Weight-Drop Method로 수정되고 자기 공명 영상(Magnetic Resonance Imaging)으로 입증된 복잡하지 않은 경미한 외상성 뇌 손상 모델의 개발

요약

본 연구에서는 단순하고 가벼운 외상성 뇌 손상의 신경영상 결과를 급성기 및 장기 뇌 위축에서 보존된 뇌 구조와 함께 복제하는 폐쇄두부 손상 동물 모델을 확립하기 위한 프로토콜을 제시한다. 종방향 자기 공명 영상(Longitudinal magnetic resonance imaging)은 증거에 사용되는 기본 방법입니다.

초록

뇌진탕으로 알려진 경미한 외상성 뇌 손상(mTBI)은 전 세계적으로 뇌 손상의 85% 이상을 차지합니다. 특히, 급성기의 일상적인 임상 영상에서 단순 mTBI가 음성 소견을 보이는 것은 이러한 환자의 조기에 적절한 치료를 방해합니다. 다양한 영향 매개변수가 mTBI 후 후속 신경 심리학적 증상의 진행에 영향을 미치고 심지어 가속화할 수 있음이 인정되었습니다. 그러나 뇌진탕 중 충격과 결과의 연관성은 광범위하게 조사되지 않았습니다. 본 연구에서는 체중 감량 부상 패러다임에서 변형된 폐쇄두부 손상(CHI)을 가진 동물 모델을 설명하고 시연했습니다. 성체 수컷 Sprague-Dawley 쥐(n = 20)는 충격 매개변수가 다른 CHI 그룹(그룹당 n = 4)에 무작위로 할당되었습니다. T2 가중 이미징 및 확산 텐서 이미징을 포함한 종단 MR 이미징 연구와 수정된 신경학적 중증도 점수(mNSS) 및 빔 워크 테스트와 같은 순차적 행동 평가가 50일 연구 기간 동안 수행되었습니다. 성상아교증에 대한 면역조직화학적 염색은 부상 후 50일째에 수행되었습니다. 반복적인 CHI 후 동물에서 단일 부상 및 가짜 그룹에 비해 더 나쁜 행동 수행이 관찰되었습니다. 종방향 자기공명영상(MRI)을 사용하여 부상 후 24시간 동안 심각한 뇌 타박상이 관찰되지 않았습니다. 그럼에도 불구하고, 손상 후 50일째에 대뇌피질 위축과 대뇌피질 분획 이방성(FA)의 변화가 입증되었으며, 이는 임상적으로 복잡하지 않은 mTBI의 성공적인 복제를 시사합니다. 가장 중요한 것은 mTBI 후 관찰된 신경행동 결과와 이미지 특징의 변화가 충격횟수, 부상 간 간격 및 동물에서 선택한 충격 부위에 따라 달라졌다는 것입니다. 전임상 MRI와 결합된 이 생체 내 mTBI 모델은 전뇌 규모에서 뇌 손상을 탐구할 수 있는 수단을 제공합니다. 또한 다양한 영향 매개변수와 심각도 수준에서 mTBI에 민감한 이미징 바이오마커를 조사할 수 있습니다.

서문

경미한 외상성 뇌손상(mTBI)은 주로 접촉 스포츠에 종사하는 운동선수, 퇴역 군인 및 교통 사고에 연루된 개인에서 관찰된다¹. 보고된 모든 두부 부상의 85% 이상을 차지합니다². mTBI의 광범위한 병인과 전 세계적으로 증가하는 발병률은 mTBI가 후기 발병 신경퇴행성 질환의 잠정적인 환경 위험 인자로 포함되어 있음을 강조합니다³. 단순하고 경증적인 TBI는 컴퓨터 단층 촬영(CT) 또는 자기 공명 영상(MRI) 스캔에서 구조적 이상이 관찰되지 않고 글래스고 혼수 점수(GCS)가 13-15인 것이 특징입니다. 합병증이 없는 mTBI 환자가 경험하는 일반적인 증상으로는 두통, 현기증, 메스꺼움 또는 구토, 피로 등이 있습니다. 그러나 복잡하지 않은 mTBI에 따른 결과에 대한 종단적 평가는 환자의 높은 중도탈락률로 인해 상당한 어려움을 안겨준다⁴.

특히 NFL(National Football League) 프로 운동선수 커뮤니티 내에서 반복적인 mTBI에 대한 우려가 증가하면서 비프로 운동선수 사회의 인식이 높아졌다⁵. 뇌의 취약성은 초기 mTBI 이후 증가하는 것으로 추정되며, 이후의 모욕은 잠재적으로 부상 결과를 악화시킬 수 있습니다. 가장 큰 규모의 기증된 축구 선수 뇌 코호트의 최근 연구 결과에 따르면 만성 외상성 뇌병증(CTE)의 중증도에 대한 사전 축구 참여와 관련이 있을 뿐만 아니라 다양한 축구 관련 요인과 CTE⁶의 위험 및 중증도 사이의 상관관계를 시사했습니다. 따라서 뇌진탕 횟수와 반복적인 체제가 부상 결과에 미치는 영향에 대한 우려가 커지고 있습니다. 전임상 연구에서는 다양한 폐쇄두손상(CHI) 모델을 사용하여 반복적 mTBI 후 신경병리학적 변화, 신경염증성 연쇄반응 및 신경심리학적 손상을 조사했습니다 7,8,9,10,11,12,13,14 . 그러나 급성기에는 기능적 장애를, 만성기에는 뇌위축을 초래하는 스포츠와 관련된 반복성 뇌진탕성 두부 충격을 밀접하게 모방할 수 있는 복잡하지 않은 mTBI 모델에 대한 충격 매개변수에 대한 조사는 잘 검토되지 않았습니다.

물 분자의 확산을 평가하는 기술인 확산 텐서 이미징(DTI)은 mTBI의 영향을 조사하는 연구에 일반적으로 활용되어 왔습니다. DTI에서 파생된 주요 지표인 FA(Fractional Anisotropy)는 수분 확산 일관성의 정도를 정량화하고 축삭돌기 및 신경 섬유 다발의 구조적 조직에 관한 정보를 제공합니다. 백질(WM)에서 FA 값의 섭동은 다양한 모델 8,10,11,15,16,17에서 mTBI에 따라 제안되었습니다. 또한, 축삭 및 미엘린 무결성을 나타내는 축방향 확산도(AD)와 방사형 확산도(RD)는 전임상 연구에서 mTBI 이후 변화했습니다 10,15,16,18,19,20. 그러나 이전 연구와 DTI 소견의 불일치는 mTBI 중증도의 차이, 충격 매개변수의 차이, 다양한 mTBI 모델, 부상 후 추적 관찰 시점의 일관성 없는 차이에 기인할 가능성이 높다⁹.

따라서 현재 프로토콜 논문은 단일 및 반복 mTBI의 누적 효과를 평가하기 위해 고안된 mTBI의 동물 모델을 확립하는 것을 목표로 합니다. 우리는 동물 복지, 행동 결과, DTI 매개변수 및 피질 용적에 대한 평가를 포함한 포괄적이고 종단적인 평가를 통합하여 부상 후 역동적인 변화를 포착하고 다양한 충격 매개변수의 영향을 탐색했습니다. 이 모델은 급성 기능 장애와 장기적인 미세구조 변화를 모두 입증함으로써 이전 동물 연구에서 완전히 다루어지지 않았던 복잡하지 않은 mTBI의 주요 기능을 효과적으로 복제합니다. 여기에서는 수정된 폐쇄 헤드 중량 강하 방법 ^8,11을 사용하여 복잡하지 않은 mTBI 모델을 개발하고 mTBI에 따른 종단 평가를 수행하기 위한 자세한 프로토콜을 제공했습니다.

프로토콜

이 연구는 동물 연구를 위한 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 동물 연구 지침(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals) 및 동물 연구: 생체 내 실험 보고 지침(Animal Research: Reporting In Vivo Experiments guidelines)의 권장 사항에 따라 수행되었습니다. 모든 동물 실험은 국립 양밍 키아오퉁 대학교(National Yang Ming Chiao Tung University)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 20마리의 동물을 5개 그룹(그룹당 n = 4개)에 무작위로 할당했습니다: (i) 감각 운동 피질에서의 단일 충격(SMCx/단일), (ii) 1시간 간격의 SMCx에서 이중 충격(SMCx/2 hits/1 h), (iii) 10분 간격의 SMCx에서 이중 충격(SMCx/2 hits/10 min), (iv) 1-h 간격의 중앙 뇌에서 이중 충격(Central/2 hits/1 h), (v) 수술만 받았지만 머리에 직접적인 충격을 주지 않은 가짜 그룹, 종단적 결과 평가를 위한 그룹(그림 1). 주목할 점은 이 연구를 위해 선택된 부상 간 간격(1시간 대 10분 간격)은 접촉 스포츠에 참여하는 운동 선수가 경험하는 반복적인 뇌진탕 아래 충격 8,10,11,13,21을 모방하도록 설계되었습니다 ^22,23.

1. 폐쇄두손상(CHI)의 유도

참고: 10주에서 12주 사이이고 체중이 250g 이상인 성체 수컷 Sprague-Dawley 쥐는 12/12시간의 명암 주기로 보호되며 음식과 물에 대한 자유가 있습니다.

1. 쥐를 작은 유도 챔버에 넣고 이소플루란(5%)과 의료용 공기(2.5-3L/분)의 혼합물로 마취합니다. 쥐가 발이나 꼬리 꼬집기에 반응하지 않을 때까지 챔버에서 쥐를 제거합니다.
2. 발열 패드에 쥐를 놓습니다.
   알림: 쥐의 체온을 유지하기 위해 수술 중 발열 패드를 켜십시오.
3. 쥐를 입체 프레임으로 가져오고 이빨 막대로 고정합니다. 수술 중 유지 관리를 위해 1.5-2L/min의 유속으로 의료용 공기와 연결된 노즈콘을 사용하여 2%로 이소플루란을 투여합니다.
4. 이어바를 배치합니다. 쥐가 입체성 프레임의 중앙에 있고 대칭인지 확인하십시오.
   참고: 모든 수술 절차는 무균 상태에서 수행해야 합니다. 기구는 수술 전에 스팀 오토클레이브를 사용하여 멸균했으며, 시술 중 비드 멸균기로 팁을 추가로 멸균했습니다. 오염을 막기 위해, 그 동물에게 수술용 드레이프를 씌웠다. 외과 의사는 시술 중 머리카락을 가리기 위해 모자를 쓰고, 얼굴을 가리기 위해 마스크를 썼으며, 실험복과 수술용 장갑을 착용했다²⁴.
5. 맥박 산소 측정기의 센서를 동물의 뒷발에 착용하여 동물의 호흡수, 심박수, 혈중 산소 수치 및 체온을 모니터링합니다.
6. 체중 1mL/kg의 리도카인(20mg/mL)을 진통제로 쥐의 목에 피하주사합니다.
7. 동물의 머리에 제모 크림을 바르고 3분 동안 기다립니다. 70% 이소프로필 알코올 면봉으로 크림을 닦아냅니다.
8. 요오드를 적신 멸균 면봉을 사용하여 면도한 부위를 여러 번 청소합니다. 70% 에탄올에 적신 면봉을 사용하여 요오드 잔여물을 제거합니다.
9. 멸균 수술 칼날을 사용하여 면도 한 피부에 약 2-2.5cm 길이의 정중선 절개를 만들어 두개골 표면에 접근합니다.
10. 화장솜을 사용하여 뼈의 조직을 제거하여 두개골을 드러냅니다. 0.9% 식염수에 적신 면봉을 사용하여 두개골 표면을 청소한 다음 마른 면봉으로 닦습니다.
    참고: 이제 두개골 봉합사와 브레그마 및 람다를 쉽게 식별할 수 있습니다.
11. 브레그마를 기준점으로 식별하여 좌표를 기반으로 충돌 영역을 추가로 찾습니다.
    참고: 이 프로토콜에서는 CHI 유도를 위해 두 세트의 좌표가 사용됩니다: 감각 운동 피질(SMCx) 상단의 (-2.5,-2.0)(브레그마 뒤쪽 2.5mm)과 중추 뇌(중심) 상단의 (0,-3.0).
12. 두개골 표면에서 선택한 좌표를 확인하고 치과용 시멘트를 사용하여 지정된 영역에 원형 스테인리스 스틸 헬멧(직경 10mm 및 두께 1mm)을 접착합니다. 가열 패드와 맥박 산소 농도계를 제거합니다.
13. CHI 임팩터 아래의 리프트 테이블(길이 14cm, 너비 8cm, 깊이 6.15cm)에서 정위 장치와 쥐를 이동합니다.
14. 거품 스폰지 (길이 19cm, 너비 10cm, 깊이 4cm, 밀도 18kg / m³)를 사용하여 쥐의 몸을 들어 올립니다.
15. 입체 프레임의 이어바에서 쥐를 제거합니다. 콧방울과 연결된 치아 막대에 쥐를 가만히 두어 2% 이소플루란을 전달합니다. 머리와 몸이 꼬리 방향으로 수평을 이루는지 확인하십시오.
16. CHI 임팩터와 헬멧 사이에 공간이 없도록 리프트 테이블을 조정합니다. 충격 직전에 이소플루란 5초를 끕니다.
    참고: 뇌 손상으로 인한 우측 반사를 명시하기 위해, 이소플루란의 일시적 중단을 시행했다²⁵.
17. 600m 높이에서 1m 높이의 황동을 스테인리스 스틸 튜브(스테인리스 황동 추 기둥을 청소하기 위한 높이 1m, 내경 20mm)를 통해 금속 헬멧을 겨냥한 둥근 팁으로 고정된 임팩터로 떨어뜨립니다.
    참고: 가짜 그룹의 동물들은 충격을 경험하지 않았는데, 놋쇠 방울이 쥐의 머리에 있는 헬멧에 닿지 않고 풀렸기 때문이다.
18. 리프트 테이블을 내립니다. 입체성 프레임에서 쥐를 제거하고 쥐를 가열 패드에 누운 자세로 놓습니다.
19. 동물이 누운 자세에서 엎드린 자세로 변화를 시도하는 시간인 오른쪽 반사 시간을 기록하십시오^26,27.
    참고: 반복적인 '키'를 투여한 동물들은 2^번째 충격이 가해지기 3분 전에 다시 마취되었다. 엎드린 자세로 되돌아가지 않은 SMCx/double/10분 그룹의 동물의 경우, 해당 교정 반사 시간은 420초로 기록되었습니다.
20. 우측 반사 기록 후 1.1단계를 사용하여 이소플루란으로 쥐를 다시 마취합니다.
21. 1.2단계를 사용하여 입체성 프레임으로 쥐를 고정시킵니다.
    알림: 스털 상단의 헬멧 안정성을 확인한 후 1.13-1.17단계를 다시 반복하여 2^차 임팩트를 수행합니다.
22. 헬멧을 제거합니다. 두개골 상단의 모든 결합 조직과 시멘트를 제거합니다.
23. 두개골을 치과용 시멘트로 덮고 말리십시오. 핀셋 백을 사용하여 치과용 시멘트가 뻣뻣하고 단단한지 확인하십시오.
    참고: 수술 후 두개골과 두피 사이의 두개골-공기 또는 두개골-혈액 계면으로 인한 감수성 아티팩트를 제거하기 위해 두개골 위에 치과용 시멘트를 도포했습니다.
24. 4-5개의 독립적인 매듭이 있는 4-0 나일론 수술용 봉합사를 사용하여 절개 부위를 봉합합니다.
    참고: 상처의 길이는 약 2-2.5cm입니다. 수술용 봉합사에 모세관 작용이 없고 실크 또는 나일론 소재로 만들어졌는지 확인하십시오. 동물의 긁힘에 의한 상처의 개방을 방지하기 위해 하나의 매듭을 사용하여 절개 부위를 봉합하지 마십시오.
25. 감염을 예방하기 위해 수술 부위에 국소 항생제(더마네스트 크림)를 바르십시오.
26. 체중 1mL/kg의 카프로펜(50mg/mL)을 수술 후 진통제로 목에 피하주사합니다.
27. 쥐가 의식을 회복할 때까지 깨끗한 케이지에 넣어 가열 패드에 올려 놓습니다. 쥐가 똑바로 앉으면 집 우리로 되돌려 놓습니다.
28. 물 200mL에 섞인 아세트아미노펜 5mL(24mg/mL)를 수술 후 3일 연속 진통제로 매일 동물에게 경구 투여합니다.

2. 자기공명영상(MRI)

참고: T2 가중 이미지 및 확산 텐서 이미징은 CHI 전과 부상 후 1일 및 50일 동안 순차적 PET/MR 7T 시스템을 사용하여 수행됩니다(그림 1). 기준선 MRI는 CHI 시술 전 1주일 이내에 수행되었습니다. CHI 후 1일 및 50일 평가의 경우 오전에 행동 평가를 실시한 후 같은 날 오후에 MRI 스캔을 실시했습니다.

1. 이소플루란(5%)과 의료용 공기(2.5-3L/min)의 혼합물로 채워진 작은 유도 챔버에서 쥐를 마취합니다.
2. 쥐가 발이나 꼬리를 꼬집어도 반응이 없으면, 머리를 먼저 엎드린 자세로 동물 요람으로 옮길 때 마취를 일시적으로 중단한다.
3. 콧방울과 연결된 헤드 홀더에 쥐를 배치하고 이미지 획득 중 유지 관리를 위해 1.5-2L/min의 유속으로 의료용 공기와 함께 2% 이소플루란을 전달합니다.
4. 스캔하는 동안 움직이지 않도록 작은 테이프 조각으로 머리를 고정하십시오.
   참고: 두피 제거로 인한 자기 감수성 아티팩트를 방지하기 위해 CHI 후 첫날에 쥐의 머리에 치약을 바르십시오^28,29.
5. 쥐의 흉부 아래에 압력 패드를 놓고 호흡을 모니터링합니다. 산소 농도계 클립을 뒷다리에 테이프로 붙여서 심박수를 모니터링합니다.
6. 직장 프로브를 삽입하여 직장 온도를 측정합니다. 실험 중에는 체온을 유지하기 위해 순환하는 따뜻한 물과 티슈 랩으로 쥐를 난방 담요로 덮습니다.
   알림: 실험 전반에 걸쳐 심박수, 호흡수 및 직장 온도를 포함한 생리적 상태를 모니터링합니다. 스캔하기 전에 쥐의 모든 생리적 신호를 확인하여 활력 징후 모니터의 품질을 확인하십시오.
7. PET/MR 스캐너의 레이저 포지셔닝 시스템을 사용하여 정확한 정렬을 위해 헤드 중앙을 표시합니다.
8. 머리 중심이 스캐너의 등반 중심과 정렬될 때까지 전동 동물 운송 시스템을 사용하여 동물을 MRI 구멍으로 자동으로 이동합니다.
   참고: PET/MR 시스템에 통합된 전동 동물 운송 시스템은 정확한 동물 위치를 보장하고 이미징 양식 간 전환 시 워크플로를 간소화합니다.
9. MRI 염기서열을 얻습니다.
   1. 초기 현지화 및 전체 조정을 수행합니다.
   2. 중간 시상 슬라이스를 사용하고 앞쪽에서 8^{번째 슬라이스를} 앞쪽 시상면의 진압에 맞춥니다.
      참고: 관상동맥 절편은 전방 커미슈어와 소뇌 기저부를 연결하는 선에 의해 정의된 수평면에 수직으로 위치하며, 말뭉치의 장축에 대해 약 15° 각도에 해당합니다. 중간 시상 절편에 대한 T2-RARE 스캔의 주요 매개변수는 다음과 같습니다: 반복 시간(TR) = 2500ms, 에코 시간(TE) = 44ms, 시야(FOV) = 3.5cm, 매트릭스 크기 = 256 256, 절편 두께 = 1mm, 절편 수 = 1, 희귀 계수 = 8, 대역폭 = 75kHz, 평균 수 = 1, 획득 시간 = 1분 20초.
   3. 지방 억제 및 뇌 아래의 포화 밴드와 함께 RARE(Rapid Acquisition with Relaxation Enhancement)를 사용하여 해부학적 참조를 위한 T2 가중치 이미지를 얻습니다(그림 2).
      참고: T2-RARE 스캔의 주요 매개변수는 다음과 같습니다: 반복 시간(TR) = 3600ms, 에코 시간(TE) = 40ms, 시야(FOV) = 2cm, 매트릭스 크기 = 256 256, 슬라이스 두께 = 1mm, 슬라이스 수 = 16, 희귀 계수 = 8, 대역폭 = 75kHz, 평균 수 = 8, 획득 시간 = 7분 40초.
   4. 4-샷 스핀 에코 EPI를 사용하여 확산 텐서 이미지를 획득합니다(그림 2).
      참고: DTI 스캔의 주요 매개변수는 다음과 같습니다: TR = 3000ms, TE = 28ms, 시야(FOV) = 2cm, 매트릭스 크기 = 96 96, 두께 = 1mm, 슬라이스 수 = 16, 펄스 지속 시간(δ) = 5ms, 두 펄스 사이의 시간(Δ) = 15ms, B0 수 = 5, 방향 수 = 30, b-값 = 1000 s/mm³, 대역폭 = 150kHz, 평균 수 = 4, 획득 시간 = 14분.
   5. 스캔 프로토콜을 마칩니다. 자석에서 동물 요람을 밀어냅니다. 요람에서 동물을 꺼냅니다.
   6. 쥐의 체온을 유지하기 위해 아래에 가열 패드가 있는 깨끗한 케이지로 쥐를 옮깁니다. 쥐가 의식을 되찾으면 집 우리로 되돌려 놓습니다.
10. 이미지 전처리
    참고: 데이터 처리 및 분석을 위해 MRtrix3, SPM(Statistical Parametric Mapping) 소프트웨어 및 사용자 정의 MATLAB 스크립트를 사용할 수 있습니다.
    1. MRtrix3 명령(dwidenoise)³⁰을 사용하여 DTI 이미지의 노이즈를 제거합니다.
    2. MRtrix 명령(mrdegibbs)³⁰을 사용하여 DTI 이미지에서 Gibb의 링잉 아티팩트를 제거합니다.
    3. SPM 기능(spm_coreg.m 및 spm_powell.m)을 사용하여 세로 스캔에서 단일 피사체의 T2 가중치 이미지에 DTI 이미지를 공동 등록합니다.
    4. 뇌 영역을 슬라이스별로 수동으로 윤곽을 그리는 방식으로 T2 가중치 영상에서 두개골 박리를 수행한 다음, Otsu의 방법³¹ (사용자 지정 MATLAB 스크립트 thr_otsu2.m)에 의해 결정된 계산된 임계값 미만의 강도를 가진 픽셀을 제거합니다.
    5. SPM 함수(spm_coreg.m 및 spm_powell.m)를 사용하여 동일한 실험 그룹의 동물 간에 교차 피험자 공동 정합을 수행합니다. 해당 DTI 영상에 브레인 마스크를 적용합니다.
       참고: 두개골 스트리핑은 컴퓨터 처리 시간을 줄이기 위해 수행됩니다.
    6. DTI(사용자 지정 MATLAB 스크립트, tensormap.m)를 기반으로 텐서 맵을 계산합니다.
    7. FA 맵 계산(사용자 정의 MATLAB 스크립트, calFA.m)
       참고: 모든 사용자 정의 MATLAB 스크립트는 다음 데이터베이스(https://doi.org/10.57770/9ZESXD)를 통해 사용할 수 있습니다.
11. 이미지 분석-FA
    1. CHI 좌표 아래에 있는 세 개의 연속된 이미지 조각에 대해 피질과 말뭉치 callosum(CC)에 관심 영역(ROI)을 그립니다.
       참고: 모든 ROI는 수동으로 작성되었으며 실험 그룹에 대해 맹검된 2명의 숙련된 조사관이 전체 오류를 육안으로 검사했습니다.
    2. ROI에서 FA 값을 추출하고 평균을 구합니다.
       참고: 피질 아래의 말뭉치(corpus callosum)의 경우, FA < 0.35 값을 가진 픽셀은 부분 부피 효과를 제거하기 위해 선택한 ROI에서 제외되었습니다. 피질의 경우, ROI에서 FA < 0.35 값을 가진 모든 픽셀이 분석을 위해 모집되었습니다.
12. 이미지 분석-볼륨
    1. Bregma -7에서 +3mm까지 11개의 연속 이미지 슬라이스에 대해 피질 영역을 포함하는 ROI를 수동으로 그립니다.
       참고: 모든 ROI는 실험 그룹에 맹검된 2명의 숙련된 조사관이 수동으로 도출했습니다.
    2. 슬라이스에 걸친 ROI의 총 픽셀을 합산하고 슬라이스 두께(1mm)를 곱하여 볼륨으로 변환합니다.
    3. CHI 이후의 피질 부피를 각 동물의 CHI 이전의 해당 부피로 정규화합니다.
       참고: 발표 전에 동물 간의 뇌 용적의 개인차를 제거하기 위해 데이터를 정규화합니다.

3. 행동 평가

참고: 행동 실험은 CHI 전과 CHI 후 1일 및 50일 전에 빔 워크 밸런스 테스트와 mNSS를 사용하여 수행됩니다(그림 1). 모든 평가는 수집된 데이터의 정확성, 일관성 및 객관성을 보장하기 위해 최소 2명의 관찰자에 의해 수행되었습니다.

1. 빔 워크 밸런스 테스트
   1. 비디오 카메라를 켜고 타이머를 시작합니다.
   2. 밸런스 빔의 한쪽 끝(깊이 3cm, 너비 3cm, 길이 80cm, 바닥 위 60cm)에 쥐를 놓습니다.
   3. 쥐가 한 번의 왕복 여행을 완료하거나 넘어지거나 3분 이상 멈추면 타이머를 중지합니다.
      1. 실험하는 동안 mNSS 11,32,33,34를 사용하여 평가를 위해 동물의 상태를 관찰합니다. 평가를 위해 다음 표준을 따르십시오.
      2. 쥐가 빔에서 안정된 자세로 균형을 유지하면 0점을 할당합니다.
      3. 쥐가 빔의 측면을 잡으면 1점을 할당합니다.
      4. 쥐가 한쪽 팔다리를 들보에서 떨어뜨리면 2점을 할당합니다.
      5. 쥐가 두 팔다리를 떼고 넘어지거나 빔에서 회전하면(>60초) 3점을 할당합니다.
      6. 쥐가 빔에서 균형을 잡으려고 시도했지만 떨어지면(>40초) 4점을 부여합니다.
      7. 쥐가 빔에서 균형을 잡으려고 시도했지만 떨어지면(>20초) 5점을 부여합니다.
      8. 쥐가 균형을 잡으려고 시도하지 않거나 빔에 매달리지 않고 20초 이내에 떨어지면 6점을 할당합니다.
      9. 쥐가 작업을 완료하지 못하면 최대 3분의 시간이 소요된 것으로 간주하고 6점을 할당합니다.
   4. 특정 시점에 테스트 날짜를 예약합니다.
      참고: CHI 전에 두 번의 시험에서 빔 워크 왕복 여행을 완료하지 않은 쥐는 후속 수술 및 후속 행동 평가에서 제외합니다.
2. 수정된 신경학적 중증도 점수(mNSS)
   참고: mNSS 평가에는 운동 검사, 감각 검사, 반사 부재, 비정상적인 움직임, 빔 균형 및 바닥에서 걷기 ^32,33이 포함되며, 이는 매일 신속하게 수행되었습니다.
   1. 모터 테스트를 수행합니다.
      1. 쥐의 꼬리 밑부분을 들어 올리고 약 15초 동안 팔다리의 반사 신경을 관찰하여 적절한 굴곡과 신전을 평가합니다.
      2. 앞다리에서 정상적인 굴곡이 관찰되면 0점을 부여합니다. 굴곡이 관찰되지 않으면 1점을 할당합니다.
      3. 뒷다리에서 정상적인 굴곡이 관찰되면 0점을 부여합니다. 굴곡이 관찰되지 않으면 1점을 할당합니다.
      4. 꼬리로 쥐를 들어 올린 후 30초 이내에 머리가 수직 축으로 >10° 이동하면 점수를 0으로 할당합니다. 그렇지 않은 경우 1점을 할당합니다.
         참고: 이 테스트 세션에서는 최대 3점의 점수가 할당됩니다.
   2. 팔다리 배치 테스트를 수행합니다.
      참고: 배치 테스트는 감각(시각, 촉각 및 고유 감각)과 운동 기능 간의 조정을 평가하기 위해 수행됩니다.
      1. 쥐를 테이블 표면쪽으로 천천히 내립니다. 쥐의 발이 표면에 닿아 뻗어 있는지 관찰하십시오.
      2. 쥐가 양쪽 팔다리를 앞으로 뻗고 표면에 도달한 경우 점수를 0으로 할당합니다. 지연이 있거나 응답이 없는 경우 점수 1을 할당합니다.
      3. 쥐를 표면에 놓고 앞발을 테이블 가장자리로 당깁니다. 발이 테이블 표면의 정상 위치로 돌아가는지 관찰합니다.
      4. 즉각적이고 정상적인 배치 응답이 관찰되면 점수를 0으로 할당합니다. 지연된 배치 응답이 관찰되면 1점을 할당합니다. 응답이 없으면 2점을 할당합니다.
         참고: 이 테스트 세션에서는 최대 3점의 점수가 할당됩니다.
   3. 부재 및 비정상적인 움직임을 반영하는 것을 관찰하십시오.
      1. 면봉의 솜 끝으로 청각 고기를 만질 때 귓바퀴 반사를 평가하기 위해 머리를 흔드는 것을 관찰합니다.
      2. 정상적인 반사가 관찰되면 점수를 0으로 할당합니다. 반사가 관찰되지 않으면 1점을 할당합니다.
      3. 면봉의 솜 끝으로 각막을 만져 각막 반사의 존재를 평가합니다.
      4. 정상적인 응답이 도출되면 점수를 0으로 할당합니다. 눈 깜빡임 반응이 이끌어지지 않으면 점수 1을 할당합니다.
      5. 짧고 강한 손뼉을 칩니다. 놀람 반사의 존재를 관찰하십시오.
      6. 반사가 관찰되면 점수를 0으로 할당합니다. 반사가 관찰되지 않으면 1점을 할당합니다.
      7. 쥐가 발작, 근긴장성 또는 근긴장돌증이 있는지 관찰합니다.
      8. 그 중 하나라도 발생하면 1점을 할당합니다.
         참고: 이 테스트 세션에서는 최대 4점의 점수가 할당됩니다.
   4. 앞서 설명한 대로 빔 밸런스 테스트를 수행합니다(3.1단계).
      참고: 이 테스트 세션에서는 최대 6점의 점수가 할당됩니다.
   5. 바닥 위에서 걷기 테스트를 수행합니다.
      1. 오픈 필드 아레나(길이 75cm, 너비 50cm, 깊이 40cm)를 준비합니다. 깨끗하고 이전의 냄새 신호가 없는지 확인하십시오.
      2. 탁 트인 경기장 중앙에 쥐를 놓고 쥐가 경기장에서 어떻게 걷는지 관찰합니다.
      3. 쥐가 규칙적인 산책을 하면 점수를 0으로 할당하십시오.
      4. 쥐가 똑바로 걸을 수 없으면 1점을 할당합니다.
      5. 쥐를 바닥에 눕힌 후 마비 쪽으로 떨어지면 3점을 부여하십시오.
         참고: 이 테스트 세션에서는 최대 3점의 점수가 할당됩니다.
   6. 모든 점수를 합산하십시오. 가능한 최대 점수는 18입니다.
      참고: 점수가 높을수록 결과가 더 나쁘다는 것을 나타냅니다.

4. 면역조직학

1. 경심 관류^{수행 35}.
   참고: 경심 관류는 CHI 후 50일 후에 MRI 스캔 후에 수행됩니다(그림 1).
   1. 쥐를 작은 유도실에 넣고 발이나 꼬리 꼬집기에 반응하지 않을 때까지 이소플루란(5%)으로 마취합니다.
   2. 체중 50mg/kg의 졸레틸(50mg/mL)과 체중 10mg/kg의 자일라진(Roumpun, 23.32mg/mL)을 복강내 주사를 통해 심부 마취를 위해 투여합니다.
   3. 쥐를 누운 자세로 놓습니다.
   4. 가위를 사용하여 흉부 아래 약 4-5cm 길이의 가로 절개를 만듭니다.
   5. 횡격막을 찾아 절단하여 심장이 드러나도록 합니다.
   6. 지혈 겸자를 사용하여 폐동맥을 고정한 다음 우심방을 약 0.5-1cm 길이로 절개합니다.
   7. 주입 펌프에 부착된 파이프라인에 바늘을 연결합니다.
   8. 좌심실에 바늘을 삽입합니다.
   9. 혈액이 맑아질 때까지 0.9% 식염수 500mL로 경심장 관류(40mL/분)를 통해 동물을 헹굽니다.
   10. 고정을 위해 500mL의 4% 파라포름알데히드(PFA)와 함께 경심 관류(40mL/분)를 통해 동물을 관류합니다.
   11. 쥐의 머리를 제거하고 두개골에서 뇌 조직을 조심스럽게 벗겨냅니다.
   12. 고정 후 48시간 동안 병에 담긴 약 20mL의 4% PFA로 뇌를 보존합니다.
2. 조직 처리 및 IHC 염색^{수행 36,37}.
   참고: immunoperoxidase secondary detection system kit를 사용하여 포르말린이 고정되고 파라핀이 포함된 조직 절편에 대해 면역조직화학적 염색을 수행합니다.
   1. 포르말린 고정 및 파라핀 포매 조직 절편을 사용하십시오.
   2. 탈파라핀화를 수행하고 슬라이드를 3%_H2O2로 처리하여 내인성 과산화효소 활성을 차단합니다. 90°C에서 구연산염 완충액을 사용하여 항원 회수를 수행합니다.
   3. immunoperoxidase secondary detection system kit를 사용하여 면역조직화학적 염색을 수행합니다.
      참고: 염색 절차는 제조업체의 권장 사항에 따라 수행됩니다.
   4. 헤마톡실린을 사용하여 표본을 반대 염색합니다.
   5. 퇴색 방지 시약으로 표본을 장착합니다.
   6. 면역조직화학 염색을 위해 항신경교섬유산단백질(GFAP) 항체를 사용합니다.
   7. 광학 현미경 슬라이드 스캐너를 사용하여 ROI 이미지를 획득합니다(그림 6).

5. 행동 및 이미지 결과의 통계적 분석

참고: 본 연구에서는 통계 분석이 SPSS에서 수행되었습니다. 그러나 통계 분석은 다른 통계 도구 상자에서 수행할 수 있습니다.

1. SPSS *.sav 파일에서 와이드 형식의 데이터를 로드합니다.
2. 그룹 간에 시간 경과에 따른 행동(정규화된 가중치, mNSS 및 빔 보행 시간)과 이미지 결과(피질 및 CC의 FA 값)를 비교하기 위해 반복 측정 분산 분석(ANOVA)을 수행합니다.
   1. 반복 측도를 > 일반 선형 모형> 분석을 클릭합니다.
   2. Within-Subject Factor Name 상자에 이름(예: 시간)을 할당하고 Number of Levels 상자(후속 조치 시점이 다른 3개 수준)에 '3'을 입력합니다. 반복된 측정 정의 요인(Repeated Measures Define Factor(s)) 대화 상자의 측정 이름(Measure Name) 상자에 이름(예: mNSS)을 지정합니다.
   3. 검정해야 하는 개체내 변수 (CHI 이전, D1 및 D50 이후에 획득한 데이터)를 로드하고 반복 측정 대화 상자에서 개체-간 요인(예: 영향 모수가 다른 동물 그룹)을 지정합니다.
   4. 관측된 평균에 대한 사후 다중 비교 대화 상자에서 요인(예: 동물 그룹)에 대한 사후 검정으로 Bonferroni를 선택합니다.
      참고: 다중 비교를 수정하기 위해 시간 경과에 따른 비교에 대해 Bonferroni 보정(0.05/3)을 사용하여 유형 I 오류를 조정했습니다. 통계적 유의성은 p < 0.05(SPSS 조정)로 정의되었습니다.
3. 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 분석을 수행하여 그룹 간의 우측 반사(righting reflex)와 대뇌피질 용적(cortical volume)의 변화를 비교합니다.
   1. 분석을 클릭하여 평균> 일원 분산 분석> 비교합니다.
   2. 변수(우측 반사 및 피질 용적의 변화)를 Dependent List에 불러오고 그룹을 One-Way ANOVA 대화 상자에서 Factor로 불러옵니다.
   3. One-Way ANOVA: Post Hoc Multiple Comparisons 대화 상자에서 Bonferroni를 사후 검정으로 선택합니다.
      참고: 다중 비교를 수정하기 위해 그룹 간 비교에 대해 Bonferroni 보정(0.05/5)을 사용하여 유형 I 오류를 조정했습니다. 통계적 유의성은 p < 0.05(SPSS 조정)로 정의되었습니다.

결과

그림 2는 SMCx에서 가짜 및 반복적 CHI를 가진 대표 동물의 종방향 MRI를 보여줍니다. CHI 후 1일 및 50일 동안 T2 가중치 이미지에서 심각한 두개골 골절이나 뇌 타박상이 발견되지 않았습니다. CHI 후 1일과 50일 동안 FA 맵에서 WM의 심각한 부종이나 변형이 발견되지 않았습니다. 이 연구에서 CHI를 투여받은 모든 동물은 50일의 전체 실험 기간 동안 생존하여...

토론

이 연구는 단순 경미한 외상성 뇌 손상(mTBI)의 동물 모델을 구축하여 단일 및 반복 손상의 누적 효과와 다양한 뇌 영역에 대한 충격의 결과를 평가하는 것을 목표로 했습니다. 폐쇄 머리 체중 감소 부상 패러다임에서 채택된 폐쇄 머리 부상(CHI) 모델은 운동선수와 헬멧 보호 장비를 착용한 개인이 일반적으로 경험하는 뇌진탕을 모방하도록 설계되었습니다. 이 모델은 국소...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetaminophen	Center Laboratories Inc	N02BE01
Antibiotics (Dermanest cream)	Commwell Pharmaceutial Co., Ltd	49391
Antigen Retrival buffer (100x Citrate buffer)	Abcam	AB93678
Anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibody	Bioworld Technology, Inc	BS6460
Balance beam	Custom made	Custom made	3 cm depth, 3 cm width, 80 cm length, and 60 cm above the floor
Behavior apparatus
Circular helmet	Custom made	Custom made	Stainless steel, 10-mm diameter, 1-mm thickness
Closed-head injury
Closed-Head injury impactor	Custom made	Custom made	A stainless steel tube (1-m height with 20-mm inner diameter), a secured impactor with a round tip (stainless steel, 10-mm tip diameter) at the bottom of the tube, a weight (stainless steel, 600 g).
Formalin	Bioworld Technology, Inc	C72
Gas Anesthesia Instrument (Vaporizer)	RWD Life Science Co.	R580S Animal Anesthesia Vaporizers and Accessories
Hematoxylin	Bioman Scientific Co., Ltd	17372-87-1
Immunohistology
Immunoperoxidase Secondary Detection system kit	Bio-Check Laboratories Ltd	K5007
Isoflurane	Panion & BF Biotech Inc.	8547
Lidocaine	Step Technology Co., Ltd	N01BB02
light microscope slide scanner	Olympus	BX63
MR-compatible small animal monitoring and gating system	SA Instruments	Model 1025	The monitoring kit with the respiratory pillow, ECG electrodes, and rectal probe
MRI
MRI operating council	Bruker	Biospec	Paravision 360 software.
MRI System	Bruker	Biospec	PET/MR scanner (PET inline), 7 T, 105 cm  inner bore diameter with gradient set.
Open field arena	Custom made	Custom made	75 cm length, 50 cm width, and 40 cm depth
Pulse oximeter	STARR Life Sciences Corp.	MouseOx Plus	Mouse & Rat Pulse Oximeter
Rat Adaptors	RWD Life Science Co.	68021
SPSS Statistics 29	IBM	Version 29.0
Stereotaxic frame	RWD Life Science Co.	G1124901-001
Volume coil	Bruker	Biospec	40-mm inner diameter, transceiver for radiofrequency excitation and signal receiving.
Xylazine	Bayer Taiwan Company Ltd
Zoletil	Virbac	BN8M3YA