Kilo Düşürme Yöntemi ile Modifiye Edilmiş ve Manyetik Rezonans Görüntüleme ile Kanıtlanmış Komplike Olmayan Hafif Travmatik Beyin Hasarı Modelinin Geliştirilmesi

Özet

Burada, akut fazda korunmuş beyin yapısı ve uzun süreli beyin atrofisi ile komplike olmayan hafif travmatik beyin hasarının nörogörüntü sonucunu kopyalayan bir kapalı kafa travması hayvan modeli oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Boylamsal manyetik rezonans görüntüleme, kanıt için kullanılan birincil yöntemdir.

Özet

Beyin sarsıntısı olarak bilinen hafif travmatik beyin hasarı (mTBI), dünya çapında beyin yaralanmalarının %85'inden fazlasını oluşturur. Özellikle, akut dönemde rutin klinik görüntülemede negatif bulgular gösteren komplike olmayan mTBH, bu hastalarda erken ve uygun bakımı engellemektedir. Farklı etki parametrelerinin mTBH'yi takiben sonraki nöropsikolojik semptomların ilerlemesini etkileyebileceği ve hatta hızlandırabileceği kabul edilmiştir. Bununla birlikte, sarsıntı sırasındaki etki parametrelerinin sonuçla ilişkisi kapsamlı bir şekilde incelenmemiştir. Bu çalışmada, ağırlık düşürme yaralanması paradigmasından modifiye edilmiş kapalı kafa travması (CHI) olan bir hayvan modeli tanımlanmış ve ayrıntılı olarak gösterilmiştir. Yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçanları (n = 20), farklı etki parametrelerine sahip CHI gruplarına rastgele atandı (grup başına n = 4). T2 ağırlıklı görüntüleme ve difüzyon tensör görüntüleme dahil olmak üzere uzunlamasına MR görüntüleme çalışmaları ve modifiye nörolojik şiddet skoru (mNSS) ve ışın yürüme testi gibi sıralı davranışsal değerlendirmeler 50 günlük bir çalışma süresi boyunca gerçekleştirildi. Astrogliozis için immünohistokimyasal boyama, yaralanma sonrası 50. günde yapıldı. Tekrarlayan CHI'yi takiben hayvanlarda, tek yaralanma ve sahte gruba kıyasla daha kötü davranışsal performans gözlenmiştir. Uzunlamasına manyetik rezonans görüntüleme (MRG) kullanılarak, yaralanma sonrası 24 saat içinde önemli bir beyin kontüzyonu gözlenmedi. Bununla birlikte, yaralanma sonrası 50. günde kortikal atrofi ve kortikal fraksiyonel anizotropi (FA) değişikliği gösterildi, bu da klinik komplike olmayan mTBI'nın başarılı bir şekilde tekrarlandığını düşündürdü. En önemlisi, mTBI'dan sonra gözlenen nörodavranışsal sonuçlardaki ve görüntü özelliklerindeki değişiklikler, hayvanlarda etki sayısına, yaralanmalar arası aralıklara ve seçilen etki bölgesine bağlıydı. Preklinik MRG ile birleştirilen bu in vivo mTBI modeli, tüm beyin ölçeğinde beyin hasarını keşfetmek için bir araç sağlar. Ayrıca, mTBI'ya duyarlı görüntüleme biyobelirteçlerinin çeşitli etki parametreleri ve şiddet seviyelerinde araştırılmasına da olanak tanır.

Giriş

Hafif travmatik beyin hasarı (mTBI) öncelikle temas sporları yapan sporcularda, askeri gazilerde ve trafik kazası geçiren kişilerde görülür¹. Rapor edilen tüm kafa yaralanmalarının %85'inden fazlasını oluşturur². mTBH'nin geniş etiyolojisi ve artan küresel insidansı, mTBH'nin geç başlangıçlı nörodejeneratif hastalığın geçici bir çevresel risk faktörü olarak dahil edilmesinin altını çizmektedir³. Komplike olmayan hafif TBH, bilgisayarlı tomografi (BT) veya manyetik rezonans görüntüleme (MRG) taramalarında yapısal anormallik gözlenmeden 13-15 arasında bir Glasgow Koma Skoru (GCS) ile karakterizedir. Komplike olmayan mTBI'li hastaların yaşadığı yaygın semptomlar arasında baş ağrısı, baş dönmesi, mide bulantısı veya kusma ve yorgunluk bulunur. Bununla birlikte, komplike olmayan mTBH'yi takiben sonuçların boylamsal değerlendirmesi, hastalarda yüksek bırakma oranı nedeniyle önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır⁴.

Tekrarlayan mTBI endişeleri, özellikle Ulusal Futbol Ligi (NFL) profesyonel sporcu topluluğu içinde artmış ve daha sonra profesyonel olmayan sporcular arasında farkındalık yaratmıştır⁵. Beyin savunmasızlığının, ilk mTBI'yi takiben artacağı ve sonraki hakaretlerin potansiyel olarak yaralanma sonuçlarını kötüleştireceği varsayılmaktadır. Futbolcuların en büyük bağışlanan beyin kohortundan elde edilen son bulgular, yalnızca kronik travmatik ensefalopati (CTE) şiddetinde önceki futbol katılımını etkilemekle kalmadı, aynı zamanda futbolla ilgili farklı faktörler ile CTE^6'nın riski ve şiddeti arasında bir korelasyon olduğunu da gösterdi. Bu nedenle, beyin sarsıntısı sayısının ve tekrarlayan rejimin yaralanma sonuçları üzerindeki etkisine ilişkin endişe artmaktadır. Klinik öncesi araştırmalar, çeşitli kapalı kafa travması (CHI) modelleri kullanarak tekrarlayan mTBI sonrası nöropatolojik değişiklikleri, nöroinflamatuar kaskad ve nöropsikolojik bozukluğu araştırmıştır ^{7,8,9,10,11,12,13,14}. Bununla birlikte, akut fazda fonksiyonel bozulma ve kronik fazda beyin atrofisi ile sonuçlanan sporla ilgili tekrarlayan sarsıntılı kafa darbelerini yakından taklit edebilen komplike olmayan mTBI modeli üzerindeki etki parametrelerinin araştırılması iyi incelenmemiştir.

Su moleküllerinin difüzyonunu değerlendiren bir teknik olan difüzyon tensör görüntüleme (DTI), mTBI'nin etkilerini araştıran çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. DTI'den türetilen önemli bir metrik olan fraksiyonel anizotropi (FA), su yayılımı tutarlılığının derecesini ölçer ve aksonların ve sinir lifi demetlerinin yapısal organizasyonu hakkında bilgi sağlar. Beyaz cevherdeki (WM) FA değerlerinin bozulması, çeşitli modellerde mTBI'yi takiben^{önerilmiştir} 8,10,11,15,16,17. Ek olarak, aksonal ve miyelin bütünlüğünü gösteren eksenel difüzyon (AD) ve radyal difüzyon (RD), klinik öncesi çalışmalarda mTBI'dan sonra değişti 10,15,16,18,19,20. Bununla birlikte, önceki çalışmalar arasında DTI bulgularındaki tutarsızlıklar, mTBI şiddetindeki değişiklikler, etki parametrelerindeki farklılıklar, çeşitli mTBI modelleri ve tutarsız yaralanma sonrası takip zaman noktalarından kaynaklanmaktadır⁹.

Bu nedenle, mevcut protokol belgesi, tek ve tekrarlayan mTBI'nın kümülatif etkilerini değerlendirmek için tasarlanmış bir mTBI hayvan modeli oluşturmayı amaçlamaktadır. Yaralanma sonrası dinamik değişiklikleri yakalamak ve farklı etki parametrelerinin etkilerini keşfetmek için hayvan refahı, davranışsal sonuçlar, DTI parametreleri ve kortikal hacim değerlendirmeleri dahil olmak üzere kapsamlı ve boylamsal değerlendirmeler dahil ettik. Hem akut fonksiyonel bozukluğu hem de uzun vadeli mikroyapısal değişiklikleri göstererek, bu model, önceki hayvan çalışmalarında tam olarak ele alınmayan komplike olmayan mTBI'nın temel özelliklerini etkili bir şekilde çoğaltır. Burada, modifiye edilmiş bir kapalı kafa ağırlık düşürme yöntemi ^8,11 kullanarak karmaşık olmayan bir mTBI modeli geliştirmek ve mTBI'yi takiben boylamsal değerlendirme yapmak için ayrıntılı bir protokol sağladık.

Protokol

Çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Hayvan Araştırmaları Rehberi (Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu) ve Hayvan Araştırmaları: İn Vivo Deneylerin Raporlanması kılavuzlarının tavsiyelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm hayvan deneyleri, Ulusal Yang Ming Chiao Tung Üniversitesi'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Yirmi hayvan rastgele 5 gruba ayrıldı (grup başına n = 4): (i) sensorimotor kortekste tek darbe (SMCx/tek), (ii) 1 saatlik aralıklarla SMCx'te çift darbe (SMCx/2 vuruş/1 saat), (iii) 10 dakikalık aralıklarla SMCx'te çift darbe (SMCx/2 vuruş/10 dakika), (iv) 1 saatlik aralıklarla merkezi beyinde çift darbe (Merkez/2 vuruş/1 saat), ve (v) uzunlamasına sonuç değerlendirmesi için sadece ameliyatla ancak doğrudan kafaya çarpmayan sahte grup (Şekil 1). Dikkat çekici bir şekilde, bu çalışma için seçilen yaralanmalar arası aralıklar (1 saate karşı 10 dakikalık aralıklar), temas sporları yapan sporcuların yaşadığı tek bir sezonda bin defaya kadar çıkabilen tekrarlayan alt sarsıntı etkilerini ^{8,10,11,13,21} taklit edecek şekilde tasarlanmıştır ^22,23.

1. Kapalı kafa travmasının (CHI) indüksiyonu

NOT: 10 ila 12 haftalık ve 250 g'ın üzerinde ağırlığa sahip yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçanları, yiyecek ve suya ad libitum erişimi olan 12/12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsü altında barındırılır.

1. Fareyi küçük bir indüksiyon odasına yerleştirin ve izofluran (% 5) ve tıbbi hava (2.5-3 L / dak) karışımı ile uyuşturun. Bir pençe veya kuyruk tutamına yanıt vermeyene kadar fareyi hazneden çıkarın.
2. Fareyi ısıtma yastığının üzerine yerleştirin.
   NOT: Farelerin vücut ısısını korumak için ameliyat sırasında ısıtma yastığını açın.
3. Fareyi stereotaksik bir çerçeveye getirin ve bir diş çubuğu ile sabitleyin. Ameliyat sırasında bakım için 1.5-2 L / dk akış hızında tıbbi hava ile bağlı burun konisini kullanarak% 2'de izofluran uygulayın.
4. Kulak çubuklarını yerleştirin. Farenin stereotaksik çerçeve üzerinde ortalandığından ve simetrik olduğundan emin olun.
   NOT: Tüm cerrahi prosedürler aseptik koşullar altında yapılmalıdır. Aletler ameliyattan önce bir buhar otoklav kullanılarak sterilize edildi ve uçları işlem sırasında ek olarak bir boncuk sterilizatörü ile sterilize edildi. Kontaminasyonu önlemek için hayvanın üzerine cerrahi bir örtü yerleştirildi. Cerrah saçlarını örtmek için bir şapka, yüzlerini kapatmak için bir maske taktı ve işlem sırasında bir laboratuvar önlüğü ve cerrahi eldivenlerle donatıldı²⁴.
5. Hayvanın solunum hızını, kalp atış hızını, kan oksijen seviyesini ve vücut ısısını izlemek için nabız oksimetresinin sensörünü hayvanın arka pençesine takın.
6. 1 mL / kg vücut ağırlığı lidokain (20 mg / mL) subkutan olarak analjezik olarak farenin boynuna enjekte edin.
7. Hayvanın kafasına tüy dökücü krem sürün ve 3 dakika bekleyin. Kremayı %70 izopropil alkollü çubuklarla silin.
8. İyotla ıslatılmış steril bir pamuklu çubuk kullanarak traşlı alanı birkaç kez temizleyin. % 70 etanole batırılmış bir pamuklu çubuk kullanarak iyot kalıntısını çıkarın.
9. Kafatasının yüzeyine erişmek için steril cerrahi bıçak kullanarak traş edilmiş deride yaklaşık 2-2,5 cm uzunluğunda bir orta hat kesisi oluşturun.
10. Kafatasını ortaya çıkarmak için pamuklu bir ped kullanarak kemik üzerindeki dokuyu çıkarın. Kafatası yüzeyini %0,9 tuzlu suya batırılmış bir pamuklu çubuk kullanarak temizleyin, ardından kuru bir pamuklu bezle temizleyin.
    NOT: Kafatası dikişleri ve hem bregma hem de lambda artık kolayca tanımlanabilir.
11. Koordinata dayalı etki alanını daha fazla bulmak için bregma'yı referans noktası olarak belirleyin.
    NOT: Bu protokolde, CHI indüksiyonu için iki koordinat seti kullanılır: (-2.5,-2.0) (2.5 mm lateral 2.0 mm bregmaya posterior) sensorimotor korteksin (SMCx) üstünde ve (0,-3.0) merkezi beynin üstünde (merkezi).
12. Kafatası yüzeyinde seçilen koordinatları belirleyin ve diş çimentosu kullanarak belirlenen alanın üzerine dairesel bir paslanmaz çelik kask (10 mm çapında ve 1 mm kalınlığında) yapıştırın. Isıtma yastığını ve nabız oksimetresini çıkarın.
13. Stereotaktik cihazı ve fareyi kaldırma masası üzerinde (14 cm uzunluk, 8 cm genişlik ve 6.15 cm derinlik) CHI çarpma tertibatının altına hareket ettirin.
14. Bir köpük sünger (19 cm uzunluğunda, 10 cm genişliğinde ve 4 cm derinliğinde, 18 kg/^m3 yoğunluğunda) kullanarak sıçanın gövdesini yükseltin.
15. Fareyi stereotaksik çerçevenin kulak çubuklarından çıkarın. Fareyi, burun konisine bağlı diş çubuğunun üzerinde sabit tutun ve% 2 izofluran verin. Baş ve gövdenin rostral-kaudal yönde düz bir şekilde hizalandığından emin olun.
16. CHI çarpma tertibatı ile kask arasında boşluk kalmamasını sağlamak için kaldırma tablasını ayarlayın. Çarpışmadan 5 s önce izofluranı kapatın.
    NOT: Beyin hasarına bağlı düzeltme refleksini belirtmek için, izofluranın geçici olarak kesilmesi gerçekleştirildi²⁵.
17. 600 g pirinci 1 m yükseklikten paslanmaz çelik bir borudan (paslanmaz pirinç ağırlıklardan oluşan bir sütunu temizlemek için iç çapı 20 mm olan 1 m yükseklik) metal kaskı hedefleyen yuvarlak uçlu güvenli çarpma tertibatına bırakın.
    NOT: Sahte gruptaki hayvanlar, pirinç damla farenin kafasındaki kask ile temas etmeden serbest bırakıldığı için bir darbe yaşamadı.
18. Kaldırma tablasını indirin. Fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın ve fareyi bir ısıtma yastığı üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
19. Hayvanın sırtüstü pozisyondan yüzüstü pozisyona^{geçmeye çalıştığı zaman olan doğrultma} refleksinin zamanını kaydedin ^26,27.
    NOT: Tekrarlayan CHI'ye maruz kalan hayvanlar, 2^{. darbeden} 3 dakika önce tekrar uyuşturuldu. SMCx/double/10 dk grubundaki hayvanlar için zamanında yüzüstü pozisyona geri dönmeyen hayvanlar için, karşılık gelen düzeltme refleksi süresi 420 s olarak kaydedildi.
20. Doğrultma refleks kaydından sonra, adım 1.1'i kullanarak fareyi tekrar izofluran ile uyuşturun.
21. Adım 1.2'yi kullanarak fareyi stereotaksik çerçeve ile hareketsiz hale getirin.
    NOT: Kaskın stalll'ın üzerindeki stabilitesini onayladıktan sonra, 1.13^{. darbeyi} gerçekleştirmek için 1.17-2 adımlarını tekrar tekrarlayın.
22. Kaskı çıkarın. Kafatasının üstündeki tüm bağ dokusunu ve çimentoyu çıkarın.
23. Kafatasını diş çimentosu ile örtün ve kurumasını bekleyin. Cımbız sırtını kullanarak diş çimentosunun sert ve sert olduğunu kontrol edin.
    NOT: Ameliyat sonrası kafatası ve kafa derisi arasındaki kafatası-hava veya kafatası-kan arayüzlerinin neden olduğu duyarlılık artefaktlarını ortadan kaldırmak için diş çimentosu kafatasının üstüne uygulandı.
24. 4-5 bağımsız düğüm ile 4-0 naylon cerrahi dikişler kullanarak kesiyi kapatın.
    NOT: Yara yaklaşık 2-2,5 cm uzunluğundadır. Cerrahi dikişlerin kılcal hareket olmadığından ve ipek veya naylon malzemeden yapıldığından emin olun. Hayvanın çizilmesiyle yaranın açılmasını önlemek için kesiği tek bir düğüm kullanarak dikmeyin.
25. Enfeksiyonları önlemek için ameliyat bölgesine topikal antibiyotikler (Dermanest krem) uygulayın.
26. Ameliyat sonrası analjezikler olarak 1 mL / kg vücut ağırlığı carprofen (50 mg / mL) deri altına enjekte edin.
27. Fareyi, bilincini geri kazanana kadar bir ısıtma yastığı üzerinde temiz bir kafese koyun. Sıçan dik oturduğunda, onu ev kafesine geri koyun.
28. Ameliyattan sonra art arda 3 gün boyunca analjezik olarak her gün hayvana 200 mL su ile karıştırılmış 5 mL asetaminofen (24 mg / mL) oral yoldan uygulayın.

2. Manyetik rezonans görüntüleme (MRI)

NOT: T2 ağırlıklı görüntü ve difüzyon-tensör görüntüleme, CHI öncesi ve yaralanmadan 1 ve 50 gün sonra sıralı bir PET/MR 7T sistemi kullanılarak gerçekleştirilir (Şekil 1). CHI işleminden önceki 1 hafta içinde bir başlangıç MRG yapıldı. CHI'den sonraki 1. ve 50. günlerdeki değerlendirmeler için davranışsal değerlendirmeler sabah yapıldı ve ardından aynı gün öğleden sonra MRG taramaları yapıldı.

1. Sıçatanı, izofluran (% 5) ve tıbbi hava (2.5-3 L / dak) karışımı ile doldurulmuş küçük bir indüksiyon odasında uyuşturun.
2. Sıçan bir pençe veya kuyruk tutamına yanıt vermediğinde, baş önce yüzüstü pozisyonda hayvan beşiğine transfer ederken anesteziyi geçici olarak askıya alın.
3. Sıçanı, görüntü alımı sırasında bakım için 1,5-2 L/dk akış hızında tıbbi hava ile %2 izofluran sağlayan bir burun konisi ile bağlantılı baş tutucuya yerleştirin.
4. Tarama sırasında hareket etmesini önlemek için kafayı küçük bir bant parçasıyla sabitleyin.
   NOT: Kafa derisinin çıkarılmasına bağlı manyetik duyarlılık artefaktlarını önlemek için CHI'den sonraki ilk gün farenin kafasına biraz diş macunu uygulayın^28,29.
5. Solunumu izlemek için farenin göğüs kafesinin altına bir baskı pedi yerleştirin. Kalp atış hızını izlemek için oksimetre klipslerini arka bacakta bantlayın.
6. Rektal sıcaklığı ölçmek için rektal probu yerleştirin. Vücut ısısını korumak için deney sırasında fareyi dolaşan ılık su ve doku sargısı ile bir ısıtma battaniyesi ile örtün.
   NOT: Deney boyunca kalp atış hızı, solunum hızı ve rektal sıcaklık dahil olmak üzere fizyolojik durumları izleyin. Taramadan önce, yaşamsal belirti monitörünün kalitesinden emin olmak için farenin tüm fizyolojik sinyallerini kontrol edin.
7. Hassas hizalama için kafanın merkezini işaretlemek için PET/MR tarayıcının lazer konumlandırma sistemini kullanın.
8. Motorlu hayvan taşıma sistemini kullanarak hayvanı, başın merkezi tarayıcının izo merkezi ile aynı hizaya gelene kadar otomatik olarak MRI deliğine taşıyın.
   NOT: PET/MR sistemine entegre edilmiş motorlu hayvan taşıma sistemi, hayvanların doğru şekilde konumlandırılmasını sağlar ve görüntüleme modaliteleri arasında geçiş yaparken iş akışını kolaylaştırır.
9. MRI dizisi elde edin.
   1. İlk yerelleştirmeyi ve genel ayarlamayı gerçekleştirin.
   2. Orta sagital dilimi kullanın ve 8^{. dilimi} önden komissür deküsyonu ile hizalayın.
      NOT: Korpus kallozumun uzun eksenine göre yaklaşık 15°'lik bir açıya karşılık gelen, anterior komissür ile serebellumun tabanını birleştiren çizgi tarafından tanımlanan yatay düzleme dik olarak konumlandırılmıştır. Orta sagital dilim için T2-RARE taramasının temel parametreleri aşağıdaki gibidir: tekrarlama süresi (TR) = 2500 ms, yankı süresi (TE) = 44 ms, görüş alanı (FOV) = 3,5 cm, matris boyutu = 256 256, dilim kalınlığı = 1 mm, dilim sayısı = 1, RARE faktörü = 8, bant genişliği = 75 kHz, ortalama sayısı = 1, edinme süresi = 1 dakika 20 sn.
   3. Anatomik referans için T2 ağırlıklı görüntüler elde etmek için yağ bastırma ve beynin altında bir doygunluk bandı ile gevşeme artırma (RARE) ile hızlı alım kullanın (Şekil 2).
      NOT: T2-RARE taramasının temel parametreleri aşağıdaki gibidir: tekrarlama süresi (TR) = 3600 ms, yankı süresi (TE) = 40 ms, görüş alanı (FOV) = 2 cm, matris boyutu = 256 256, dilim kalınlığı = 1 mm, dilim sayısı = 16, RARE faktörü = 8, bant genişliği = 75 kHz, ortalama sayısı = 8, edinme süresi = 7 dakika 40 sn.
   4. Difüzyon tensör görüntüleri elde etmek için 4 atışlı bir spin-echo EPI kullanın (Şekil 2).
      NOT: DTI taramasının temel parametreleri aşağıdaki gibidir: TR = 3000 ms, TE = 28 ms, görüş alanı (FOV) = 2 cm, matris boyutu = 96 96, kalınlık = 1 mm, dilim sayısı = 16, darbe süresi (δ) = 5 ms, iki darbe arasındaki süre (Δ) = 15 ms, B0 sayısı = 5, yön sayısı = 30, b-değeri = 1000 s/^mm3, bant genişliği =150 kHz, ortalama sayısı = 4, edinme süresi = 14 dakika.
   5. Tarama protokolünü tamamlayın. Hayvan beşiğini mıknatıstan dışarı kaydırın. Hayvanı beşikten çıkarın.
   6. Vücut ısısını korumak için fareyi altında bir ısıtma yastığı bulunan temiz bir kafese aktarın. Bilincini geri kazandıktan sonra fareyi ev kafesine geri koyun.
10. Görüntü önişleme
    NOT: Veri işleme ve analiz için MRtrix3, İstatistiksel Parametrik Haritalama (SPM) yazılımı ve özel MATLAB komut dosyalarını kullanın.
    1. MRtrix3 komutunu (dwidenoise)³⁰ kullanarak DTI görüntülerinin gürültüsünü giderin.
    2. MRtrix komutunu (mrdegibbs)³⁰ kullanarak Gibb'in çınlayan artefaktlarını DTI görüntülerinden kaldırın.
    3. SPM işlevlerini (spm_coreg.m ve spm_powell.m) kullanarak uzunlamasına taramalarda tek bir konunun T2 ağırlıklı görüntülerine DTI görüntülerini birlikte kaydedin.
    4. Beyin bölgesini dilim dilim manuel olarak şekillendirerek ve ardından Otsu'nun yöntemi³¹ (özel MATLAB komut dosyası thr_otsu2.m) tarafından belirlenen hesaplanan eşiğin altındaki yoğunluğa sahip pikselleri kaldırarak T2 ağırlıklı görüntülerde kafatası sıyırma işlemi gerçekleştirin.
    5. SPM fonksiyonlarını (spm_coreg.m ve spm_powell.m) kullanarak aynı deney grubundaki hayvanlar arasında denekler arası ortak kayıt gerçekleştirin. Beyin maskesini ilgili DTI görüntülerine uygulayın.
       NOT: Kafatası sıyırma, bilgisayarın işlem süresini azaltmak için yapılır.
    6. DTI'ye (özel MATLAB komut dosyası, tensormap.m) dayalı tensör haritalarını hesaplayın.
    7. FA haritalarını hesapla (özel MATLAB komut dosyası, calFA.m)
       NOT: Tüm özel MATLAB komut dosyaları aşağıdaki veritabanı (https://doi.org/10.57770/9ZESXD) aracılığıyla kullanılabilir.
11. Görüntü analizi-FA
    1. CHI koordinatının altındaki üç ardışık görüntü dilimi için korteks ve korpus kallozumda (CC) ilgi bölgeleri (ROI'ler) çizin.
       NOT: Tüm ROI'ler, deney gruplarına kör olan 2 deneyimli araştırmacı tarafından manuel olarak çizilmiş ve büyük hatalar için görsel olarak incelenmiştir.
    2. ROI'lerden FA değerini çıkarın ve ortalamasını alın.
       NOT: Korteksin altındaki korpus kallozum için, kısmi hacim etkilerini ortadan kaldırmak için seçilen ROI'de FA < 0.35 değerlerine sahip pikseller hariç tutulmuştur. Korteks için, ROI'de FA < 0.35 değerlerine sahip tüm pikseller analiz için işe alındı.
12. Görüntü analizi-Hacim
    1. Bregma -7 ila +3 mm'de 11 ardışık görüntü dilimi için kortikal bölgeleri kapsayan ROI'leri manuel olarak çizin.
       NOT: Tüm ROI'ler, deney gruplarına kör olan 2 deneyimli araştırmacı tarafından manuel olarak çizilmiştir.
    2. Dilimler arasındaki ROI'lerin toplam piksellerini toplayın ve dilim kalınlığını (1 mm) çarparak bunları hacme dönüştürün.
    3. CHI'den sonraki kortikal hacmi, her hayvanın CHI'sinden önceki karşılık gelen hacimle normalleştirin.
       NOT: Sunumdan önce hayvanlar arasında beyin hacmindeki bireysel farklılıkları ortadan kaldırmak için verileri normalleştirin.

3. Davranış değerlendirmesi

NOT: Davranışsal deneyler, CHI'den önce ve ayrıca CHI'den 1 ve 50 gün sonra ışın yürüme dengesi testi ve mNSS kullanılarak gerçekleştirilir (Şekil 1). Toplanan verilerin doğruluğunu, tutarlılığını ve nesnelliğini sağlamak için tüm değerlendirmeler en az iki gözlemci tarafından gerçekleştirildi.

1. Işın yürüyüş dengesi testi
   1. Video kamerayı açın ve zamanlayıcıyı başlatın.
   2. Fareleri denge kirişinin bir ucuna yerleştirin (3 cm derinliğinde, 3 cm genişliğinde, 80 cm uzunluğunda ve yerden 60 cm yukarıda).
   3. Sıçan bir gidiş-dönüş yolculuğunu tamamladığında, düştüğünde veya 3 dakikadan fazla donduğunda zamanlayıcıyı durdurun.
      1. Deney sırasında, mNSS ^11,32,33,34 kullanarak değerlendirme için hayvan durumunu gözlemleyin. Değerlendirme için şu standartları izleyin:
      2. Sıçan, kiriş üzerinde sabit bir duruşla dengeyi koruyorsa, 0 puanı atayın.
      3. Sıçan kirişin kenarını kavrarsa, 1 puan verin.
      4. Sıçan kirişten bir uzuv uzakta düşerse, 2 puan verin.
      5. Sıçan iki uzuv kapalıyken düşerse veya kiriş üzerinde dönerse (>60 s), 3 puan verin.
      6. Sıçan kiriş üzerinde dengede durmaya çalışır ancak düşerse (>40 sn), 4 puan verin.
      7. Sıçan kiriş üzerinde dengede durmaya çalışır ancak düşerse (>20 sn), 5 puan verin.
      8. Sıçan kirişi dengelemeye veya asmaya çalışmazsa ve 20 saniye içinde düşerse, 6 puan verin.
      9. Sıçan görevi tamamlayamazsa, en fazla 3 dakika sürdüğünü düşünün ve 6 puan verin.
   4. Test günlerini belirli zaman noktalarında planlayın.
      NOT: CHI'den önce iki deneme için ışın yürüyüşünü tamamlamayan sıçanları, sonraki cerrahi ve takip davranışsal değerlendirmesinden hariç tutun.
2. Modifiye nörolojik şiddet skoru (mNSS)
   NOT: mNSS değerlendirmesi, motor testleri, duyusal testleri, refleks yokluğunu, anormal hareketleri, ışın dengesini ve günlük olarak hızlı bir şekilde gerçekleştirilen ^{yerde yürümeyi 32,33} içerir.
   1. Motor testleri yapın.
      1. Fareyi kuyruğun tabanından kaldırın ve uygun fleksiyon ve ekstansiyonu değerlendirmek için uzuvlarının reflekslerini yaklaşık 15 saniye gözlemleyin.
      2. Ön bacakta normal fleksiyon gözlenirse, 0 puanı atayın. Fleksiyon gözlenmezse, 1 puan atayın.
      3. Arka bacakta normal fleksiyon gözlenirse, 0 puanı atayın. Fleksiyon gözlenmezse, 1 puan atayın.
      4. Fareyi kuyruğundan kaldırdıktan sonra kafa 30 saniye içinde dikey eksene >10° hareket ederse, 0 puanı atayın. Değilse, 1 puan atayın.
         NOT: Sınavın bu oturumunda en fazla 3 puan verilecektir.
   2. Uzuv yerleştirme testleri yapın.
      NOT: Yerleştirme testi, duyusal (görsel, dokunsal duyum ve propriyosepsiyon) ve motor fonksiyon arasındaki koordinasyonu değerlendirmek için yapılır.
      1. Fareyi yavaşça masanın yüzeyine doğru indirin. Sıçanların pençelerinin yüzeye ulaşıp ulaşmadığını ve gerilip gerilmediğini gözlemleyin.
      2. Sıçanlar her iki uzuv gergin ve ileri doğru yüzeye ulaştıysa, 0 puan verin. Gecikme varsa veya yanıt yoksa, 1 puanı atayın.
      3. Fareyi yüzeye yerleştirin ve pençeyi masanın kenarına doğru çekin. Pençesinin masanın yüzeyinde normal bir konuma dönüp dönmediğini gözlemleyin.
      4. Anında ve normal yerleştirme yanıtları gözlenirse, 0 puanını atayın. Gecikmeli yerleştirme yanıtları gözlemlenirse, 1 puan atayın. Yanıt yoksa, 2 puan atayın.
         NOT: Sınavın bu oturumunda en fazla 3 puan verilecektir.
   3. Gözlemleyin, yokluğu ve anormal hareketleri yansıtın.
      1. Bir pamuklu çubuğun pamuk ucuyla işitsel meatusa dokunurken kulak kepçesi refleksini değerlendirmek için baş sallamalarını gözlemleyin.
      2. Normal bir refleks gözlenirse, 0 puan verin. Herhangi bir refleks gözlenmezse, 1 puan verin.
      3. Kornea refleksinin varlığını, pamuklu bir çubuğun pamuk ucuyla korneaya dokunarak değerlendirin.
      4. Normal bir yanıt ortaya çıkarsa, 0 puanını atayın. Göz kırpma yanıtı alınmazsa, 1 puan atayın.
      5. Ellerinizi kısa ve güçlü bir şekilde çırpın. İrkilme refleksinin varlığını gözlemleyin.
      6. Bir refleks gözlenirse, 0 puan verin. Herhangi bir refleks gözlenmezse, 1 puan verin.
      7. Sıçanın nöbet, miyoklonus veya miyodiston olup olmadığını gözlemleyin.
      8. Bunlardan herhangi biri meydana gelirse, 1 puan atayın.
         NOT: Sınavın bu oturumunda en fazla 4 puan verilecektir.
   4. Daha önce açıklandığı gibi ışın dengesi testini gerçekleştirin (adım 3.1).
      NOT: Sınavın bu oturumunda en fazla 6 puan verilecektir.
   5. Yerde yürüme testi yapın.
      1. Açık alan arenasını hazırlayın (75 cm uzunluk, 50 cm genişlik ve 40 cm derinlik). Temiz olduğundan ve önceki koku ipuçlarından arınmış olduğundan emin olun.
      2. Açık alan arenasının ortasına bir fare yerleştirin ve farenin arenada nasıl yürüdüğünü gözlemleyin.
      3. Sıçan düzenli bir yürüyüş yaparsa, 0 puan verin.
      4. Sıçan düz yürüyemiyorsa, 1 puan verin.
      5. Sıçan yere koyduktan sonra paretik tarafa düşerse, 3 puan verin.
         NOT: Sınavın bu oturumunda en fazla 3 puan verilecektir.
   6. Tüm puanları toplayın; Mümkün olan maksimum puan 18'dir.
      NOT: Daha yüksek puan, daha kötü bir sonucu gösterir.

4. İmmünohistoloji

1. Transkardiyak perfüzyon gerçekleştirin³⁵.
   NOT: Transkardiyak perfüzyon, CHI'den 50 gün sonra MRG taramasından sonra gerçekleştirilir (Şekil 1).
   1. Fareyi küçük bir indüksiyon odasına yerleştirin ve bir pençe veya kuyruk tutamına yanıt vermeyene kadar izofluran (% 5) ile uyuşturun.
   2. Derin anestezi için intraperitoneal enjeksiyon yoluyla 50 mg / kg vücut ağırlığı zoletil (50 mg / mL) ve 10 mg / kg vücut ağırlığı Xylazine (Roumpun, 23.32 mg / mL) uygulayın.
   3. Fareyi sırtüstü pozisyona getirin.
   4. Makas kullanarak göğüs kafesinin altında yaklaşık 4-5 cm uzunluğunda enine bir kesi yapın.
   5. Diyaframı bulun ve kalbi ortaya çıkarmak için kesin.
   6. Pulmoner arteri klemplemek için hemostatik forseps kullanın ve ardından sağ atriyumda yaklaşık 0,5-1 cm uzunluğunda bir kesi yapın.
   7. İğneyi infüzyon pompasına bağlı boru hattına bağlayın.
   8. İğneyi sol ventriküle yerleştirin.
   9. Kan temizlenene kadar hayvanı transkardiyak perfüzyon (40 mL / dak) ile 500 mL% 0.9 salin ile durulayın.
   10. Fiksasyon için hayvanı 500 mL% 4 paraformaldehit (PFA) ile transkardiyak perfüzyon (40 mL / dak) yoluyla perfüze edin.
   11. Farenin kafasını çıkarın ve beyin dokusunu kafatasından dikkatlice soyun.
   12. Beyni, fiksasyon sonrası için 48 saat boyunca şişede yaklaşık 20 mL% 4 PFA'da koruyun.
2. Doku işleme ve IHC boyama^{gerçekleştirin 36,37}.
   NOT: İmmünoperoksidaz ikincil tespit sistemi kitini kullanarak formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü doku kesitleri üzerinde immünohistokimyasal boyama gerçekleştirin.
   1. Formalinle sabitlenmiş ve parafine gömülü doku kesitleri kullanın.
   2. Deparafinizasyon yapın ve endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek için slaytları% 3 H₂O₂ ile tedavi edin. 90 ° C'de sitrat tamponu kullanarak antijen alımını gerçekleştirin.
   3. İmmünoperoksidaz ikincil tespit sistemi kitini kullanarak immünohistokimyasal boyama yapın.
      NOT: Boyama işlemleri, üreticinin tavsiyelerine göre gerçekleştirilir.
   4. Örnekleri lekelemek için hematoksilen kullanın.
   5. Numuneleri bir antifade reaktifi ile monte edin.
   6. İmmünohistokimyasal boyama için anti-glial fibriler asidik protein (GFAP) antikorları kullanın.
   7. Bir ışık mikroskobu slayt tarayıcısı kullanarak ROI'lerin görüntülerini elde edin (Şekil 6).

5. Davranış ve görüntü sonuçlarının istatistiksel analizi

NOT: Bu çalışmada SPSS programında istatistiksel analiz yapılmış; Bununla birlikte, istatistiksel analiz diğer istatistiksel araç kutularında da gerçekleştirilebilir.

1. Verileri geniş biçimde bir SPSS *.sav dosyasına yükleyin.
2. Gruplar arasında zaman içinde davranışsal (normalleştirilmiş ağırlık, mNSS ve ışın yürüyüş süresi) ve görüntü sonuçlarını (korteks ve CC'deki FA değerleri) karşılaştırmak için tekrarlanan varyans analizi (ANOVA) yapın.
   1. Tekrarlanan Ölçüler > Genel Doğrusal Model > Analiz Et'e tıklayın.
   2. Özne İçi Faktör Adı kutusuna bir ad atayın (örneğin, zaman) ve Düzey Sayısı kutusuna '3' koyun (farklı takip zaman noktalarına sahip üç düzey). Tekrarlanan Ölçümler Faktör(ler)i Tanımla iletişim kutusundaki Ölçü Adı kutusuna (ör. mNSS) bir ad atayın.
   3. Test edilmesi gereken Denek İçi Değişkenleri (CHI öncesi, D1 ve D50 sonrasında elde edilen veriler) yükleyin ve Tekrarlanan Ölçümler iletişim kutusunda denekler arası faktörü (örneğin, farklı etki parametrelerine sahip hayvan grupları) belirtin.
   4. Gözlemlenen Ortalamalar iletişim kutusu için post hoc çoklu karşılaştırmalarda Faktör(ler) (örneğin, hayvan grupları) için Post Hoc Test olarak Bonferroni'yi seçin.
      NOT: Çoklu karşılaştırmaları düzeltmek için, zaman içindeki karşılaştırmalar için tip I hata, Bonferroni düzeltmeleri (0.05/3) kullanılarak ayarlanmıştır. İstatistiksel anlamlılık p < 0.05 (SPSS düzeltilmiş) olarak tanımlandı.
3. Gruplar arasında doğrultma refleksini ve kortikal hacim değişimini karşılaştırmak için tek yönlü bir ANOVA analizi yapın.
   1. Analiz et > Araçları karşılaştır > tek yönlü ANOVA'ya tıklayın.
   2. Bağımlı Listedeki değişkenleri (düzeltme refleksi ve kortikal hacim değişikliği) ve grupları Tek Yönlü ANOVA iletişim kutusunda Faktör olarak yükleyin.
   3. Tek Yönlü ANOVA: Tek Yönlü Çoklu Karşılaştırmalar iletişim kutusunda post hoc test olarak Bonferroni'yi seçin.
      NOT: Çoklu karşılaştırmaları düzeltmek için, gruplar arasındaki karşılaştırmalar için Bonferroni düzeltmeleri (0.05/5) kullanılarak tip I hata düzeltildi. İstatistiksel anlamlılık p < 0.05 (SPSS düzeltilmiş) olarak tanımlandı.

Sonuçlar

Şekil 2, SMCx'te sahte ve tekrarlayan CHI ile temsili hayvandan alınan uzunlamasına MRG'leri göstermektedir. CHI'den 1 ve 50 gün sonra T2 ağırlıklı görüntülerde önemli bir kafatası kırığı veya beyin kontüzyonu bulunmadı. CHI'den 1 ve 50 gün sonra FA haritalarında WM'de belirgin bir ödem veya deformasyon bulunmadı. Bu çalışmada CHI'ye maruz kalan tüm hayvanlar, 50 günlük tüm deney süresi boyunca hayatta kaldı ve CHI modelinin ...

Tartışmalar

Bu çalışma, tek ve tekrarlayan yaralanmaların kümülatif etkilerini ve farklı beyin bölgeleri üzerindeki etkilerin sonuçlarını değerlendirmek için komplike olmayan hafif travmatik beyin hasarının (mTBI) bir hayvan modelini oluşturmayı amaçladı. Kapalı kafa ağırlık düşürme yaralanması paradigmasından uyarlanan kapalı kafa travması (CHI) modeli, sporcular ve kask koruması olan bireyler tarafından yaygın olarak yaşanan sarsıntıları taklit etmek için tas...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetaminophen	Center Laboratories Inc	N02BE01
Antibiotics (Dermanest cream)	Commwell Pharmaceutial Co., Ltd	49391
Antigen Retrival buffer (100x Citrate buffer)	Abcam	AB93678
Anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibody	Bioworld Technology, Inc	BS6460
Balance beam	Custom made	Custom made	3 cm depth, 3 cm width, 80 cm length, and 60 cm above the floor
Behavior apparatus
Circular helmet	Custom made	Custom made	Stainless steel, 10-mm diameter, 1-mm thickness
Closed-head injury
Closed-Head injury impactor	Custom made	Custom made	A stainless steel tube (1-m height with 20-mm inner diameter), a secured impactor with a round tip (stainless steel, 10-mm tip diameter) at the bottom of the tube, a weight (stainless steel, 600 g).
Formalin	Bioworld Technology, Inc	C72
Gas Anesthesia Instrument (Vaporizer)	RWD Life Science Co.	R580S Animal Anesthesia Vaporizers and Accessories
Hematoxylin	Bioman Scientific Co., Ltd	17372-87-1
Immunohistology
Immunoperoxidase Secondary Detection system kit	Bio-Check Laboratories Ltd	K5007
Isoflurane	Panion & BF Biotech Inc.	8547
Lidocaine	Step Technology Co., Ltd	N01BB02
light microscope slide scanner	Olympus	BX63
MR-compatible small animal monitoring and gating system	SA Instruments	Model 1025	The monitoring kit with the respiratory pillow, ECG electrodes, and rectal probe
MRI
MRI operating council	Bruker	Biospec	Paravision 360 software.
MRI System	Bruker	Biospec	PET/MR scanner (PET inline), 7 T, 105 cm  inner bore diameter with gradient set.
Open field arena	Custom made	Custom made	75 cm length, 50 cm width, and 40 cm depth
Pulse oximeter	STARR Life Sciences Corp.	MouseOx Plus	Mouse & Rat Pulse Oximeter
Rat Adaptors	RWD Life Science Co.	68021
SPSS Statistics 29	IBM	Version 29.0
Stereotaxic frame	RWD Life Science Co.	G1124901-001
Volume coil	Bruker	Biospec	40-mm inner diameter, transceiver for radiofrequency excitation and signal receiving.
Xylazine	Bayer Taiwan Company Ltd
Zoletil	Virbac	BN8M3YA