéristiques de l’image observés après un TCL dépendaient du nombre d’impacts, des intervalles entre les blessures et du site d’impact choisi chez les animaux. Ce modèle de TCLm in vivo , combiné à l’IRM préclinique, offre un moyen d’explorer les lésions cérébrales à l’échelle du cerveau entier. Il permet également d’étudier des biomarqueurs d’imagerie sensibles aux TCL à travers différents paramètres d’impact et niveaux de gravité.

Introduction

Les traumatismes craniocéphaliques légers (TCL) sont principalement observés chez les athlètes pratiquant des sports de contact, les anciens combattants et les personnes impliquées dans des accidents de la route¹. Il représente plus de 85 % de tous les traumatismes crâniens signalés². La vaste étiologie du TCL et son incidence mondiale croissante soulignent l’inclusion du TCL comme facteur de risque environnemental provisoire de la maladie neurodégénérative tardive³. Un traumatisme crânien léger non compliqué se caractérise par un score de coma de Glasgow (GCS) de 13-15, sans anomalie structurelle observée dans la tomodensitométrie (TDM) ou l’imagerie par résonance magnétique (IRM). Les symptômes courants ressentis par les patients atteints d’un TCL non compliqué comprennent des maux de tête, des étourdissements, des nausées ou des vomissements et de la fatigue. Cependant, l’évaluation longitudinale des résultats après un TCL non compliqué présente des défis considérables en raison du taux élevé d’abandon chez les patients⁴.

Les préoccupations concernant les traumatismes crâniens légers répétitifs ont augmenté, en particulier au sein de la communauté des athlètes professionnels de la National Football League (NFL), ce qui a permis de sensibiliser les athlètes non professionnels⁵. On présume que la vulnérabilité cérébrale augmente après le TCL initial, les insultes ultérieures pouvant exacerber les conséquences des blessures. Des résultats récents de la plus grande cohorte de joueurs de football ayant fait don de cerveaux ont non seulement impliqué une participation antérieure au football dans la gravité de l’encéphalopathie traumatique chronique (ETC), mais ont également suggéré une corrélation entre différents facteurs liés au football et le risque et la gravité de l’ETC⁶. Par conséquent, l’influence du nombre de commotions cérébrales et du régime répétitif sur les conséquences des blessures suscite de plus en plus d’inquiétudes. La recherche préclinique a exploré les changements neuropathologiques, la cascade neuroinflammatoire et les troubles neuropsychologiques après un traumatisme crânien répétitif en utilisant divers modèles de traumatismes crâniens fermés (CHI) 7,8,9,10,11,12,13,14 . Cependant, l’étude des paramètres d’impact sur le modèle de TCL non compliqué, qui peut imiter étroitement les chocs répétitifs à la tête liés au sport entraînant une déficience fonctionnelle dans la phase aiguë et une atrophie cérébrale dans la phase chronique, n’a pas été bien examinée.

L’imagerie du tenseur de diffusion (DTI), une technique d’évaluation de la diffusion des molécules d’eau, a été couramment utilisée dans les études portant sur les effets des TCL. L’anisotropie fractionnelle (AF), une mesure clé dérivée du DTI, quantifie le degré de cohérence de la diffusivité de l’eau et fournit des informations sur l’organisation structurelle des axones et des faisceaux de fibres nerveuses. La perturbation des valeurs de FA dans la substance blanche (WM) a été proposée à la suite d’un TCL dans divers modèles 8,10,11,15,16,17. De plus, la diffusivité axiale (DA) et la diffusivité radiale (DR), indiquant l’intégrité axonale et myéline, ont changé après un TCL dans les études précliniques 10,15,16,18,19,20. Cependant, les divergences entre les résultats de l’ITD et ceux des études antérieures sont probablement dues à des variations dans la gravité des TCL, à des différences dans les paramètres d’impact, à la diversité des modèles de TCL et à des points temporels de suivi post-blessure^{incohérents 9}.

Le présent document de protocole vise donc à établir un modèle animal de TCLm conçu pour évaluer les effets cumulatifs des TCL uniques et répétitifs. Nous avons intégré des évaluations complètes et longitudinales, y compris des évaluations du bien-être animal, des résultats comportementaux, des paramètres DTI et du volume cortical, afin de saisir les changements dynamiques post-blessure et d’explorer les effets de différents paramètres d’impact. En démontrant à la fois une déficience fonctionnelle aiguë et des changements microstructurels à long terme, ce modèle reproduit efficacement les principales caractéristiques des traumatismes crâniens légers non compliqués qui n’ont pas été entièrement abordées dans les études animales précédentes. Ici, nous avons fourni un protocole détaillé pour développer un modèle simple de TCL à l’aide d’une méthode modifiée de chute de poids à tête fermée ^8,11 et effectuer une évaluation longitudinale après un TCL.

Protocole

L’étude a été réalisée conformément aux recommandations des National Institutes of Health Guidelines for Animal Research (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals) et des lignes directrices Animal Research : Reporting In Vivo Experiments. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université nationale Yang Ming Chiao Tung. Vingt animaux ont été répartis aléatoirement en 5 groupes (n = 4 par groupe) : (i) impact simple au niveau du cortex sensorimoteur (SMCx/simple), (ii) double impact au SMCx avec l’intervalle de 1 h (SMCx/2 coups/1 h), (iii) double impact au SMCx avec l’intervalle de 10 min (SMCx/2 coups/10 min), (iv) double impact au cerveau central avec l’intervalle de 1 h (Central/2 coups/1 h), et (v) le groupe placebo avec chirurgie seulement, mais sans impact direct à la tête, pour l’évaluation longitudinale des résultats (figure 1). Il convient de noter que les intervalles entre les blessures sélectionnés pour cette étude (intervalles de 1 h par rapport à 10 minutes) ont été conçus pour imiter les impacts sous-commotionnels répétitifs 8,10,11,13,21, qui peuvent être jusqu’à mille fois au cours d’une même saison, subis par les athlètes pratiquant des sports de contact ^22,23.

1. Induction d’un traumatisme crânien fermé (CHI)

REMARQUE : Les rats Sprague-Dawley mâles adultes âgés de 10 à 12 semaines et pesant plus de 250 g sont logés sous un cycle lumière/obscurité de 12/12 h avec accès ad libitum à la nourriture et à l’eau.

1. Placez le rat dans une petite chambre d’induction et anesthésiez-le avec un mélange d’isoflurane (5 %) et d’air médical (2,5-3 L/min). Retirez le rat de la chambre jusqu’à ce qu’il ne réponde plus à un pincement de la patte ou de la queue.
2. Placez le rat sur le coussin chauffant.
   REMARQUE : Allumez le coussin chauffant pendant la chirurgie pour maintenir la température corporelle des rats.
3. Amenez le rat sur un cadre stéréotaxique et fixez-le avec une barre dentée. Administrer l’isoflurane à 2 % à l’aide du cône nasal connecté avec de l’air médical à un débit de 1,5 à 2 L/min pour l’entretien pendant la chirurgie.
4. Positionnez les barres d’oreille. Assurez-vous que le rat est centré et symétrique sur le cadre stéréotaxique.
   REMARQUE : Toutes les interventions chirurgicales doivent être effectuées dans des conditions aseptiques. Les instruments ont été stérilisés avant l’opération à l’aide d’un autoclave à vapeur, et leurs pointes ont été stérilisées avec un stérilisateur à billes pendant la procédure. Pour éviter toute contamination, un champ chirurgical a été placé sur l’animal. Le chirurgien portait un bonnet pour couvrir leurs cheveux, un masque pour couvrir leur visage, et était équipé d’une blouse de laboratoire et de gants chirurgicaux pendant la procédure^24.
5. Placez le capteur de l’oxymètre de pouls sur la patte arrière de l’animal pour surveiller la fréquence respiratoire, la fréquence cardiaque, le niveau d’oxygène dans le sang et la température corporelle de l’animal.
6. Injecter 1 mL/kg de poids corporel de lidocaïne (20 mg/mL) par voie sous-cutanée dans le cou du rat comme analgésique.
7. Appliquez la crème dépilatoire sur la tête de l’animal et attendez 3 min. Essuyez la crème avec des tampons d’alcool isopropylique à 70 %.
8. Nettoyez plusieurs fois la zone rasée à l’aide d’un coton-tige stérile imbibé d’iode. Éliminez les résidus d’iode à l’aide d’un coton-tige imbibé d’éthanol à 70 %.
9. Créez une incision médiane d’environ 2 à 2,5 cm de longueur dans la peau rasée à l’aide d’une lame chirurgicale stérile pour accéder à la surface du crâne.
10. Retirez le tissu de l’os à l’aide d’un coton pour exposer le crâne. Nettoyez la surface du crâne à l’aide d’un coton-tige imbibé de solution saline à 0,9 %, puis nettoyez-le avec un coton sec.
    REMARQUE : Les sutures du crâne et le bregma et le lambda peuvent maintenant être facilement identifiés.
11. Identifiez le bregma comme point de référence pour déterminer plus précisément la zone d’impact en fonction de la coordonnée.
    REMARQUE : Dans ce protocole, deux ensembles de coordonnées sont utilisés pour l’induction du CHI : (-2,5,--2,0) (2,5 mm latéraux 2,0 mm postérieurs au bregma) au-dessus du cortex sensorimoteur (SMCx), ainsi que (0,-3,0) au-dessus du cerveau central (central).
12. Identifiez les coordonnées choisies à la surface du crâne et collez un casque circulaire en acier inoxydable (10 mm de diamètre et 1 mm d’épaisseur) sur la zone désignée à l’aide de ciment dentaire. Retirez le coussin chauffant et l’oxymètre de pouls.
13. Déplacez l’appareil stéréotaxique et le rat sur la table élévatrice (14 cm de longueur, 8 cm de largeur et 6,15 cm de profondeur) sous l’impacteur CHI.
14. Surélevez le corps du rat à l’aide d’une éponge en mousse (19 cm de longueur, 10 cm de largeur et 4 cm de profondeur, avec une densité de 18 kg/m³).
15. Retirez le rat des barres d’oreille du cadre stéréotaxique. Gardez le rat immobile sur la barre dentée reliée au cône nasal, délivrant 2 % d’isoflurane. Assurez-vous que la tête et le corps sont alignés au niveau de la direction rostrale-caudale.
16. Ajustez la table élévatrice pour éviter tout espace entre l’impacteur CHI et le casque. Éteignez l’isoflurane 5 s juste avant l’impact.
    REMARQUE : Pour spécifier le réflexe de redressement dû à une lésion cérébrale, l’arrêt temporaire de l’isoflurane a été effectué²⁵.
17. Larguez un laiton de 600 g d’une hauteur de 1 m à travers un tube en acier inoxydable (1 m de hauteur avec un diamètre intérieur de 20 mm pour dégager une colonne de poids en laiton inoxydable) jusqu’à l’impacteur sécurisé avec une pointe ronde visant le casque métallique.
    REMARQUE : Les animaux du groupe placebo n’ont pas subi d’impact, car la goutte de laiton a été libérée sans entrer en contact avec le casque sur la tête du rat.
18. Abaissez la table élévatrice. Retirez le rat du cadre stéréotaxique et placez-le en position couchée sur un coussin chauffant.
19. Enregistrez le moment du réflexe de redressement, c’est-à-dire le moment où l’animal tente de passer de la position couchée à la position couchée à la position couchée^26,27.
    REMARQUE : Les animaux soumis au CHI répétitif ont été anesthésiés à nouveau 3 min avant le 2ème^impact. Pour les animaux du groupe SMCx/double/10 min qui ne sont pas retournés à temps en position couchée, le temps correspondant du réflexe de redressement a été enregistré comme étant de 420 s.
20. Après l’enregistrement du réflexe de redressement, anesthésie à nouveau le rat avec de l’isoflurane en utilisant l’étape 1.1.
21. Immobilisez le rat avec le cadre stéréotaxique à l’aide de l’étape 1.2.
    REMARQUE : Après avoir confirmé la stabilité du casque sur le dessus du stull, répétez à nouveau les étapes 1.13-1.17 pour effectuer le^{2ème impact.}
22. Retirez le casque. Retirez tout le tissu conjonctif et le ciment sur le dessus du crâne.
23. Couvrez le crâne avec le ciment dentaire et laissez-le sécher. Vérifiez que le ciment dentaire est rigide et dur à l’aide de la pince à épiler.
    REMARQUE : Le ciment dentaire a été appliqué sur le crâne pour éliminer les artefacts de sensibilité causés par les interfaces crâne-air ou crâne-sang entre le crâne et le cuir chevelu après la chirurgie.
24. Fermez l’incision à l’aide de sutures chirurgicales en nylon 4-0 avec 4-5 nœuds indépendants.
    REMARQUE : La plaie mesure environ 2 à 2,5 cm de longueur. Assurez-vous que les sutures chirurgicales n’ont pas d’action capillaire et qu’elles sont faites de soie ou de nylon. Ne suturez pas l’incision à l’aide d’un seul nœud pour éviter l’ouverture de la plaie par le grattage de l’animal.
25. Appliquez des antibiotiques topiques (crème Dermanest) sur le site chirurgical pour prévenir les infections.
26. Injecter 1 mL/kg de poids corporel de carprofène (50 mg/mL) par voie sous-cutanée dans le cou comme analgésique post-opératoire.
27. Placez le rat dans une cage propre sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’il reprenne conscience. Une fois que le rat est assis droit, remettez-le dans la cage de la maison.
28. Administrer par voie orale 5 mL d’acétaminophène (24 mg/mL) mélangé à 200 mL d’eau à l’animal tous les jours comme analgésique pendant 3 jours consécutifs après la chirurgie.

2. Imagerie par résonance magnétique (IRM)

REMARQUE : L’image pondérée en T2 et l’imagerie du tenseur de diffusion sont réalisées à l’aide d’un système séquentiel TEP/IRM 7T avant le CHI, ainsi que 1 et 50 jours après la blessure (Figure 1). Une IRM de base a été réalisée dans la semaine précédant l’intervention CHI. Pour les évaluations à 1 et 50 jours après le CHI, les évaluations comportementales ont été effectuées le matin, suivies d’IRM l’après-midi le même jour.

1. Anesthésier le rat dans une petite chambre d’induction remplie d’un mélange d’isoflurane (5 %) et d’air médical (2,5-3 L/min).
2. Une fois que le rat ne répond plus à un pincement de la patte ou de la queue, suspendez temporairement l’anesthésie lors du transfert vers le berceau de l’animal en position couchée tête première.
3. Positionnez le rat dans le support de tête relié à un cône nasal, délivrant 2 % d’isoflurane avec de l’air médical à un débit de 1,5 à 2 L/min pour la maintenance pendant l’acquisition de l’image.
4. Fixez la tête avec un petit morceau de ruban adhésif pour éviter tout mouvement pendant le balayage.
   REMARQUE : Appliquez un peu de dentifrice sur la tête du rat le premier jour post-CHI pour prévenir les artefacts de susceptibilité magnétique dus à l’ablation du cuir chevelu^28,29.
5. Placez un coussin de pression sous le thorax du rat pour surveiller la respiration. Collez les clips de l’oxymètre sur le membre arrière pour surveiller la fréquence cardiaque.
6. Insérez la sonde rectale pour mesurer la température rectale. Couvrez le rat avec une couverture chauffante avec de l’eau chaude en circulation et un enveloppement de tissu pendant l’expérience pour maintenir la température corporelle.
   REMARQUE : Tout au long de l’expérience, surveillez les conditions physiologiques, y compris la fréquence cardiaque, la fréquence respiratoire et la température rectale. Avant le balayage, vérifiez tous les signaux physiologiques du rat pour vous assurer de la qualité du moniteur de signes vitaux.
7. Utilisez le système de positionnement laser du scanner TEP/IRM pour marquer le centre de la tête afin un alignement précis.
8. Déplacez automatiquement l’animal dans l’alésage de l’IRM à l’aide du système de transport motorisé d’animaux jusqu’à ce que le centre de la tête s’aligne avec l’isocentre du scanner.
   REMARQUE : Le système de transport d’animaux motorisé intégré au système TEP/IRM assure un positionnement précis des animaux et rationalise le flux de travail lors de la transition entre les modalités d’imagerie.
9. Obtenez la séquence IRM.
   1. Effectuez la localisation initiale et le réglage global.
   2. Utilisez la tranche sagittale du milieu et alignez la 8^ème tranche à partir de la tranche antérieure avec la décussation de la commissure antérieure.
      REMARQUE : Les tranches coronales sont positionnées perpendiculairement au plan horizontal défini par la ligne reliant la commissure antérieure et la base du cervelet, correspondant à un angle d’environ 15° par rapport à l’axe long du corps calleux. Les paramètres clés du balayage T2-RARE pour la tranche sagittale moyenne sont les suivants : temps de répétition (TR) = 2500 ms, temps d’écho (TE) = 44 ms, champ de vision (FOV) = 3,5 cm, taille de la matrice = 256 256, épaisseur de la tranche = 1 mm, nombre de tranches = 1, facteur RARE = 8, bande passante = 75 kHz, nombre de moyennes = 1, temps d’acquisition = 1 min 20 s.
   3. Utilisez l’acquisition rapide avec amélioration de la relaxation (RARE) avec suppression de la graisse et une bande de saturation sous le cerveau pour obtenir des images pondérées en T2 pour référence anatomique (Figure 2).
      REMARQUE : Les paramètres clés du balayage T2-RARE sont les suivants : temps de répétition (TR) = 3600 ms, temps d’écho (TE) = 40 ms, champ de vision (FOV) = 2 cm, taille de la matrice = 256 256, épaisseur de la tranche = 1 mm, nombre de tranches = 16, facteur RARE = 8, bande passante = 75 kHz, nombre de moyennes = 8, temps d’acquisition = 7 min 40 s.
   4. Utilisez un EPI à écho de spin à 4 prises pour acquérir des images du tenseur de diffusion (Figure 2).
      REMARQUE : Les paramètres clés du balayage DTI sont les suivants : TR = 3000 ms, TE = 28 ms, champ de vision (FOV) = 2 cm, taille de la matrice = 96 96, épaisseur = 1 mm, nombre de coupes = 16, durée de l’impulsion (δ) = 5 ms, temps entre les deux impulsions (Δ) = 15 ms, nombre de B0 = 5, nombre de directions = 30, Valeur b = 1000 s/mm³, bande passante = 150 kHz, nombre de moyennes = 4, temps d’acquisition = 14 min.
   5. Terminez le protocole d’analyse. Faites glisser le berceau de l’animal hors de l’aimant. Retirez l’animal du berceau.
   6. Transférez le rat dans une cage propre avec un coussin chauffant en dessous pour maintenir sa température corporelle. Remettez le rat dans sa cage d’origine une fois qu’il a repris conscience.
10. Prétraitement de l’image
    REMARQUE : utilisez MRtrix3, le logiciel de cartographie paramétrique statistique (SPM) et des scripts MATLAB personnalisés pour le traitement et l’analyse des données.
    1. Débruitez les images DTI à l’aide de la commande MRtrix3 (dwidenoise)³⁰.
    2. Supprimez les artefacts de sonnerie de Gibb des images DTI à l’aide de la commande MRtrix (mrdegibbs)³⁰.
    3. Co-enregistrez les images DTI avec les images pondérées T2 du sujet unique sur des balayages longitudinaux à l’aide des fonctions SPM (spm_coreg.m et spm_powell.m).
    4. Effectuez un décapage du crâne sur des images pondérées en T2 en contournant manuellement la zone du cerveau tranche par tranche, puis en supprimant les pixels dont l’intensité est inférieure au seuil calculé déterminé par la méthode³¹ d’Otsu (script MATLAB personnalisé thr_otsu2.m).
    5. Effectuer des co-enregistrements inter-sujets entre animaux d’un même groupe expérimental à l’aide des fonctions SPM (spm_coreg.m et spm_powell.m). Appliquez le masque cérébral aux images DTI correspondantes.
       REMARQUE : Le décapage du crâne est effectué pour réduire le temps de traitement de l’ordinateur.
    6. Calculez des cartes tensorielles basées sur DTI (script MATLAB personnalisé, tensormap.m).
    7. Calcul de cartes FA (script MATLAB personnalisé, calFA.m)
       REMARQUE : tous les scripts MATLAB personnalisés sont disponibles via la base de données suivante (https://doi.org/10.57770/9ZESXD).
11. Analyse d’images-FA
    1. Dessinez des régions d’intérêt (ROI) dans le cortex et le corps calleux (CC) pour les trois tranches d’image consécutives sous la coordonnée de CHI.
       REMARQUE : Tous les retours d’enquête ont été dessinés manuellement et inspectés visuellement pour détecter les erreurs grossières par 2 chercheurs expérimentés qui ont ignoré les groupes expérimentaux.
    2. Extrayez et faites la moyenne de la valeur FA des ROI.
       REMARQUE : Pour le corps calleux situé sous le cortex, les pixels dont les valeurs sont < 0,35 ont été exclus de la zone d’intérêt sélectionnée afin d’éliminer les effets de volume partiel. Pour le cortex, tous les pixels avec des valeurs de FA < 0,35 dans le ROI ont été recrutés pour l’analyse.
12. Analyse d’image-Volume
    1. Dessinez manuellement des zones d’intérêt couvrant les régions corticales pour 11 coupes d’image consécutives à Bregma -7 à +3 mm.
       REMARQUE : Tous les retours d’enquête ont été dessinés manuellement par 2 chercheurs expérimentés à l’insu des groupes expérimentaux.
    2. Additionnez le nombre total de pixels des zones d’intérêt sur les tranches et transformez-les en volume en multipliant l’épaisseur de la tranche (1 mm).
    3. Normaliser le volume cortical après le CHI avec le volume correspondant avant CHI de chaque animal.
       REMARQUE : Normalisez les données pour éliminer les différences individuelles de volume cérébral entre les animaux avant la présentation.

3. Évaluation du comportement

REMARQUE : Les expériences comportementales sont réalisées à l’aide du test d’équilibre de la marche de faisceau et du mNSS avant le CHI, ainsi que sur 1 et 50 jours après le CHI (Figure 1). Toute l’évaluation a été effectuée par au moins deux observateurs afin d’assurer l’exactitude, la cohérence et l’objectivité des données recueillies.

1. Test d’équilibre de la marche sur la poutre
   1. Allumez la caméra vidéo et démarrez la minuterie.
   2. Placez les rats à une extrémité de la poutre d’équilibre (3 cm de profondeur, 3 cm de largeur, 80 cm de longueur et 60 cm au-dessus du sol).
   3. Arrêtez le chronomètre une fois que le rat a terminé un aller-retour, tombe ou se fige pendant 3 minutes.
      1. Au cours de l’expérience, observez l’état de l’animal pour l’évaluation à l’aide de mNSS 11,32,33,34. Suivez ces normes d’évaluation :
      2. Si le rat maintient l’équilibre avec une posture stable sur la poutre, attribuez un score de 0.
      3. Si le rat saisit le côté de la poutre, attribuez une note de 1.
      4. Si le rat tombe avec un membre de la poutre, attribuez-lui une note de 2.
      5. Si le rat tombe avec deux membres hors de la poutre ou tourne sur la poutre (>60 s), attribuez-lui une note de 3.
      6. Si le rat tente de se tenir en équilibre sur la poutre mais tombe (>40 s), attribuez-lui une note de 4.
      7. Si le rat tente de se tenir en équilibre sur la poutre mais tombe (>20 s), attribuez-lui une note de 5.
      8. Si le rat n’essaie pas de se tenir en équilibre ou de s’accrocher à la poutre et tombe dans les 20 s, attribuez une note de 6.
      9. Si le rat ne parvient pas à terminer la tâche, considérez qu’il a pris le temps maximum de 3 minutes et attribuez-lui un score de 6.
   4. Planifiez des journées de test à des moments précis.
      REMARQUE : Excluez les rats qui n’ont pas terminé l’aller-retour en faisceau pour deux essais avant l’CHI de la chirurgie subséquente et de l’évaluation comportementale de suivi.
2. Score de gravité neurologique modifié (mNSS)
   REMARQUE : L’évaluation mNSS comprend des tests moteurs, des tests sensoriels, l’absence de réflexe, des mouvements anormaux, l’équilibre de la poutre et la marche au sol ^32,33, qui a été rapidement effectuée quotidiennement.
   1. Effectuer des tests de moteur.
      1. Soulevez le rat par la base de la queue et observez les réflexes de ses membres pendant environ 15 secondes pour évaluer la flexion et l’extension appropriées.
      2. Si une flexion normale est observée dans le membre antérieur, attribuez un score de 0. Si aucune flexion n’est observée, attribuez un score de 1.
      3. Si une flexion normale est observée dans les membres postérieurs, attribuez un score de 0. Si aucune flexion n’est observée, attribuez un score de 1.
      4. Si la tête se déplace de >10° par rapport à l’axe vertical dans les 30 s qui suivent le soulèvement du rat par la queue, attribuez un score de 0. Si ce n’est pas le cas, attribuez une note de 1.
         REMARQUE : Un maximum de 3 scores sera attribué dans cette session du test.
   2. Effectuez des tests de mise en place des membres.
      REMARQUE : Le test de mise en place est effectué pour évaluer la coordination entre la fonction sensorielle (visuelle, sensation tactile et proprioception) et la fonction motrice.
      1. Abaissez lentement le rat vers la surface de la table. Observez si les pattes des rats ont atteint et se sont étirées vers la surface.
      2. Si les rats ont atteint la surface avec les deux membres tendus et vers l’avant, attribuez un score de 0. S’il y a un retard ou s’il n’y a pas de réponse, attribuez un score de 1.
      3. Placez le rat sur la surface et tirez la patte contre le bord de la table. Observez si sa patte revient à une position normale sur la surface de la table.
      4. Si des réponses de placement immédiates et normales sont observées, attribuez une note de 0. Si des réponses de placement différé sont observées, attribuez une note de 1. S’il n’y a pas de réponse, attribuez une note de 2.
         REMARQUE : Un maximum de 3 scores sera attribué dans cette session du test.
   3. Observer l’absence réfléchie et les mouvements anormaux.
      1. Observez les secousses de la tête pour évaluer le réflexe du pavillon lorsque vous touchez le méat auditif avec l’extrémité en coton d’un coton-tige.
      2. Si un réflexe normal est observé, attribuez un score de 0. Si aucun réflexe n’est observé, attribuez une note de 1.
      3. Évaluez la présence du réflexe cornéen en touchant la cornée avec l’extrémité en coton d’un coton-tige.
      4. Si une réponse normale est obtenue, attribuez un score de 0. Si aucune réponse de clignement des yeux n’est déclenchée, attribuez un score de 1.
      5. Faites un claquement court et fort des mains. Observez la présence du réflexe de sursaut.
      6. Si un réflexe est observé, attribuez un score de 0. Si aucun réflexe n’est observé, attribuez une note de 1.
      7. Observez si le rat a des convulsions, une myoclonie ou une myodystonie.
      8. Si l’un d’entre eux se produit, attribuez une note de 1.
         REMARQUE : Un maximum de 4 scores seront attribués dans cette session du test.
   4. Effectuez le test d’équilibre de la poutre comme décrit précédemment (étape 3.1).
      REMARQUE : Un maximum de 6 scores sera attribué dans cette session du test.
   5. Effectuez le test de marche sur le sol.
      1. Préparez l’arène en plein champ (75 cm de longueur, 50 cm de largeur et 40 cm de profondeur). Assurez-vous qu’il est propre et exempt de tout signe d’odeur antérieur.
      2. Placez un rat au centre de l’arène en plein champ et observez comment le rat se promène dans l’arène.
      3. Si le rat effectue une promenade régulière, attribuez un score de 0.
      4. Si le rat ne peut pas marcher droit, attribuez un score de 1.
      5. Si le rat tombe du côté parétique après l’avoir posé sur le sol, attribuez un score de 3.
         REMARQUE : Un maximum de 3 scores sera attribué dans cette session du test.
   6. Additionnez tous les scores ; Le score maximum possible est de 18.
      REMARQUE : Le score le plus élevé indique un résultat moins bon.

4. Immunohistologie

1. Effectuer une perfusion transcardiaque³⁵.
   REMARQUE : La perfusion transcardiaque est effectuée après l’IRM 50 jours après l’CHI (Figure 1).
   1. Placez le rat dans une petite chambre d’induction et anesthésiez-le avec de l’isoflurane (5 %) jusqu’à ce qu’il ne réponde plus à un pincement de la patte ou de la queue.
   2. Administrer 50 mg/kg de poids corporel de zoletil (50 mg/mL) et 10 mg/kg de poids corporel de xylazine (Roumpun, 23,32 mg/mL) par injection intrapéritonéale pour une anesthésie profonde.
   3. Placez le rat en position couchée.
   4. Faites une incision transversale d’environ 4 à 5 cm de longueur sous le thorax à l’aide de ciseaux.
   5. Localisez le diaphragme et coupez-le pour exposer le cœur.
   6. À l’aide d’une pince hémostatique, clampez l’artère pulmonaire, puis faites une incision d’environ 0,5 à 1 cm de longueur dans l’oreillette droite.
   7. Connectez l’aiguille à la canalisation fixée à la pompe à perfusion.
   8. Insérez l’aiguille dans le ventricule gauche.
   9. Rincer l’animal par perfusion transcardiaque (40 mL/min) avec 500 mL de solution saline à 0,9 % jusqu’à ce que le sang soit éliminé.
   10. Perfuser l’animal par perfusion transcardiaque (40 mL/min) avec 500 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pour la fixation.
   11. Retirez la tête du rat et retirez soigneusement le tissu cérébral du crâne.
   12. Conservez le cerveau dans environ 20 ml de PFA à 4 % dans la bouteille pendant 48 h pour la post-fixation.
2. Effectuer le traitement des tissus et la coloration IHC^36,37.
   REMARQUE : Effectuez une coloration immunohistochimique sur des coupes de tissus fixées au formol et incluses dans la paraffine à l’aide du kit du système de détection secondaire de l’immunoperoxydase.
   1. Utilisez des coupes de tissus fixées au formol et incluses en paraffine.
   2. Effectuer la déparaffinisation et traiter les lames avec 3 %_{de H2}O₂ pour bloquer l’activité de la peroxydase endogène. Effectuer le prélèvement de l’antigène à l’aide d’un tampon de citrate à 90 °C.
   3. Effectuer une coloration immunohistochimique à l’aide du kit du système de détection secondaire de l’immunoperoxydase.
      REMARQUE : Les procédures de coloration sont effectuées conformément aux recommandations du fabricant.
   4. Utilisez de l’hématoxyline pour contre-colorer les échantillons.
   5. Montez les échantillons avec un réactif anti-décoloration.
   6. Utilisez des anticorps anti-protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) pour la coloration immunohistochimique.
   7. Acquérez les images des zones d’intérêt à l’aide d’un scanner de lames de microscope optique (Figure 6).

5. Analyse statistique des résultats du comportement et de l’image

REMARQUE : Dans la présente étude, une analyse statistique a été effectuée dans SPSS ; Cependant, l’analyse statistique peut être effectuée dans d’autres boîtes à outils statistiques.

1. Chargez les données au format large dans un fichier SPSS *.sav.
2. Effectuer une analyse de variance à mesures répétées (ANOVA) pour comparer les résultats comportementaux (poids normalisé, mNSS et durée de la marche en faisceau) et d’image (valeurs FA dans le cortex et CC) au fil du temps entre les groupes.
   1. Cliquez sur Analyser > modèle linéaire général > mesures répétées.
   2. Attribuez un nom dans la case Nom du facteur intra-sujet (par exemple, temps) et mettez « 3 » dans la case Nombre de niveaux (trois niveaux avec des points de suivi différents). Attribuez un nom dans la zone Nom de la mesure (par exemple, mNSS) dans la boîte de dialogue Définition du ou des facteurs de mesure répétée.
   3. Chargez les variables intra-sujet (données acquises avant J1, J1 et J50 après le CHI) qui doivent être testées et spécifiez le facteur inter-sujets (par exemple, des groupes d’animaux avec des paramètres d’impact différents) dans la boîte de dialogue Mesures répétées .
   4. Sélectionnez Bonferroni comme test a posteriori pour le(s) facteur(s) (par exemple, les groupes d’animaux) dans la boîte de dialogue Comparaisons multiples post-hoc pour les moyennes observées .
      REMARQUE : Pour corriger les comparaisons multiples, l’erreur de type I a été ajustée à l’aide des corrections de Bonferroni (0,05/3) pour les comparaisons au fil du temps. La signification statistique a été définie comme p < 0,05 (ajusté par le SPSS).
3. Effectuez une analyse ANOVA à sens unique pour comparer le réflexe de redressement et la variation du volume cortical entre les groupes.
   1. Cliquez sur Analyser > comparer les moyennes > ANOVA à un facteur.
   2. Chargez les variables (réflexe de redressement et changement du volume cortical) dans la liste dépendante et les groupes en tant que facteur dans la boîte de dialogue ANOVA à un facteur .
   3. Sélectionnez Bonferroni en tant que test a posteriori dans la boîte de dialogue ANOVA à un facteur : comparaisons multiples a posteriori .
      REMARQUE : Pour corriger les comparaisons multiples, l’erreur de type I a été ajustée à l’aide des corrections de Bonferroni (0,05/5) pour les comparaisons entre les groupes. La signification statistique a été définie comme p < 0,05 (ajusté par le SPSS).

Résultats

La figure 2 montre les IRM longitudinales d’animaux représentatifs présentant un CHI simulé et répétitif au SMCx. Aucune fracture du crâne significative ou contusion cérébrale n’a été observée sur les images pondérées en T2 1 et 50 jours après le CHI. Aucun œdème ou déformation significatif de la MW n’a été trouvé dans les cartes FA 1 et 50 jours après l’CHI. Tous les animaux soumis à l’CHI dans cette étude ont survécu penda...

Discussion

Cette étude visait à établir un modèle animal de traumatisme craniocérébral léger (TCLm) non compliqué afin d’évaluer les effets cumulatifs des lésions uniques et répétitives, ainsi que les résultats des impacts sur différentes régions du cerveau. Le modèle de blessure à la tête fermée (CHI), adapté du paradigme de la blessure à tête fermée et à la chute de poids, a été conçu pour imiter les commotions cérébrales couramment vécues par les athlètes et les ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetaminophen	Center Laboratories Inc	N02BE01
Antibiotics (Dermanest cream)	Commwell Pharmaceutial Co., Ltd	49391
Antigen Retrival buffer (100x Citrate buffer)	Abcam	AB93678
Anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibody	Bioworld Technology, Inc	BS6460
Balance beam	Custom made	Custom made	3 cm depth, 3 cm width, 80 cm length, and 60 cm above the floor
Behavior apparatus
Circular helmet	Custom made	Custom made	Stainless steel, 10-mm diameter, 1-mm thickness
Closed-head injury
Closed-Head injury impactor	Custom made	Custom made	A stainless steel tube (1-m height with 20-mm inner diameter), a secured impactor with a round tip (stainless steel, 10-mm tip diameter) at the bottom of the tube, a weight (stainless steel, 600 g).
Formalin	Bioworld Technology, Inc	C72
Gas Anesthesia Instrument (Vaporizer)	RWD Life Science Co.	R580S Animal Anesthesia Vaporizers and Accessories
Hematoxylin	Bioman Scientific Co., Ltd	17372-87-1
Immunohistology
Immunoperoxidase Secondary Detection system kit	Bio-Check Laboratories Ltd	K5007
Isoflurane	Panion & BF Biotech Inc.	8547
Lidocaine	Step Technology Co., Ltd	N01BB02
light microscope slide scanner	Olympus	BX63
MR-compatible small animal monitoring and gating system	SA Instruments	Model 1025	The monitoring kit with the respiratory pillow, ECG electrodes, and rectal probe
MRI
MRI operating council	Bruker	Biospec	Paravision 360 software.
MRI System	Bruker	Biospec	PET/MR scanner (PET inline), 7 T, 105 cm  inner bore diameter with gradient set.
Open field arena	Custom made	Custom made	75 cm length, 50 cm width, and 40 cm depth
Pulse oximeter	STARR Life Sciences Corp.	MouseOx Plus	Mouse & Rat Pulse Oximeter
Rat Adaptors	RWD Life Science Co.	68021
SPSS Statistics 29	IBM	Version 29.0
Stereotaxic frame	RWD Life Science Co.	G1124901-001
Volume coil	Bruker	Biospec	40-mm inner diameter, transceiver for radiofrequency excitation and signal receiving.
Xylazine	Bayer Taiwan Company Ltd
Zoletil	Virbac	BN8M3YA