ウェイトドロップ法により改変され磁気共鳴画像法により証明された合併症のない軽度外傷性脳損傷モデルの開発

Pin-Hui Kuo; Tzu-Hsuan Tang; Shu-Hui Huang; Bao-Yu Hsieh; Chia-Feng Lu; Yu-Chieh Jill Kao

doi:10.3791/67011

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この記事について

要約
要約
概要
プロトコル
結果
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資料
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転載および許可

要約

ここでは、急性期および長期脳萎縮の保存された脳構造を持つ合併症のない軽度の外傷性脳損傷の神経像結果を再現する閉鎖性頭部外傷動物モデルを確立するためのプロトコルを提示します。縦断的磁気共鳴画像法は、証拠に使用される主要な方法です。

要約

脳震盪として知られる軽度の外傷性脳損傷(mTBI)は、世界の脳損傷の85%以上を占めています。具体的には、急性期の日常的な臨床画像で陰性の所見を示す合併症のないmTBIは、これらの患者の早期かつ適切な治療を妨げます。さまざまな影響パラメーターが、mTBI に続くその後の神経心理学的症状の進行に影響を与え、さらには加速する可能性があることが認識されています。しかし、脳震盪中の影響パラメータと結果との関連は、広くは検討されていません。現在の研究では、体重減少傷害パラダイムから修正された閉鎖性頭部外傷(CHI)の動物モデルが説明され、詳細に実証されました。成体の雄Sprague-Dawleyラット(n = 20)は、異なる影響パラメータ(グループあたりn = 4)を持つCHIグループにランダムに割り当てられました。T2強調イメージングや拡散テンソルイメージングなどの縦断的MRイメージング研究と、修正神経重症度スコア(mNSS)やビームウォークテストなどの逐次行動評価を50日間の研究期間にわたって実施しました。アストログリオーシスの免疫組織化学的染色は、損傷後50日目に実施されました。反復CHI後の動物では、単一の損傷および偽のグループと比較して、行動パフォーマンスの低下が観察されました。縦断的磁気共鳴画像法(MRI)を使用することにより、損傷後24時間で重大な脳挫傷は観察されませんでした。それにもかかわらず、皮質萎縮と皮質分画異方性 (FA) の変化が損傷後 50 日目に示され、臨床的に合併症のない mTBI の再現が成功したことを示唆しています。最も重要なことは、mTBI後に観察された神経行動学的転帰と画像の特徴の変化は、動物における衝撃数、損傷間間隔、および選択された衝撃部位に依存していたことである。この in vivo mTBIモデルと前臨床MRIを組み合わせることで、全脳スケールで脳損傷を探求する手段が得られます。また、さまざまな影響パラメータや重症度レベルでmTBIに敏感なイメージングバイオマーカーの調査も可能になります。

概要

軽度の外傷性脳損傷(mTBI)は、主にコンタクトスポーツに従事するアスリート、退役軍人、および交通事故に巻き込まれた個人に観察されます¹。これは、報告されたすべての頭部外傷の85%以上を占めています²。mTBIの広範な病因とその世界的な発生率の増加は、遅発性神経変性疾患³の暫定的な環境リスク因子としてmTBIが含まれていることを強調しています。合併症のない軽度のTBIは、グラスゴー昏睡スコア(GCS)が13〜15であることを特徴とし、コンピューター断層撮影(CT)または磁気共鳴画像法(MRI)スキャンで構造的異常は観察されません。合併症のないmTBIの患者が経験する一般的な症状には、頭痛、めまい、吐き気または嘔吐、倦怠感などがあります。ただし、合併症のない mTBI 後の転帰の縦断的評価は、患者の脱落率が高いため、かなりの課題を提示します⁴。

特にナショナル・フットボール・リーグ(NFL)のプロアスリート・コミュニティ内で、反復的なmTBIの懸念が高まっており、その結果、非プロ・アスリートの意識が高まっている⁵。脳の脆弱性は、最初のmTBI後に増加すると推定され、その後の侮辱は怪我の結果を悪化させる可能性があります。フットボール選手の最大の脳提供コホートからの最近の発見は、慢性外傷性脳症(CTE)の重症度に以前のフットボール参加が関与しているだけでなく、さまざまなフットボール関連要因と^CTE6のリスクおよび重症度との間の相関関係も示唆しています。したがって、脳震盪の数と反復的な体制が怪我の結果に与える影響についての懸念が高まっています。前臨床研究では、さまざまな閉鎖性頭部外傷 (CHI) モデル7,8,9,10,11,12,13,14を使用して、反復性mTBI後の神経病理学的変化、神経炎症カスケード、および神経心理学的障害が調査されています.しかし、スポーツ関連の反復的な脳震盪性頭部衝撃を密接に模倣する可能性のある、複雑でないmTBIモデルへの影響パラメータの調査は、急性期の機能障害と慢性期の脳萎縮をもたらすため、十分に検討されていません。

水分子の拡散を評価する技術である拡散テンソルイメージング(DTI)は、mTBIの影響を調査する研究で一般的に利用されています。DTIから導き出される主要な指標である分数異方性(FA)は、水拡散コヒーレンスの程度を定量化し、軸索と神経線維束の構造構成に関する情報を提供します。白質(WM)のFA値の摂動は、さまざまなモデル⁸^、¹⁰^、¹¹^、¹⁵^、¹⁶^、¹⁷でmTBIに続いて提案されています。さらに、軸索およびミエリンの完全性を示す軸方向拡散率(AD)および半径方向拡散率(RD)は、前臨床試験10,15,16,18,19,20においてmTBI後に変化した。ただし、以前の研究間でのDTI所見の不一致は、mTBIの重症度の変動、影響パラメータの違い、多様なmTBIモデル、および損傷後の追跡時間の一貫性の欠如が原因である可能性があります⁹。

したがって、現在のプロトコル論文は、単一および反復的なmTBIの累積効果を評価するために設計されたmTBIの動物モデルを確立することを目的としています。動物の健康状態、行動結果、DTIパラメータ、皮質容積の評価を含む包括的かつ縦断的な評価を組み込んで、損傷後のダイナミックな変化を捉え、さまざまな影響パラメータの影響を調査しました。このモデルは、急性の機能障害と長期的な微細構造の変化の両方を実証することにより、以前の動物実験では十分に対処されていなかった合併症のないmTBIの主要な特徴を効果的に再現します。ここでは、修正クローズドヘッドウェイトドロップ法^8,11を使用して複雑でないmTBIモデルを開発し、mTBIに続く縦断的評価を実施するための詳細なプロトコルを提供しました。

プロトコル

本試験は、米国国立衛生研究所(NIH)の「動物研究ガイドライン」(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)および「Animal Research: Reporting In Vivo Experiments」ガイドラインの推奨に従って実施されました。すべての動物実験は、国立陽明交通大学の動物実験委員会(IACUC)によって承認されました。20匹の動物を5つのグループ(n = 4グループ)にランダムに割り当てました:(i)感覚運動皮質での1回衝撃(SMCx/シングル)、(ii)1時間間隔でのSMCxでのダブルインパクト(SMCx/2ヒット/1時間)、(iii)10分間隔でのSMCxでのダブルインパクト(SMCx/2ヒット/10分)、(iv)1時間間隔での脳中枢でのダブルインパクト(Central/2ヒット/1時間)、 (v)縦断的転帰評価のために、手術のみを行い、頭部に直接影響を与えない偽群(図1)。注目すべきは、この研究のために選択された損傷間インターバル(1時間対10分インターバル)は、コンタクトスポーツ^22,23に従事するアスリートが経験する、1シーズン内に最大1000回も発生する可能性のある反復的なサブコンカッシブインパクト^{8,10,11,13,21}を模倣するように設計されていた。

1. 閉鎖性頭部外傷(CHI)の誘発

注:10〜12週齢で体重が250gを超える成体の雄Sprague-Dawleyラットは、12/12時間の明暗サイクルの下で飼育されており、食物と水に自由にアクセスできます。

ラットを小さな誘導チャンバーに入れ、イソフルラン(5%)と医療用空気(2.5-3 L / min)の混合物で麻酔します。ラットが足や尻尾のつまみに反応しなくなるまで、ラットをチャンバーから取り出します。
ネズミを加熱パッドの上に置きます。
注:ラットの体温を維持するために、手術中は加熱パッドをオンにしてください。
ラットを定位固定装置フレームに持ってきて、歯のバーで固定します。手術中のメンテナンスのために、接続されたノーズコーンと医療用空気を1.5〜2 L / minの流量で使用して、イソフルランを2%で投与します。.
イヤーバーを配置します。ラットが定位固定装置フレームの中央にあり、対称的であることを確認してください。
注:すべての外科的処置は無菌条件下で行う必要があります。手術前にスチームオートクレーブを使用して器具を滅菌し、手術中に先端をビーズ滅菌器でさらに滅菌しました。汚染を防ぐために、動物の上に外科用ドレープが置かれました。外科医は、髪を覆うための帽子、顔を覆うためのマスクを着用し、手術中、白衣と手術用手袋を装備していた²⁴。
パルスオキシメータのセンサーを動物の後足に装着して、動物の呼吸数、心拍数、血中酸素レベル、体温を監視します。
1 mL / kg体重のリドカイン(20 mg / mL)を鎮痛剤としてラットの首に皮下注射します。.
動物の頭に脱毛クリームを塗り、3分間待ちます。70%イソプロピルアルコール綿棒でクリームを拭き取ります。
ヨウ素に浸した滅菌綿棒を使用して、剃った部分を数回清掃します。70%エタノールに浸した綿棒を使用してヨウ素残留物を取り除きます。
剃った皮膚に長さ約2〜2.5cmの正中線切開を無菌の外科用ブレードを使用して作成し、頭蓋骨の表面にアクセスします。
綿パッドを使用して骨のティッシュを取り除き、頭蓋骨を露出させます。0.9%生理食塩水に浸した綿棒を使用して頭蓋骨の表面を清掃し、次に乾いた綿パッドで清掃します。
注:頭蓋骨の縫合糸とブレグマとラムダの両方を簡単に識別できるようになりました。
ブレグマを基準点として特定し、座標に基づいて影響領域をさらに求めます。
注: このプロトコルでは、CHI 誘導には 2 セットの座標が使用されます: (-2.5、-2.0) (2.5 mm 横方向 2.0 mm ブレグマ後方) 感覚運動皮質 (SMCx) の上部、および (0,-3.0) 中枢脳 (中央) の上。
頭蓋骨の表面で選択した座標を特定し、歯科用セメントを使用して指定された領域に円形のステンレス鋼ヘルメット(直径10 mm、厚さ1 mm)をセメントで固めます。加熱パッドとパルスオキシメータを取り外します。
昇降台(長さ14cm、幅8cm、奥行き6.15cm)上の定位装置とラットをCHIインパクターの下に移動します。
発泡スポンジ(長さ19 cm、幅10 cm、深さ4 cm、密度18 kg / m³)を使用してラットの体を持ち上げます。
定位固定装置フレームのイヤーバーからラットを取り外します。ラットをノーズコーンに接続された歯のバーに静止させ、2%イソフルランを送達します。頭と体が吻側-尾側方向に水平に整列していることを確認します。
CHIインパクターとヘルメットの間に隙間がないようにリフトテーブルを調整します。衝撃の直前にイソフルラン5秒をオフにしてください。
注:脳損傷による立ち直り反射を特定するために、イソフルランの一時的な中止が行われました²⁵。
1 mの高さから600 gの真鍮をステンレス鋼管(ステンレス製の真鍮の重りの柱をクリアするための高さ1 m、内径20 mm)を、金属製のヘルメットを狙った丸い先端で固定されたインパクターに落とします。
注:偽のグループの動物は、真鍮の滴がラットの頭のヘルメットに接触せずに放出されたため、衝撃を受けませんでした。
リフトテーブルを下げます。ラットを脳定位固定装置フレームから取り外し、ラットを加熱パッドの仰臥位に置きます。.
動物が仰臥位から腹臥位に変化しようとする時間である直立反射の時間を記録します^26,27。
注:反復CHIを受けた動物は、2^回目の衝撃の3分前に再度麻酔をかけられました。SMCx/double/10 min群の動物で、時間内に腹臥位に戻らなかった動物については、対応する直立反射の時間は420秒と記録された。
矯正反射の記録後、ステップ1.1を使用してラットをイソフルランで再度麻酔します。
ステップ1.2を使用して、ラットを定位固定装置フレームで固定します。
注意: スタル上部のヘルメットの安定性を確認した後、手順1.13〜1.17を再度繰り返して、2^回目の衝撃を実行します。
ヘルメットを取り外します。頭蓋骨の上にある結合組織とセメントをすべて取り除きます。
頭蓋骨を歯科用セメントで覆い、乾かします。ピンセットバックを使用して、歯科用セメントが硬くて硬いことを確認します。
注:歯科用セメントは、手術後の頭蓋骨と頭皮の間の頭蓋骨-空気または頭蓋骨-血液界面によって引き起こされる感受性アーチファクトを排除するために、頭蓋骨の上に塗布されました。
4-0ナイロン外科用縫合糸と4-5の独立した結び目を使用して切開部を閉じます。
注:傷の長さは約2〜2.5cmです。外科用縫合糸が毛細管現象を持たず、シルクまたはナイロン素材でできていることを確認してください。動物の引っ掻き傷による傷口の開きを防ぐために、1つの結び目を使用して切開部を縫合しないでください。
手術部位に抗生物質(ダーマネストクリーム)を塗布して感染を防ぎます。
術後の鎮痛薬として、1 mL/kg 体重のカルプロフェン (50 mg/mL) を首に皮下注射します。
ネズミが意識を取り戻すまで、加熱パッドの上の清潔なケージに入れます。ラットが直立したら、ホームケージに戻します。
手術後3日間連続して鎮痛剤として、200mLの水に混合したアセトアミノフェン5mL(24mg / mL)を動物に毎日経口投与します。.

2. 磁気共鳴画像法(MRI)

注:T2強調画像と拡散テンソルイメージングは、CHI前、および損傷後1日および50日後に、シーケンシャルPET/MR 7Tシステムを使用して実行されます(図1)。ベースラインMRIは、CHI手順の1週間前に実施されました。CHI後1日と50日後の評価では、行動評価を午前中に実施し、同日午後にMRIスキャンを行った。

イソフルラン(5%)と医療用空気(2.5-3 L / min)の混合物で満たされた小さな誘導チャンバーでラットを麻酔します。
ラットが足や尻尾のつまみに反応しなくなったら、頭を最初に腹臥位にして動物のクレードルに移すときは、麻酔を一時的に中断します。
ノーズコーンに接続されたヘッドホルダーにラットを配置し、画像取得中のメンテナンスのために、1.5-2 L / minの流量で医療用空気と2%イソフルランを送達します。
スキャン中の動きを避けるために、小さなテープで頭を固定します。
注:頭皮の除去による磁化性アーチファクトを防ぐために、CHI後の初日にラットの頭に歯磨き粉を塗ります^28,29。
ラットの胸部の下に圧力パッドを置き、呼吸を監視します。酸素濃度計クリップを後肢にテープで固定して、心拍数を監視します。
直腸プローブを挿入して直腸温を測定します。実験中は、体温を維持するために、循環する温水とティッシュラップでラットを加熱毛布で覆います。
注:実験全体を通して、心拍数、呼吸数、直腸温などの生理学的状態を監視します。スキャンする前に、ラットのすべての生理学的信号をチェックして、バイタルサインモニターの品質を確認してください。
PET/MRスキャナーのレーザーポジショニングシステムを使用して、ヘッドの中心をマークし、正確な位置合わせを行います。
頭部の中心がスキャナーのアイソセンターと揃うまで、電動動物輸送システムを使用して動物を自動的にMRIボアに移動します。
注:PET/MRシステムに統合された電動動物輸送システムは、正確な動物の位置決めを保証し、イメージングモダリティ間の移行時のワークフローを合理化します。
MRIシーケンスを取得します。
1. 初期ローカリゼーションと全体的な調整を実行します。
2. 中央の矢状スライスを使用し、前方からの8^番目のスライスを前交連の咬合に合わせます。
  注:冠状スライスは、前交連と小脳の基部を結ぶ線によって定義される水平面に対して垂直に配置され、脳梁の長軸に対して約15°の角度に対応します。中央矢状スライスのT2-RAREスキャンの主なパラメータは、繰り返し時間(TR)= 2500 ms、エコー時間(TE)= 44 ms、視野(FOV)= 3.5 cm、マトリックスサイズ= 256 256、スライス厚さ= 1 mm、スライス数= 1、RARE係数= 8、帯域幅= 75 kHz、平均数= 1、取得時間= 1分20秒です。
3. 脂肪抑制と脳の下の飽和バンドを備えたリラクゼーション強化による迅速取得(RARE)を使用して、解剖学的参照用のT2強調画像を取得します(図2)。
  注:T2-RAREスキャンの主なパラメータは、繰り返し時間(TR)= 3600 ms、エコー時間(TE)= 40 ms、視野(FOV)= 2 cm、マトリックスサイズ= 256 256、スライス厚さ= 1 mm、スライス数= 16、RARE係数= 8、帯域幅= 75 kHz、平均数= 8、取得時間= 7分40秒です。
4. 4ショットスピンエコーEPIを使用して、拡散テンソル画像を取得します(図2)。
  注:DTIスキャンの主なパラメータは次のとおりです:TR = 3000 ms、TE = 28 ms、視野(FOV)= 2 cm、マトリックスサイズ= 96 96、厚さ= 1 mm、スライス数= 16、パルスの持続時間(δ)= 5 ms、2つのパルス間の時間(Δ)= 15 ms、B0の数= 5、方向の数= 30、 b値=1000 s/mm³、帯域幅=150 kHz、平均数=4、取込み時間=14分
5. スキャンプロトコルを終了します。動物のゆりかごを磁石からスライドさせて引き出します。動物をゆりかごから取り出します。
6. ラットを体温を維持するために、下に加熱パッドがある清潔なケージに移します。ネズミが意識を取り戻したら、ネズミを家のケージに戻します。
画像の前処理
注:MRtrix3、Statistical Parametric Mapping(SPM)ソフトウェア、およびカスタムMATLABスクリプトを使用して、データ処理と分析を行います。
1. MRtrix3 コマンド (dwidenoise)³⁰ を使用して DTI イメージのノイズを除去します。
2. MRtrix コマンド (mrdegibbs)³⁰ を使用して、DTI イメージから Gibb のリンギングアーティファクトを削除します。
3. SPM関数(spm_coreg.mおよびspm_powell.m)を使用して、縦方向のスキャンでDTI画像を単一の被写体のT2強調画像にコレジストレーションします。
4. T2 で重み付けされた画像に対して頭蓋骨ストリッピングを実行するには、脳領域をスライスごとに手動で輪郭を描き、その後、Otsu の方法³¹ (カスタム MATLAB スクリプト thr_otsu2.m) で決定された計算しきい値を下回る強度のピクセルを削除します。
5. SPM関数(spm_coreg.mおよびspm_powell.m)を使用して、同じ実験群の動物間で被験者間の同時登録を行います。対応するDTI画像にブレインマスクを適用します。
  注意: 頭蓋骨のストリッピングは、コンピューターの処理時間を短縮するために実行されます。
6. DTI (カスタム MATLAB スクリプト tensormap.m) に基づいてテンソルマップを計算します。
7. FA マップの計算 (カスタム MATLAB スクリプト、calFA.m)
  注: すべてのカスタム MATLAB スクリプトは、次のデータベース (https://doi.org/10.57770/9ZESXD) から入手できます。
画像解析-FA
1. CHI の座標の下にある 3 つの連続する画像スライスの皮質と脳梁 (CC) に関心領域 (ROI) を描画します。
  注:すべてのROIは手動で描画され、実験グループを知らされていない2人の経験豊富な研究者によって重大なエラーがないか目視検査されました。
2. ROIからFA値を抽出して平均化します。
  注:皮質の下の脳梁については、FA<0.35の値を持つピクセルを選択したROIから除外して、部分的なボリュームの影響を排除しました。皮質については、ROIでFA<0.35の値を持つすべてのピクセルが分析のために募集されました。
画像解析-ボリューム
1. Bregma -7 から +3 mm で 11 の連続した画像スライスの皮質領域をカバーする ROI を手動で描画します。
  注:すべてのROIは、実験グループを知らされていない2人の経験豊富な研究者によって手動で描かれました。
2. スライス全体のROIの合計ピクセルを合計し、スライスの厚さ(1 mm)を掛けてボリュームに変換します。
3. CHI後の皮質容積を、各動物のCHI前の対応する容積で正規化します。
  注:データを正規化して、プレゼンテーションの前に動物間の脳の体積の個人差を排除します。

3. 行動評価

注:行動実験は、CHI前、およびCHI後1日と50日後にビームウォークバランステストとmNSSを使用して行われます(図1)。すべての評価は、収集されたデータの正確性、一貫性、客観性を確保するために、少なくとも 2 人のオブザーバーによって行われました。

ビームウォークバランステスト
1. ビデオカメラの電源を入れ、タイマーを開始します。
2. 平均台(奥行き3cm、幅3cm、長さ80cm、床から60cm)にネズミを置きます。
3. ネズミが1往復を完了するか、転倒するか、3分以上フリーズしたら、タイマーを停止します。
  1. 実験中は、mNSS ^11,32,33,34を使用して評価のために動物の状態を観察します。評価については、次の基準に従ってください。
  2. ラットがビームの上で安定した姿勢でバランスを保っている場合は、スコア0を割り当てます。
  3. ネズミが梁の側面をつかんだ場合は、スコア1を割り当てます。
  4. ネズミが片方の手足を梁から離して落下した場合は、スコア2を割り当てます。
  5. ラットが2本の手足をオフにして落下するか、ビームで回転する場合(>60秒)、スコア3を割り当てます。
  6. ラットがビームでバランスを取ろうとしたが、落ちてしまった場合 (>40 秒)、スコア 4 を割り当てます。
  7. ラットがビームでバランスを取ろうとしたが、落ちてしまった場合(>20秒)、スコア5を割り当てます。
  8. ラットがバランスを取ろうとしない、またはビームにぶら下がろうとせず、20秒以内に落ちた場合は、スコア6を割り当てます。
  9. ラットがタスクを完了できなかった場合は、最大3分を要したと考え、スコア6を割り当てます。
4. 特定の時点でテスト日をスケジュールします。
  注: CHI の前の 2 回の試行でビーム歩行の往復を完了しなかったラットを、その後の手術とフォローアップの行動評価から除外します。
修正神経学的重症度スコア (mNSS)
注:mNSS評価には、運動テスト、感覚テスト、反射の欠如、異常な動き、ビームバランス、および床での歩行^32,33が含まれ、これらは日常的に迅速に行われました。
1. モーターテストを実行します。
  1. ラットを尾の付け根で持ち上げ、手足の反射神経を約15秒間観察して、適切な屈曲と伸展を評価します。
  2. 前肢に正常な屈曲が観察された場合は、スコア0を割り当てます。屈曲が観察されない場合は、スコア 1 を割り当てます。
  3. 後肢に正常な屈曲が観察された場合は、スコア0を割り当てます。屈曲が観察されない場合は、スコア 1 を割り当てます。
  4. ラットを尻尾で持ち上げてから30秒以内に頭が垂直軸に>10°移動した場合は、スコア0を割り当てます。そうでない場合は、スコア 1 を割り当てます。
    注:このテストセッションでは、最大3つのスコアが割り当てられます。
2. 手足の配置テストを実行します。
  注:配置テストは、感覚(視覚、触覚、および固有受容感覚)と運動機能との間の調整を評価するために実行されます。
  1. ラットをテーブルの表面に向かってゆっくりと下げます。ネズミの足が届いて表面に向かって伸びたかどうかを観察します。
  2. ラットが両手足を伸ばして前方に伸ばして水面に到達した場合は、スコア0を割り当てます。遅延がある場合、または応答がない場合は、スコア 1 を割り当てます。
  3. ネズミを表面に置き、足をテーブルの端に引っ張ります。その足がテーブルの表面の正常な位置に戻るかどうかを観察します。
  4. 即時配置および通常の配置応答が観察された場合は、スコア0を割り当てます。遅延配置応答が観察された場合は、スコア 1 を割り当てます。応答がない場合は、スコア 2 を割り当てます。
    注:このテストセッションでは、最大3つのスコアが割り当てられます。
3. 観察は不在や異常な動きを反映しています。
  1. 綿棒の綿の端で耳道に触れたときの耳介反射を評価するために、頭の揺れを観察します。
  2. 正常な反射が観察された場合は、スコア0を割り当てます。反射が観察されない場合は、スコア1を割り当てます。
  3. 綿棒の綿の端で角膜に触れることにより、角膜反射の存在を評価します。
  4. 正常な応答が引き出された場合は、スコア 0 を割り当てます。まばたき反応が誘発されない場合は、スコア 1 を割り当てます。
  5. 短くて強い手を叩きます。驚愕反射の存在を観察します。
  6. 反射が観察された場合は、スコア0を割り当てます。反射が観察されない場合は、スコア1を割り当てます。
  7. ラットが発作、ミオクローヌス、または筋オジストニーを持っているかどうかを観察します。
  8. それらのいずれかが発生した場合は、スコア 1 を割り当てます。
    注:このテストセッションでは、最大4つのスコアが割り当てられます。
4. 前述のように、ビームバランステストを実行します(ステップ3.1)。
  注:このテストセッションでは、最大6つのスコアが割り当てられます。
5. 床歩行テストを行います。
  1. オープンフィールドアリーナ(長さ75cm、幅50cm、奥行き40cm)を準備します。清潔で、以前の臭いの手がかりがないことを確認してください。
  2. オープンフィールドアリーナの中央にネズミを配置し、ネズミがアリーナをどのように歩くかを観察します。
  3. ラットが定期的に散歩をする場合は、スコア0を割り当てます。
  4. ラットがまっすぐ歩くことができない場合は、スコア1を割り当てます。
  5. ネズミを床に置いた後、ネズミが麻痺側に落ちた場合は、スコア3を割り当てます。
    注:このテストセッションでは、最大3つのスコアが割り当てられます。
6. すべてのスコアを合計します。可能な最大スコアは18です。
  注: スコアが高いほど、結果が悪いことを示します。

4. 免疫組織学

経心臓灌流を行う³⁵.
注:経心臓灌流は、CHIの50日後にMRIスキャン後に行われます(図1)。
1. ラットを小さな誘導チャンバーに入れ、足や尾のつまみに反応しなくなるまでイソフルラン(5%)で麻酔します。.
2. 50 mg / kg体重のゾレチル(50 mg / mL)と10 mg / kg体重のキシラジン(Roumpun、23.32 mg / mL)を腹腔内注射で深く麻酔します。.
3. ラットを仰臥位に置きます。
4. 胸部の下にハサミで約4〜5cmの長さの横切開を行います。
5. 横隔膜の位置を特定し、心臓を露出させるために切断します。
6. 止血鉗子を使用して肺動脈をクランプし、次に右心房に長さ約0.5〜1cmの切開を行います。
7. 輸液ポンプに取り付けられたパイプラインに針を接続します。
8. 針を左心室に挿入します。
9. 経心臓灌流(40 mL /分)で、血液が澄むまで500 mLの0.9%生理食塩水で動物をすすぎます。.
10. 500 mL の 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を 500 mL で経心臓灌流 (40 mL/分) して動物を灌流し、固定します。
11. ラットの頭を取り除き、頭蓋骨から脳組織を慎重に剥がします。
12. 脳をボトル内の約20mLの4%PFAに48時間保存して、固定後とします。
組織プロセシングおよびIHC染色^{を行う 36,37}.
注:免疫ペルオキシダーゼ二次検出システムキットを使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片の免疫組織化学染色を行います。
1. ホルマリン固定組織切片およびパラフィン包埋組織切片を使用してください。
2. 脱パラフィンを行い、スライドを3%_H2O2で処理して、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックします。クエン酸バッファーを用いて90°Cで抗原賦活化を行います。
3. 免疫ペルオキシダーゼ二次検出システムキットを使用して免疫組織化学染色を行います。
  注:染色手順は、メーカーの推奨に従って実施されます。
4. ヘマトキシリンを使用して試料を対比染色します。
5. 褪色防止剤で試料をマウントします。
6. 免疫組織化学染色には、抗グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)抗体を使用してください。
7. 光学顕微鏡スライドスキャナーを使用してROIの画像を取得します(図6)。

5. 行動とイメージアウトカムの統計解析

注:現在の研究では、統計分析はSPSSで行われました。ただし、統計解析は他の統計ツールボックスで実行できます。

ワイド形式のデータを SPSS *.sav ファイルに読み込みます。
反復測定分散分析 (ANOVA) を実施して、行動 (正規化された体重、mNSS、ビーム歩行時間) と画像の結果 (皮質と CC の FA 値) をグループ間で経時的に比較します。
1. [一般 線形モデルの解析] > [反復測定>解析] をクリックします。
2. 「 Within-Subject Factor Name 」ボックスに名前(例:time)を割り当て、「 Number of Levels 」ボックスに「3」を入力します(追跡時間が異なる3つのレベル)。「 Measure Name 」ボックスに名前 (例: mNSS) を割り当て、「 Repeated Measures Define Factor(s)」 ダイアログボックスで名前を割り当てます。
3. テストが必要な 被験者内変数 (CHI 前、D1、および D50 で取得したデータ) を読み込み、[ 反復測定 ] ダイアログボックスで被験者間因子 (影響パラメーターが異なる動物グループなど) を指定します。
4. 「観測平均の事後多重比較」ダイアログボックスで、「因子 (例: 動物グループ)」のポストホック検定として「ボンフェローニ」を選択します。
  注: 多重比較を補正するために、タイプ I の誤差は、経時的な比較に対して Bonferroni 補正 (0.05/3) を使用して調整されました。統計的有意性は、p < 0.05(SPSS調整済み)と定義した。
一元配置分散分析を実施して、グループ間の直進反射と皮質容積の変化を比較します。
1. 「 分析」をクリックして>平均の比較>一元配置ANOVAをクリックします。
2. 変数(直立反射と皮質体積の変化)を従属リストに読み込み、グループを一元配置分散分析ダイアログボックスの係数として読み込みます。
3. 「一元配置分散分析: 多重比較」ダイアログボックスで、ボンフェローニを事後検定として選択します。
  注:多重比較を補正するために、グループ間の比較について、タイプIの誤差をボンフェローニ補正(0.05/5)を用いて調整しました。統計的有意性は、p < 0.05(SPSS調整済み)と定義した。

結果

図2は、SMCxで偽CHIおよび反復CHIを投与した代表動物からの縦断的MRIを示しています。CHI後1日目と50日目のT2強調画像では、頭蓋骨骨折や脳挫傷は認められませんでした。WMの有意な浮腫または変形は、CHI後1日および50日のFAマップでは見つかりませんでした。この研究でCHIを投与されたすべての動物は、50日間の実験期間全体にわたって生存し、CH...

ディスカッション

この研究は、合併症のない軽度の外傷性脳損傷 (mTBI) の動物モデルを確立して、単一および反復性の損傷の累積的な影響、およびさまざまな脳領域への影響の結果を評価することを目的としています。クローズドヘッドケガ(CHI)モデルは、クローズドヘッドウェイトドロップ傷害のパラダイムから適応され、ヘルメット保護を着用したアスリートや個人が一般的に経?...

開示事項

著者には、開示すべき潜在的な利益相反はありません。

謝辞

この研究は、台湾の国家科学技術評議会(NSTC)(NSTC 113-2314-B-A49-047)からの研究助成金によって支援されました。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetaminophen	Center Laboratories Inc	N02BE01
Antibiotics (Dermanest cream)	Commwell Pharmaceutial Co., Ltd	49391
Antigen Retrival buffer (100x Citrate buffer)	Abcam	AB93678
Anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibody	Bioworld Technology, Inc	BS6460
Balance beam	Custom made	Custom made	3 cm depth, 3 cm width, 80 cm length, and 60 cm above the floor
Behavior apparatus
Circular helmet	Custom made	Custom made	Stainless steel, 10-mm diameter, 1-mm thickness
Closed-head injury
Closed-Head injury impactor	Custom made	Custom made	A stainless steel tube (1-m height with 20-mm inner diameter), a secured impactor with a round tip (stainless steel, 10-mm tip diameter) at the bottom of the tube, a weight (stainless steel, 600 g).
Formalin	Bioworld Technology, Inc	C72
Gas Anesthesia Instrument (Vaporizer)	RWD Life Science Co.	R580S Animal Anesthesia Vaporizers and Accessories
Hematoxylin	Bioman Scientific Co., Ltd	17372-87-1
Immunohistology
Immunoperoxidase Secondary Detection system kit	Bio-Check Laboratories Ltd	K5007
Isoflurane	Panion & BF Biotech Inc.	8547
Lidocaine	Step Technology Co., Ltd	N01BB02
light microscope slide scanner	Olympus	BX63
MR-compatible small animal monitoring and gating system	SA Instruments	Model 1025	The monitoring kit with the respiratory pillow, ECG electrodes, and rectal probe
MRI
MRI operating council	Bruker	Biospec	Paravision 360 software.
MRI System	Bruker	Biospec	PET/MR scanner (PET inline), 7 T, 105 cm inner bore diameter with gradient set.
Open field arena	Custom made	Custom made	75 cm length, 50 cm width, and 40 cm depth
Pulse oximeter	STARR Life Sciences Corp.	MouseOx Plus	Mouse & Rat Pulse Oximeter
Rat Adaptors	RWD Life Science Co.	68021
SPSS Statistics 29	IBM	Version 29.0
Stereotaxic frame	RWD Life Science Co.	G1124901-001
Volume coil	Bruker	Biospec	40-mm inner diameter, transceiver for radiofrequency excitation and signal receiving.
Xylazine	Bayer Taiwan Company Ltd
Zoletil	Virbac	BN8M3YA

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