Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים תנאי תרבית חוץ גופית , בידוד וייצור מוגבר של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מ-Echinococcus granulosus. הרכבים החשמליים הקטנים התאפיינו בפיזור אור דינמי ובמיקרוסקופ אלקטרונים שידור. הספיגה על ידי תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם והאפנון הפנוטיפי שלהם נחקרו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וציטומטריית זרימה.

Abstract

הפרשת שלפוחיות חוץ-תאיות על ידי צסטודות חיונית לאפשר תקשורת תאית לא רק בין טפילים אלא גם עם רקמות מארח. בפרט, שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEVs) פועלות כננו-נשאים המעבירים אנטיגנים טבעיים, שהם קריטיים לאימונומודולציה של המארח ולהישרדות הטפילים. מאמר זה מציג פרוטוקול שלב אחר שלב לבידוד sEVs מתרביות שלב הזחל של Echinococcus granulosus ומנתח את ספיגתם על ידי תאים דנדריטיים המתקבלים ממח עצם עכבר, אשר רוכשים יכולת הידבקות והצגת אנטיגן במהלך התבגרותם לאחר שבוע של תרבית חוץ גופית . מאמר זה מספק מידע מקיף להפקה, טיהור וכימות של sEVs באמצעות אולטרה-צנטריפוגה לצד ניתוחים מקבילים של פיזור אור דינמי ומיקרוסקופ אלקטרונים הולכה. בנוסף, מתואר פרוטוקול ניסוי מפורט לבידוד וטיפוח תאי מח עצם של עכבר והנעת ההתמיינות שלהם לתאים דנדריטיים באמצעות Flt3L. תאים דנדריטיים אלה יכולים להציג אנטיגנים לתאי T נאיביים, ובכך לווסת את סוג התגובה החיסונית in vivo. לפיכך, מוצעים פרוטוקולים חלופיים, כולל מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח ציטומטריית זרימה, כדי לבדוק את הפנוטיפ הבוגר הנרכש של תאים דנדריטיים שנחשפו בעבר ל-sEVs טפילים. לבסוף, ראוי לציין כי ניתן ליישם את הפרוטוקול המתואר בכללותו או בחלקים בודדים כדי לבצע תרבית טפיל במבחנה , לבודד שלפוחיות חוץ-תאיות, ליצור תרביות תאים דנדריטיים שמקורן במח העצם ולבצע בדיקות קליטה עם תאים אלה.

Introduction

Echinococcus granulosus הוא הלמינת'ס טפילי זואונוטי האחראי לזיהום ארוך טווח המכונה אכינוקוקוזיסציסטי 1. במארחי ביניים, כגון בעלי חיים ובני אדם, זיהום הטפיל משפיע בעיקר על הכבד והריאות, שם שלב הזחל מתפתח כציסטות מלאות בנוזל או מטצטודות המכילות פרוטוסקולקים (זחל עצמו). כמו כל הצסטודות, לטפיל זה אין מערכות עיכול והפרשה ולכן פיתח תהליכים תאיים אנדוציטיים ואקסוציטיים פעילים כדי לווסת את הספיגה וההפרשה של מטבוליטים כמו גם את שחרור השלפוחיות החוץ-תאיות2,3. שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן חלקיקים סגורים בשומנים דו-שכבתיים המופרשים ככל הנראה על ידי כל סוגי התאים. בפרט, שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEVs), המוגדרות כ-EVs קטנים מ-200 ננומטר ללא קשר למקור הביוגנזה שלהם4, יכולות לשמש כמתווכים חיסוניים בין-תאיים. פונקציה זו משמעותית במיוחד בטפילים, המסתמכים על אימונומודולציה של המארח כדי להבטיח את הישרדותם3. מניפולציה חיסונית מושגת באמצעות ספיגת sEVs על ידי תאים דנדריטיים מארחים, התאים היחידים המסוגלים להפעיל תאי T נאיביים in vivo וליזום תגובה חיסונית נרכשת שתוביל לזיהום כרוני על ידי תולעים טפיליות אלה. תאים דנדריטיים, תאים מקצועיים המציגים אנטיגן של מערכת החיסון המולדת, מעבדים ומעמיסים פפטידים אנטיגניים על קומפלקס תאימות היסטולוגית עיקרי Class I ו-Class II (MHC I ו-MHC II) ומציגים אותם על הממברנות שלהם לתחול תאי T נאיביים בלעדיים (תאי CD8+ ו-CD4+ T, בהתאמה)5. תאים דנדריטיים עוקבים גורמים להתבגרותם על ידי אינדוקציה של ביטוי הסמנים הממריצים המשותפים CD80 / CD86 ו- CD40 ו- MHC-II ונודדים מרקמות היקפיות לאיברי לימפה משניים עם זיהוי אנטיגנים זרים, ומעמיסים אותם לתחול תאי T נאיבייםבלעדיים 6. לפיכך, המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לחקור את התקשורת בין טפיל הלמינת'ס למארח בצורה מציאותית, לנתח את האריזה והאספקה של רכיבים טפיליים בצורה של sEVs, אשר, עם הגעתם לתאי החיסון המארח, משפיעים על התפתחות הזיהום והתקדמות המחלה הטפילית הכרונית.

להתייחסות לניתוח ממשק ההלמינת'ס-מארח באמצעות חקר רכבי EV יש מספר יתרונות. ראשית, הטגומנט, הכיסוי החיצוני של תולעים שטוחות, הוא מבנה ממברנה כפול המהווה נקודת מעבר עיקרית בין הטפיל לפונדקאי שלו, ומאפשר ל-sEVs להיווצר בקלות או לחלחל ממבנה זה7. שנית, sEVs עמוסים מאוד באנטיגנים חלבונים מכל שלבי מחזור החיים של הטפיל, המייצגים את הדרך הטבעית שבה מערכת החיסון המארחת דוגמת אנטיגנים במהלך הדבקה בתולעים 8,9. בשל ייצורם הביולוגי, קלות הטיהור (ללא צורך בהפרעה ברקמות או פיצול חלבון), ואינטראקציה ישירה עם תאים מארחים, הלמינת'ס sEVs מאפשרים פיתוח של ניסויים במבחנה כדי לדמות את תנאי האינטראקציה בין הטפיל למארח. לבסוף, sEVs מייצגים את האפשרות של מבנים טפיליים שיכולים להיות פגוציטוזיים או מופנמים על ידי תאים מארחים, ולהתגבר על חוסר האפשרות לעשות זאת עם טפילים שלמים, במיוחד במקרים של תולעים ציסטות.

בהתחשב ביתרונות שהוזכרו ובעובדה שהלמינתיאזות הן מחלות שכיחות ובדרך כלל כרוניות שבהן טפילים ככל הנראה מתמרנים את מערכת החיסון המארחת כאסטרטגיית הישרדות, הבידוד של EVs שמקורם בטפילים ומחקרם באינטראקציה עם תאים דנדריטיים מספקים מסגרת רבת ערך לחקר אימונומודולציה זו10. במובן זה, תואר כי הפנמת EVs מהלמינת'ס, כולל נמטודות ופלטיהלמינת'ס כגון Schistosoma mansoni, Fasciola hepatica, Brugia malayi ו-E. granulosus, גורמת להתבגרות והפעלה של תאים דנדריטיים 9,11,12,13,14,15.

הבידוד של EVs שמקורם בהלמינת'ס לא רק מאפשר חקר אינטראקציות אימונולוגיות, מה שעשוי להוביל לפיתוח חיסונים מגנים או תרופות אימונותרפיות למחלות אלרגיות או אוטואימוניות, אלא גם מקל על חקר אינטראקציות ותפקודים ביולוגיים אחרים 8,16,17. בהקשר זה, EVs, הממלאים תפקיד בהיסטוריה הטבעית של זיהומים טפיליים, יכולים לשמש לחקירת התפתחות טפילים ואינטראקציות עם תאים מארחים ספציפיים. יתר על כן, יכולים להיות להם יישומים פוטנציאליים כסמנים ביולוגיים מוקדמים או דיפרנציאליים לאבחון מחלות טפיליות, ניטור תגובות טיפוליות ותרומה לבקרה וניהול של זיהומים טפיליים17,18.

בנוסף, כפי שהודגם בעבר, שלב הזחל של E. granulosus רגיש לשינויים בריכוז הסידן הציטוזולי, אשר מלבד מילוי תפקיד בכדאיות הטפילים, שולט גם בקצב האקסוציטוזיס19,20. בהקשר זה, והידיעה שעליית סידן תוך תאית משפרת את שחרור ה-EV, שימוש במשפר סידן תוך-תאי כלופרמיד יכול להיות אסטרטגיה מכרעת להגדלת מספר הרכבים החשמליים. גישה זו מעניינת במיוחד עבור מערכות סלולריות הדורשות מאוכלוסיות גדולות לייצר כמות מספקת של רכבים חשמליים למטען וניתוח פונקציונלי 11,21,22. הפרוטוקול הנוכחי (איור 1) מפרט את השיטות להשגת תרביות טהורות של שלב הזחל E. granulosus ואת התנאים המשפרים את ייצור ה-sEV. הוא גם מתאר את זרימת העבודה לבידוד ואפיון של שלפוחיות אלה, כמו גם את קליטתן על ידי תאים דנדריטיים של עכברים, שלב חיוני במחקר הראשוני של אפנון מערכת החיסון המארח.

Protocol

כל ההליכים הנוגעים לבעלי חיים הוערכו ואושרו על ידי ועדת הניסויים בבעלי חיים של הפקולטה למדעים מדויקים ומדעי הטבע, מאר דל פלאטה (מספרי היתרים: RD544-2020; RD624-625-2021; RD80-2022). בפרוטוקול זה, עכברים הומתו בהמתת חסד, על פי "מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה" שפורסם על ידי ה-NIH וההנחיות של שירות הבריאות הלאומי ואיכות המזון (SENASA).

1. טיפוח שלב הזחל של Echinococcus

הערה: כל ההליכים בוצעו בתנאים אספטיים.

  1. E. granulosus protoscoleces obtention
    1. שאפו עם מחט 21 גרם ומזרק 10 מ"ל חלק מנוזל הידטיד מהריאה או הכבד של בקר נגוע כדי להפחית את טורגור הציסטה (איור 2A).
      הערה: ריאות וכבדים נגועים מגיעים מבקר שהובא לשחיטה שגרתית בבית המטבחיים. יש לשמור אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולעבד אותם תוך 24 שעות מרגע השחיטה.
    2. פתח את הציסטה במספריים והסר את השכבות הלמינריות והנבט מהציסטה בעזרת מלקחיים. הניחו אותם על צלחת פטרי סטרילית, יחד עם כל נוזל הידטיד שנותר (איור 2B,C).
      הערה: בשלב זה, מומלץ להתבונן בצלחת פטרי תחת מיקרוסקופ הפוך כדי להעריך את איכות הפרוטוסקולסים וכמוסות הגידול. הימנע מאיגום החומר הביולוגי מציסטות עם יותר מ-50% מהפרוטוסקולקים שהתמוטטו, המזוהים על ידי הסומה המכווצת שלהם, צבע כהה יותר ורוסטלום לא מאורגן עם אובדן ווים.
    3. שטפו את השכבות בתמיסת מלח סטרילית עם פוספט (PBS) בתוספת אנטיביוטיקה (100 מיקרוגרם/מ"ל פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 100 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין 100 מיקרוגרם/מ"ל) כדי להסיר את הפרוטוסקולצים.
      הערה: כל השטיפות יבוצעו עם PBS בתוספת אנטיביוטיקה.
    4. העבירו את מתלה הפרוטוסקולקס לצינור חאן זכוכית סטרילי באמצעות פיפטה פסטר.
    5. שטפו את הפרוטוסקולסים בתוספת PBS ב-4 מעלות צלזיוס באמצעות פיפטה של פסטר להסרת טפילים מתים. השהה במרץ את המתלים כדי לשבור את קפסולות הגידול ולהקל על שחרור הפרוטוסקולקס. אפשר לפרוטוסקולסים להתיישב במשך 1-2 דקות בתחתית הצינור; לאחר מכן השליכו את הסופרנטנט המכיל את הפרוטוסקולסים המתים.
      הערה: בשל הבדל בצפיפות, פרוטוסקולסים חיים מתיישבים מהר יותר מטפילים מתים.
    6. חזור על תהליך הכביסה עד להסרת כל הפרוטוסקולקים המתים והצפים.
      הערה: הטפילים המתים מוסרים כאשר כולם מתיישבים באותו קצב.
    7. קבע את הכדאיות של פרוטוסקולקים באמצעות מבחן אי הכללת מתילן.
      1. השעו מחדש את הפרוטוסקולסים השטופים בעזרת פיפטה והניחו טיפה על מגלשה. מוסיפים טיפה של 0.1 מ"ג/מ"ל מתילן כחול ומכסים בכיסוי. המתן 2-3 דקות והתבונן במיקרוסקופ.
      2. ספרו את המספר הכולל של פרוטוסקולסים חיים (לא מוכתמים) ומתים (מוכתמים בכחול), וחשבו את אחוז הפרוטוסקולסים ברי קיימא (איור 2D והוכנס).
        הערה: הכדאיות של פרוטוסקולקים צריכה להיות בסביבות 98% לפני הקמת התרבויות. זמן הצביעה לא יעלה על 10 דקות, מכיוון שמשכי זמן ארוכים יותר עלולים לגרום להכתמה של טפילים חיים.
  2. E. granulosus metacestodes obtention
    1. לייצר מחלת הידטיד משנית ניסיונית על ידי הדבקה תוך-צפקית של עכברי CF1 נקבות (משקל גוף 25 ± 5 גרם) עם 1500 פרוטוסקולקים (שווה ערך ל-10 מיקרוליטר של גלולת הפרוטוקלס) תלויים ב-0.5 מ"ל של PBS בתוספת (איור 2E).
      הערה: מומלץ לשמור על הפרוטוסקולסים ב-PBS בתוספת אנטיביוטיקה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות או בתרבית במשך 3-5 ימים לפני ההדבקה.
    2. מטצסטודות מתפתחות תוך 4-6 חודשים לאחר ההדבקה (איור 2F). במהלך תקופה זו, יש לשכן את בעלי החיים בתנאי מעבדה מבוקרים (טמפרטורה 20 ± 1 מעלות צלזיוס, מחזור אור/חושך של 12 שעות, ומים ומזון מסופקים אד ליביטום). לאחר התפתחות הציסטות, יש להרדים את העכברים באמצעות קטמין-קסילזין (50 מ"ג/ק"ג/עכבר-5 מ"ג/ק"ג/עכבר) ולהמית אותם על ידי פריקת צוואר הרחם.
    3. נקה את פני הגחון של העכבר עם 70% אלכוהול ופתח בניתוח את חלל הצפק כדי להסיר את המטצטודות שפותחו באמצעות מספריים ומלקחיים.
    4. מעבירים את מסות המטצטודות לצלחת פטרי סטרילית.
      הערה: מסות המטצסטודה מורכבות מציסטות פנימיות מרובות המוקפות ברקמת חיבור.
    5. שחרר את הציסטות מהמוני המטצסטודות על ידי הסרה זהירה של רקמת החיבור המכסה את המטצסטודות באמצעות מלקחיים במידת הצורך.
      הערה: שלב זה מבטיח שהטפילים נקיים מרקמת המארח.
    6. שטפו את המטצטודות שהתקבלו עם PBS בתוספת ב-4 מעלות צלזיוס (איור 2G).
  3. E. granulosus protoscoleces וגידול metacestodes
    1. הכן את מדיום התרבית באופן הבא: הוסף 100 מיקרוגרם/מ"ל פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 100 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין, 4 מ"ג/מ"ל גלוקוז, 50 מ"מ מאגר הפס pH 7.5 ובינוני 199 כדי להגיע לנפח הסופי הרצוי ולערבב בעדינות על ידי היפוך.
    2. מעבירים 5 מ"ל ממצע התרבית המוכן לכל צינור לייטון (איור 2H-I).
    3. מוסיפים את הטפילים למדיום התרבות ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים מבלי לשנות את המדיום. דגרו את צינורות לייטון בזווית של 15° כדי להבטיח פיזור אחיד של החומר הביולוגי על פני המשטח השטוח. זה ממקסם את חשיפת הטפילים למדיום התרבית תוך מניעת מגע עם פקק הגומי.
      הערה: הוסף 9,000-10,000 פרוטוסקולקים או 50 מטצטודות (עם קוטר שנע בין 5 מ"מ ל-15 מ"מ המופצים כ-10 ציסטות לכל צינור).
    4. לחלופין, הוסף 20 מיקרומטר לופרמיד (ריכוז תת-קטלני) מומס בדימתיל סולפוקסיד למשך 16-24 שעות למדיום תרבית הטפיל כדי להעלות את רמת הסידן הציטוזולי ולשפר את שחרור ה-EV בשלב הזחל של E. granulosus.
      הערה: בהתחשב בכך שעלייה בריכוזי הסידן התוך-תאיים משפרת את ייצור ה-EV, טיפול בטפיל בתרכובות המשפיעות על הומאוסטזיס סידן יעלה את שחרור ה-EV.

2. טיהור שלפוחיות חוץ-תאיות

  1. אוספים את מדיום תרבית הטפילים מכל צינור לייטון ומעבירים אותו לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
    הערה: ניתן לאחסן את מדיום התרבות במשך 24 שעות לפני הצנטריפוגה הראשונה עם השפעה מינימלית על ריכוז או התפלגות הגודל של השלפוחית. ניתן לשטוף פרוטוסקולסים שלוש פעמים עם מאגר PBS, לקצור ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס בצינורות של 1.5 מ"ל.
  2. צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והעבירו את הסופרנטנט לצינור חרוטי חדש של 15 מ"ל באמצעות פיפטה.
    הערה: שלב זה מסיר אבות ערך מתים. לאחר כל שלב צנטריפוגה, ודא שלפחות 0.5 ס"מ של סופרנטנט נשאר מעל הגלולה כדי למנוע זיהום.
  3. צנטריפוגה את הסופרנטנט ב-2,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והעבירו אותו לצינורות חדשים של 1.5 מ"ל באמצעות פיפטה.
    הערה: שלב זה מסיר פסולת תאים גדולה יותר.
  4. צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס להסרת פסולת תאים קטנה יותר.
  5. העבירו את הסופרנטנט לצינור המתאים לרוטור האולטרה-צנטריפוגה באמצעות פיפטה. סמן צד אחד של כל צינור בטוש לפני שמכניסים אותו לרוטור האולטרה-צנטריפוגה. לאחר מכן, הנח את הצינור ברוטור כשהצד המסומן פונה כלפי מעלה.
    הערה: הסימן משמש כנקודת התייחסות לאיתור הגלולה לאחר אולטרה-צנטריפוגה. הצינורות חייבים להיות מלאים בשלושת רבעי ומאוזנים במדויק; לכן, במידת הצורך, הוסף PBS. אם נפח ה-supernatant עולה על הקיבולת של צינור בודד, חלקו את הדגימות למספר צינורות ושלבו אותן במהלך ההשעיה מחדש.
  6. צנטריפוגה ב-100,000 x גרם למשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס ושפכו את הסופרנטנט בפעולה מהירה. הניחו לצינור לנוח הפוך למשך דקה אחת. ייתכן שהגלולה לא תהיה גלויה בשלב זה.
    הערה: גורם ה-k עבור הרוטור המשמש הוא 103.
  7. שטפו את הגלולה עם לפחות 3 מ"ל PBS כדי להסיר חלבונים מזהמים. השעו מחדש את הגלולה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים מהצד העליון של הצינור לתחתית בכל פני הצינור, אך בעיקר בצד המסומן שבו הגלולה צפויה להיות.
    הערה: אם רלוונטי, אסוף את הגלולה המושעה שמקורה באותו סופרנטנט לצינור יחיד.
  8. צנטריפוגה ב-100,000 x גרם למשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס ושפכו את הסופרנטנט בפעולה מהירה. הניחו לצינור לנוח הפוך למשך דקה אחת.
    הערה: גורם ה-k עבור הרוטור המשמש הוא 103.
  9. השעו מחדש את הגלולה ב-30 מיקרוליטר של PBS בהתאם לתהליך המתואר בשלב 2.7.
    הערה: בשלב זה, מומלץ למדוד את ריכוז החלבון הכולל בגלולה המרחפת כדי להעריך את כמות ה-sEVs המופרשים. ניתן לקבוע את ריכוז החלבון על ידי מדידת ספיגה ב-280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח.
  10. העבירו את הדגימה לצינור של 1.5 מ"ל. הקפיאו את השלפוחיות החוץ-תאיות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    הערה: כדי לשמור על שלמות השלפוחית עבור יישומים במורד הזרם, הקפיא את הגלולה המושעה במהירות האפשרית והימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים.

3. אפיון השלפוחיות המבודדות

  1. קביעת גודל EV באמצעות פיזור אור דינמי (DLS)
    הערה: פיזור אור דינמי הוא שיטה אמינה ורגישה להערכת הגודל (בהתבסס על הרדיוס ההידרודינמי, Rh) וצורתם של ננו-חלקיקים בנוזלים מורכבים, ללא קשר לסוגם. מדידות פוטנציאל DLS ו-zeta בוצעו באמצעות קרן לייזר מונוכרומטית He-Ne ב-633 ננומטר. אם הניתוח אינו אפשרי ביום הדגימה, ניתן להקפיא את הדגימות במאגר מסונן מראש לפני האחסון.
    1. הפשירו את הדגימות ושמרו אותן על קרח עד לביצוע המדידות.
      הערה: הקפאת הדגימות עלולה להשפיע על התפלגות החלקיקים ושלמות ה-sEVs. לכן, הימנע ממחזורי הקפאה והפשרה, מכיוון שהם עלולים להוביל לירידה באות LS עם גבהי שיא מופחתים.
    2. סנן את הדגימות המימיות המשמשות ל-DLS דרך מסנן בגודל נקבוביות של 0.2 מיקרומטר.
      הערה: בניסויי LS, חיוני לסנן את כל התמיסות, המאגרים והדגימות המימיות כדי להסיר חלקיקים גדולים ואבק, שעלולים להפריע למדידות.
    3. מדללים את הדגימות 1:10 עד 1:50 ב-PBS מסוננים מראש.
    4. מערבבים את הדגימות בהיפוך עדין לפני כל מדידה כדי למנוע שקיעה, מכיוון שעוצמת ה-LS יכולה לרדת עקב זמן עיבוד דגימה ארוך יותר.
    5. הוסף 1 מ"ל מהדגימה לקובטה נקייה, ומקם את הצד הלא חלבי בנתיב הלייזר משמאל לתוך המכשיר. סגור את המכסה ואפשר 2-3 דקות לשיווי משקל לפני מדידת הדגימה.
    6. מדוד את הגודל במונחים של הרדיוס ההידרודינמי (Rh) לפני ביצוע מדידת פוטנציאל הזטה. הקלט מדידות בזווית פיזור בודדת (θ = 90° עד 150°) ב-25°C ±-1°C.
    7. לחץ על לוח הבקרה כדי לבדוק את הקריאות ולהתחיל ברכישת נתונים.
      הערה: בהתבסס על ערכי ה-Rh הממוצעים והתפלגות הגודל המוערכת עבור רכבי sEV, יש לצפות בשיא בין 30 ננומטר ל-200 ננומטר (איור 3). שיאים מתחת ל-15 ננומטר ב-Rh מיוחסים לחומצות גרעין וחלבונים בתרחיף. בדרך כלל, התפלגות הגודל מחושבת מהרדיוס ההידרודינמי הממוצע. עם זאת, ניתן לדווח גם על ממוצע Z (גודל החלקיקים הממוצע במדגם), מדד הפוליפיזוריות (PDI, הקובע את הטרוגניות הגודל של דגימה) והתלות הזוויתית של עוצמת האור המפוזר.
  2. קביעת מבנה וגודל חלקיקים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה (TEM)
    הערה: בצע מיקרוסקופ אלקטרונים עם כתמים שליליים כדי להעריך את הגודל, המבנה והטוהר של רכבי sEV, תוך שימוש בפרוטוקול סטנדרטי הכולל קיבוע, התייבשות, הטמעת שרף וניגודיות עבור תכשירי sEV בהרכבה שלמה.
    1. הפשירו את דגימות ה-sEV המרוכזות משלב 2.10 ושמרו אותן על קרח.
    2. תקן sEVs בצינורות של 1.5 מ"ל. יש למרוח בזהירות 5-10 מיקרוליטר של 2.5% גלוטראלדהיד במאגר נתרן קקודילאט של 0.1 M (pH 7) עד ~5 מיקרוליטר של גלולת דגימת sEV (ריכוז sEV נדרש ≈ 1 x 108–1 x 109 מ"ל-1) ולדגור למשך שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניתן לאחסן sEVs עד שבוע ב-4 מעלות צלזיוס במאגר נתרן קקודילאט של 0.1 M לפני עיבוד נוסף. לכן, אם נדרשים שירותים טכניים חיצוניים לניתוח TEM, שלח את דגימות ה-sEV הקבועות בקירור בצינורות של 1.5 מ"ל.
    3. הפקידו 5 מיקרוליטר מהכדורים התלויים על רשתות הנחושת EM המצופות בפחמן Formvar בעלות 300 רשתות. הכן שתיים או שלוש רשתות לכל דגימה.
    4. אפשר לדגימה לספוג למשך 20 דקות בסביבה יבשה והסר עודפי דגימה מהרשת באמצעות נייר סינון.
    5. מניחים טיפות של 100 מיקרוליטר PBS על דף סרט. בעזרת מלקחיים נקיים, העבירו את הרשתות (כשצד הדגימה הנספג כלפי מטה) לטיפות PBS לשטיפה.
    6. יבש את הצד הנגדי של הדגימה הנספחת, וודא שצד הדגימה של הרשתות לא יתייבש באף אחד מהשלבים הבאים.
      הערה: עבור כל השלבים הבאים, הניחו טיפות של ריאגנטים על סרט שטוח והעבירו את הרשתות לטיפות באמצעות מלקחיים.
    7. העבירו את הרשתות לירידה של 50 מיקרוליטר של 1% גלוטראלדהיד למשך 5 דקות.
    8. שוטפים את הרשתות עם טיפה של 100 מיקרוליטר מים מזוקקים ונותנים להם לעמוד במשך 3 דקות. חזור על הפעולה תשע פעמים בסך הכל עשר כביסות.
    9. בניגוד לרשתות הדגימה עם טיפה של 50 מיקרוליטר של 1% w/v תמיסת אורניל-אצטט, pH 7, למשך דקה אחת.
    10. ניגוד והטמע את הרשתות בתערובת של 100 מיקרוליטר של 4% אורניל אצטט ו-900 מיקרוליטר של 2% מתיל צלולוז.
    11. יבש את הרשתות באוויר במשך 5-10 דקות בזמן שהן נשארות על הלולאה, והתבונן בהן במיקרוסקופ אלקטרונים במהירות 80-100 קילו וולט ברזולוציה של 0.2 ננומטר והגדלה של פי 100,000.
    12. אחסן את הרשתות בקופסאות אחסון יבשות לאחסון לטווח הארוך.

4. יצירת תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם

הערה: הליך זה צריך להתבצע באמצעות עכברים צעירים, המאופיינים במערכות המטופויאטיות חזקות עם יכולות התפשטות והתמיינות פעילות. לעומת זאת, עכברים מבוגרים מציגים ירידה בתפקוד ההמטופואטיים, עתודות תאי גזע מופחתות, אינטראקציות נישה משתנות ומאגר זיכרון מפותח יותר שהוא חיוני לחסינות ארוכת טווח ולתגובה לפתוגנים או לשינויים הקשורים לגיל כגון הזדקנות חיסונית.

  1. המתת חסד של נקבת עכבר CF-1 בת 5-8 שבועות בהתאם להנחיות אתיות מוסדיות, תוך מזעור סבלם של בעלי חיים.
  2. רססו את העכבר באתנול לפני שמכניסים אותו למכסה המנוע של תרבית רקמות.
    הערה: יש לבצע את השלבים הבאים בתנאים סטריליים.
  3. הנח את העכבר על לוח חיתוך במצב שכיבה. בעזרת מלקחיים ומספריים מנתחים יש לבצע חתך "T" אנכי מעל השופכה ולהאריך אותו אופקית לחלק העליון של הגפיים התחתונות, תוך הקפדה לא לשבור את הצפק או לנקב איברים כלשהם, במיוחד את המעיים.
  4. הפרד את העור לאורך שתי הגפיים האחוריות כדי לחשוף את עצמות הרגליים והרקמות באמצעות מלקחיים. בעזרת הידיים, הסר את העור של כל רגל הדוחפת מהקרסול לכיוון הבטן, ומושך את העור לצד הנגדי. שתי הרגליים יהיו אז נקיות מעור.
    הערה: השלך את גוף העכבר בשקית שאריות הפתוגן.
  5. בעזרת מספריים ומלקחיים, הסר בזהירות את עצם הירך והשוקה, הימנע משבירה. מהדקים את קצה כל עצם בעזרת מלקחיים וחתוך גידים כדי להסיר פאסיות שרירים סביב העצמות. ניקוי מלא של רקמת השריר במפיות נייר.
  6. כאשר כל עצם מוסרת, יש להניח אותה בשפופרת סטרילית של 50 מ"ל המכילה 2 מ"ל של מדיום שלם שהוכן עם מדיום RPMI בתוספת 5% FBS, 100 U/ml פניצילין, 100 U/mL סטרפטומיצין ו-10 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין להסרת פסולת. לאחר מכן, שאפו והשליכו את מדיום התרבית ושטפו את העצמות פעמיים עם 70% אתנול למשך 5 דקות.
  7. מעבירים את העצמות לצלחת פטרי סטרילית.
  8. חותכים את שתי אפיפיזות העצם בעזרת מספריים מנתחים חדים כדי לגשת לתאי מח העצם.
  9. שטפו בזהירות תאי מח עצם מכל אחת מארבע העצמות לצלחת פטרי סטרילית באמצעות מחט 25 גרם המחוברת למזרק של 20 מ"ל המכיל מדיום שלם. העצמות יהפכו שקופות יותר עם מיצוי מח העצם.
    הערה: נפח של 20 מ"ל של המדיום השלם אמור להספיק כדי לנטרל את תאי מח העצם משני עצם הירך והשוקה.
  10. הומוגניזציה עדינה של המדיום עם המח המנופח על ידי פיפטינג להסרת רקמת חיבור עצם וגושי תאים. לאחר מכן, העבירו את הדגימה לצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל, והעבירו את התאים דרך מסננת תאי פוליפרופילן סטרילית של 70 מיקרומטר כדי להסיר רקמת חיבור ופסולת עצם.
  11. צנטריפוגה את התאים ב-450 x גרם למשך 7 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הסר והשליך בזהירות את הסופרנטנט, וודא שהגלולה נשארת דבוקה לדופן הצינור.
  12. דגרו על התאים למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן השעו אותם מחדש ב-500 מיקרוליטר של מאגר ליזה של כדוריות דם אדומות (RBC). נטרל את מאגר הליזיס על ידי הוספת 3 מ"ל של מדיום שלם.
  13. צנטריפוגה את התאים ב-450 x גרם למשך 7 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-5 מ"ל של מדיום שלם.
  14. העבירו את תרחיף התאים דרך מסננת תאי פוליפרופילן סטרילית של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל כדי להסיר אגרגטים של תאים מאריתרוציטים ליזים.
  15. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר.
  16. הוסף 300 ננוגרם/מ"ל של טירוזין קינאז 3 ליגנד הקשור לעכבר רקומביננטי Fms (Flt3L) למדיום התרבית.
  17. צלחת התאים בריכוז של 1 x 106 תאים/מ"ל בצלחת מרובת בארות.
  18. דגרו על התאים במשך 7 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה עם 5% CO2.
    הערה: הימנע מטלטול התאים בזמן שהם מתמיינים וגדלים כדי למנוע התבגרות ספונטנית.
  19. ביום השלישי, הסר 1 מ"ל של מדיום מכל באר (הימנע מהפרעה לתאים) והחלף אותו ב-1 מ"ל של מדיום שלם טרי שחומם מראש בתוספת 150 ננוגרם/מ"ל עכברי רקומביננטי Flt3L.

5. אינטראקציה בין תאים דנדריטיים שמקורם במח עצם ושלפוחיות חוץ-תאיות מ- E. granulosus

  1. צביעת קרום שלפוחית חוץ-תאית
    1. הפשירו את רכבי ה-sEV המאוחסנים בשלב 2.10 ושמרו אותם על קרח.
    2. השעו מחדש 10 מיקרוליטר של רכבי sEV מטוהרים ב-10 מיקרוליטר של רכב תיוג (מדלל C).
    3. הוסף 20 μL של תמיסת צבע 2x PKH26 כדי להשיג ריכוז סופי של 2 μM. יש לערבב בעדינות בעזרת פיפטה ולדגור במשך 35 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך.
      הערה: יש להכין את תמיסת הצבע 2x PKH26 (4 מיקרומטר) מיד לפני הצביעה על ידי הוספת 0.5 מיקרוליטר של תמיסת צבע אתנולית PKH26 ל-125 מיקרוליטר של מדלל C.
    4. מערבבים בעדינות כל 3-5 דקות במהלך הדגירה כדי להבטיח צביעה הומוגנית.
    5. הוסף 40 מיקרוליטר של BSA 1% ודגירה למשך 10 דקות ב-RT כדי לעצור את תהליך הצביעה.
    6. שטפו את ה-sEVs עם 1 מ"ל PBS וצנטריפוגה ב-100,000 x גרם למשך שעה ב-4 מעלות צלזיוס כדי להסיר עודפי צבע.
      הערה: גורם ה-k עבור הרוטור הוא 103.
    7. השעו מחדש את הגלולה ב-90 מיקרוליטר של PBS בהתאם לפרוטוקול המתואר בשלב 2.7.
  2. גירוי של תאים דנדריטיים שמקורם במח עכברים עם שלפוחיות חוץ-תאיות של E. granulosus
    1. קצור תאים דנדריטיים שמקורם במח עצם (BMDCs) היטב מצלחת התרבות והעביר אותם לצינורות של 1.5 מ"ל.
      הערה: טפל בזהירות כדי למנוע התבגרות תאים ספונטנית.
    2. צנטריפוגה את המדיום ב-450 x גרם למשך 5 דקות כדי לגלול את התאים.
      הערה: שמור את הסופרנטנטים מהצנטריפוגה כדי לצבוע מחדש את התאים בשלבי ניתוח ציטומטריית הזרימה הבאים.
    3. השעו מחדש BMDCs ב-30 מיקרוליטר של sEVs לא מוכתמים משלב 2.10 לניתוח ציטומטריית זרימה או ב-90 מיקרוליטר של sEVs מוכתמים המכילים PBS משלב 5.1.7. למיקרוסקופיה קונפוקלית. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה עם 5% CO2. מערבבים בעדינות את הדגימה כל 10 דקות.
      הערה: כדי להבטיח מגע יעיל בין BMDCs ל-sEVs, יש לבצע את 30 הדקות הראשונות של הדגירה בנפח מינימלי באמצעות צינורות של 1.5 מ"ל.
    4. למיקרוסקופיה קונפוקלית, העבירו את התאים לכיסוי זכוכית מטופל בכחול אלצ'יאני (קוטר 12 מ"מ) המונח בצלחת של 24 בארות. יש לדגור למשך 30 דקות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתא לח עם 5%CO2.
      הערה: הטיפול האלציאני-כחול מעניק מטען חיובי לכיסוי, ומקל על היצמדות ממברנות הפלזמה הטעונות שלילית של BMDCs.
      1. להכנת הכיסויים, טבלו אותם בצבע כחול אלסיאני 8 GX מסונן 1% וחממו אותם במיקרוגל למשך 1-2 דקות ללא רתיחה. דגרו אותם בתמיסה החמה למשך 10 דקות, ומערבבים כל 2 עד 3 דקות.
      2. לאחר מכן, שטפו את הכיסויים במים מזוקקים דה-יונים כדי להסיר עודפי כחול אלציאני, וייבשו אותם על מגבות נייר. לבסוף, יש לבצע חיטוי של הכיסויים ולאחסן אותם בתנאים סטריליים עד לשימוש.
    5. לניתוח זרימה ציטומטרית, העבירו את ה-BMDCs-sEVs בחזרה לאותה באר ממנה הם נאספו (ראה שלב 5.2.1), הוסיפו את הסופרנטנטים השמורים משלב 5.2.2 ודגרו במשך 18 שעות ב-37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה עם 5% CO2.
      הערה: השאירו כ-500 מיקרוליטר של מדיום בבאר כדי למנוע ייבוש של התאים הנותרים לאחר האיסוף.
    6. השתמש בבקרות חיוביות ושליליות כדי להעריך את הבשלת BMDC. עורר את התאים עם 100 ננוגרם/מ"ל של ליפופוליסכריד (LPS) למשך 18 שעות כבקרה חיובית. לבקרה שלילית של אנדוציטוזיס, דגרו BMDCs עם sEVs ב-4 מעלות צלזיוס. כמו כן, כלול בקרת תאים דנדריטיים לא מגורה.
  3. מיקרוסקופיה קונפוקלית של שלפוחיות חוץ-תאיות מ- E. granulosus שנלכדו והופנמו על ידי תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם.
    1. לאחר השלמת תקופת הדגירה המתוארת בשלב 5.2.4, שאפו והשליכו את ה-PBS מתלוש הכיסוי.
    2. תקן BMDCs על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד (PFA) מעל החלקת הכיסוי ודגירה למשך 10 דקות ב-RT.
      הערה: ודא שהנפח שומר על מתח הפנים על הכיסוי.
    3. שאפו והשליכו את ה-PFA, ולאחר מכן שטפו את הכיסוי שלוש פעמים עם PBS-BSA 2%.
    4. הוסף 100 מיקרוליטר של PBS המכיל נוגדן אנטי-MHC Class II-FITC מדולל 1/100 ודגירה למשך שעה ב-RT בחושך.
    5. שאפו והשליכו את תמיסת הנוגדנים, ושטפו את הכיסוי שלוש פעמים עם PBS-BSA 2%.
    6. הוסיפו 100 מיקרוליטר של 50 ננוגרם/מ"ל DAPI ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בתא רטוב כדי להכתים גרעינים.
    7. שאפו והשליכו את תמיסת הצבע ושטפו את הכיסוי שלוש פעמים עם PBS-BSA 2%.
    8. הסר את כיסוי הכיסוי באמצעות מלקחיים מעוקלים דקים וייבש אותו על מגבת נייר כדי למנוע עודפי נוזלים.
    9. התקן את הכיסוי עם הפנים כלפי מטה על מגלשת זכוכית באמצעות מדיום הרכבה המורכב מאלכוהול פוליוויניל וגליצרול. יש להניח לייבוש במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס או למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך.
    10. הסר את כל בועות האוויר בין הכיסוי למגלשת הזכוכית על ידי לחיצה עדינה כלפי מטה על הכיסוי בעזרת מלקחיים.
    11. התבונן בדגימות המותקנות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות מטרת טבילת שמן פי 60 עם אורך גל עירור/פליטה של 485/538 ננומטר עבור FITC, 358/461 ננומטר עבור DAPI ו-551/567 ננומטר עבור PKH26.
  4. הערכה פנוטיפית של תאים דנדריטיים שמקורם במח עצם מגורה שלפוחית חוץ-תאית על ידי ציטומטריית זרימה
    1. לאחר תקופת הדגירה המתוארת בשלב 5.2.5, קצרו BMDCs על ידי שטיפת המדיום למעלה ולמטה מספר פעמים בעזרת פיפטה.
    2. אסוף את ה-BMDCs המכילים מדיום והנח אותו בצינורות של 1.5 מ"ל.
    3. צנטריפוגה ב-450 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לגלול את התאים.
      הערה: לחלופין, כדי לנתח הפרשת ציטוקינים, הסר את הסופרנטנטים בעזרת פיפטה, העבר אותם לצינורות חדשים של 1.5 מ"ל ואחסן אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לבדיקות נוספות של בדיקת אימונוסורבנט מקושר לאנזים (ELISA).
    4. השעו מחדש את ה-BMDCs ב-100 מיקרוליטר של PBS המכילים פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC), אלופיקוציאנין (APC), או mAbs מצומדים לפיקואריתרין המכוונים ל-CD11c, CD40, CD80, CD86, MHC Class I ו-MHC Class II ודגירה למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס בחושך.
    5. שטפו את ה-BMDCs עם PBS וצנטריפוגה ב-450 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    6. השהה מחדש BMDCs ב-500 מיקרוליטר של 1% PFA כדי לתקן אותם ולאחסן אותם ב-4 מעלות צלזיוס עד לרכישה בציטומטר זרימה.

תוצאות

תרשים זרימה המסכם את השלבים העיקריים לשמירה על תרביות טהורות של שלב הזחל E. granulosus , בידוד ואפיון של sEVs וקליטתם על ידי תאים דנדריטיים של עכברים מוצג באיור 1. כדי להשיג ייצור sEV גבוה מפרוטוסקולסים ומטאצסטודות, נעשה שימוש בשיטת תרבית חוץ גופית ש?...

Discussion

זרימת העבודה של הפרוטוקול לתרבית טפילים, בידוד sEVs שמקורם בטפילים, הבחנה בין תאים דנדריטיים למח העצם וניתוח ספיגת sEV על ידי תאים אלה מתוארת באיור 1. המטרה הייתה לתאר בפירוט כל סעיף בפרוטוקול שניתן לבצע בשלמותו או בנפרד, תוך הדגשת השיקולים העיקריים להבטחת י?...

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

המחברים מודים לליק. ססיליה גוטיירס אייסטה (Servicio de Microscopía Electrónica, CONICET, Bahía Blanca, ארגנטינה) וליץ'. לאונרדו סצ'י וליק. אליאנה מאזה (INIFTA, האוניברסיטה הלאומית של לה פלטה, ארגנטינה) על הסיוע הטכני במיקרוסקופ אלקטרונים הולכה ופיזור אור דינמי, בהתאמה. אנו מודים גם לדרה. גרסיאלה סלרנו, דרה. קורינה ברון וד"ר גונזלו קאלו על השימוש באולטרה-צנטריפוגה ב-INBIOTEC-CONICET-FIBA, ארגנטינה. המחברים מודים לליק בהכרת תודה. קלי (SENASA, מאר דל פלאטה, ארגנטינה) וליקס. H. Núnez García (CONICET, האוניברסיטה הלאומית של מאר דל פלאטה, ארגנטינה) על שיתוף הפעולה שלהם בהערכת הרווחה של עכברים, ו-Med. Vet. J. Reyno, Med. Vet. S. Gonzalez, ו-Med. Vet. L. Netti על תרומתם להשגת חומר טפיל. עבודה זו, כולל עלויות הניסויים, הריאגנטים והציוד, נתמכה על ידי PICT 2020 מס' 1651 במימון ANPCyT.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL tubesHensoN14059
24-well plate JetBiofilCAP011024Polystyrene, flat bottom, Sterile
6-well plate  Henso Medical Co. Ltd.N14221Flat-shape bottom, PS material, Sterile
70 mm polypropylene cell strainerBiologix Group Limited15-1070Sterile
Alcian blue 8 GX dye Santa Cruzsc-214517B
Automatic CO2 incubatorNuarireUN-5100E/G DH
Bovine Serum AlbuminWiener lab1443151
CD11c Monoclonal antibody-PECy5   100 µgeBioscience15-0114-82clone (N418)
CD40 Monoclonal antibody-FITC 100 µgeBioscience11-0402-82clone (HM40-3)
CD80 Monoclonal antibody-APC 100 µgeBioscience17-0801-82clone (16-10A-1)
CD86 Monoclonal antibody-FITC  100 µgeBioscience11-0862-82clone (GL-1)
CentrifugeThermo ScientificIEC CL31R Multispeed
Confocal MicroscopeNikonNikon Confocal Microscope C1
Conical tubes 15 mL dia.17 x 120 mmCitotest4610-1865
DAPISigma107K4034
D-GlucoseMerk1.78343
Dimethyl Sulfoxide Anedra6646
Fetal Bovine Serum 500 mLSigma-Aldrich  12352207
Flow Cytometry SystemBD BiosciencesBD FACSCanto™ II
Folded Capillary Zeta Cell Malvern PanalyticalDTS1070
Gentamicin sulfate saltSigmaG1264
Glutaraldehyde solutionFluka49630
HepesGibco11344041
Hypodermic  needle 21 G x 1"25/8WeigaoSterile
Hypodermic  needle 25 G x 5/8"WeigaoSterile
Inverted microscope LeicaDMIL LED Fluo 
KetamineHolliday
Lipopolysaccharide  5 mgInvitrogentlrl-rslpsLPS from the Gram-negative bacteria E. coli K12 . TLR2/4 Agonists
Loperamide hydrochlorideSigma-Aldrich5.08162
Medium 199 Gibco11150059
Methylene BlueAnedra6337
MHC class I (H2kb) Monoclonal antibody-PE 100 µgeBioscience12-5958-82clone (AF6-88.5.5.3)
MHC class II (IA/IE) Monoclonal antibody-FITC  100 µgeBioscience11-5321-82clone (M5/114.15.2)
MicroscopeOlympusCX31
Mouse recombinant murine Flt3L.PrepoTech250-31L-10UG
NanodropThermo ScientificND-One
ParaformaldehydeAgar ScientificR1018
Penicillin G sodium saltSigmaP3032-10MU
PKH26Sigma-AldrichMINI26
Potassium Phosphate MonobasicTimperFor Phosphate Buffered Saline (PBS)
RBC lysis buffer 100 mLRoche11814389001
RPMI medium  1640 1x 500 mLSigma-Aldrich (Gibco)11875093
Sodium Cacodylate  Sigma-AldrichC0250
Sodium ChlorideAnedra7647-14-5For Phosphate Buffered Saline (PBS)
Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) p. a.Biopack1639.07For Phosphate Buffered Saline (PBS)
Streptomycin sulfate saltSigmaS9137
Syringe 10 mLBremenSterile
Thickwall polycarbonate tubesBeckman Coulter13 x 55 mm , nominal capacity 4 mL
Transmission Electron MicroscopeJeolJEOL JSM 100CX II
UltracentrifugeBeckmanOptima LE-80k 90 Ti rotor
XylazineRichmond
Zetasizer Nano Malvern Nano ZSizer-ZEN3600To perform Dynamic Light scattering and zeta potential measurements

References

  1. Wen, H. et al. Echinococcosis: advances in the 21st century. Clin Microbiol Rev. 32 (2), e00075-18 (2019).
  2. Geary, T. G., Thompson, D. P. Development of antiparasitic drugs in the 21st century. Vet Parasitol. 115 (2), 167–184 (2003).
  3. Drurey, C., Maizels, R. M. Helminth extracellular vesicles: Interactions with the host immune system. Mol Immunol. 137, 124–133 (2021).
  4. Welsh, J. A. et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J. Extracell Vesicles. 13 (2), e12404 (2024).
  5. Cresswell, P. Antigen processing and presentation. Immunol Rev. 207, 5–7 (2005).
  6. Buzas, E. I. The roles of extracellular vesicles in the immune system. Nat Rev Immunol. 23 (4), 236–250 (2023).
  7. Bennett, A. P. S., de la Torre-Escudero, E., Oliver, N. A. M., Huson, K. M., Robinson, M. W. The cellular and molecular origins of extracellular vesicles released by the helminth pathogen Fasciola hepatica. Int J Parasitol. 50 (9), 671–683 (2020).
  8. Drurey, C., Coakley, G., Maizels, R. M. Extracellular vesicles: new targets for vaccines against helminth parasites. Int J Parasitol. 50 (9), 623–633 (2020).
  9. Nicolao, M. C. et al. Characterization of protein cargo of Echinococcus granulosus extracellular vesicles in drug response and its influence on immune response. Parasit Vectors. 16 (1), 255 (2023).
  10. Sánchez-López, C.M., Trelis, M., Bernal, D., Marcilla, A. Overview of the interaction of helminth extracellular vesicles with the host and their potential functions and biological applications. Mol Immunol. 134, 228–235 (2021).
  11. Nicolao, M. C., Rodriguez, R. C., Cumino, A. C. Extracellular vesicles from Echinococcus granulosus larval stage: Isolation, characterization and uptake by dendritic cells. PLoS Negl Trop Dis. 13 (1), e0007032 (2019).
  12. Kuipers, M. E. et al. DC-SIGN mediated internalisation of glycosylated extracellular vesicles from Schistosoma mansoni increases activation of monocyte-derived dendritic cells. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1753420 (2020).
  13. Murphy, A. et al. Fasciola hepatica extracellular vesicles isolated from excretory-secretory products using a gravity flow method modulate dendritic cell phenotype and activity. PLoS Negl Trop Dis. 14 (9), e0008626 (2020).
  14. Ricciardi, A. et al. Extracellular vesicles released from the filarial parasite Brugia malayi downregulate the host mTOR pathway. PLoS Negl Trop Dis. 15 (1), e0008884 (2021).
  15. Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nat Protoc. 18 (5), 1462–1487 (2023).
  16. Brezgin, S. et al. Basic guide for approaching drug delivery with extracellular vesicles. Int J Mol Sci. 25 (19), 10401 (2024).
  17. Pinheiro, A. A. et al. Potential of extracellular vesicles in the pathogenesis, diagnosis, and therapy for parasitic diseases. J Extracell Vesicles. 13 (8), e12496 (2024).
  18. Barnadas-Carceller, B., Del Portillo, H. A., Fernandez-Becerra, C. Extracellular vesicles as biomarkers in parasitic disease diagnosis. Curr Top Membr. 94, 187–223 (2024).
  19. Nicolao, M. C., Denegri, G. M., Carcamo, J. G., Cumino, A. C. P-glycoprotein expression and pharmacological modulation in larval stages of Echinococcus granulosus. Parasitol Int. 63 (1), 1–8 (2014).
  20. Nicolao, M. C., Cumino, A. C. Biochemical and molecular characterization of the calcineurin in Echinococcus granulosus larval stages. Acta Trop. 146, 141–151 (2015).
  21. Savina, A., Furlan, M., Vidal, M., Colombo, M. I. Exosome release is regulated by a calcium-dependent mechanism in K562 cells. J Biol Chem. 278 (22), 20083–20090 (2003).
  22. Ambattu, L. A. et al. High frequency acoustic cell stimulation promotes exosome generation regulated by a calcium-dependent mechanism. Commun Biol. 3 (1), 553 (2020).
  23. White, R. et al. Special considerations for studies of extracellular vesicles from parasitic helminths: A community-led roadmap to increase rigour and reproducibility. J Extracell Vesicles. 12 (1), e12298 (2023).
  24. Casado, N., Rodriguez-Caabeiro, F., Hernandez, S. In vitro survival of Echinococcus granulosus protoscolices in several media, at +4 degrees C and +37 degrees C. Z Parasitenkd. 72 (2), 273–278 (1986).
  25. Casado, N., Rodriguez-Caabeiro, F., Jiménez, A., Criado, A., de Armas, C. In vitro effects of levamisole and ivermectin against Echinococcus granulosus protoscoleces. Int J Parasitol. 19 (8), 945–947 (1989).
  26. Al-Lamki, R. S., Bradley, J. R., Pober, J. S. Human organ culture: updating the approach to bridge the gap from in vitro to in vivo in inflammation, cancer, and stem cell biology. Front Med. 4, 148 (2017).
  27. Rodriguez-Caabeiro, F., Casado, N.. Evidence of in vitro germinal layer development in Echinococcus granulosus cysts. Parasitol Res.74 (6),558–562 (1988).
  28. Loos, J. A., Cumino, A. C. In vitro anti-echinococcal and metabolic effects of metformin involve activation of AMP-activated protein kinase in larval stages of Echinococcus granulosus. PLoS One. 10 (5), e0126009 (2015).
  29. Erwin, N., Serafim, M.F., He, M. Enhancing the cellular production of extracellular vesicles for developing therapeutic applications. Phar. Res. 40 (4), 833–853 (2023).
  30. Sako, Y. et al. Identification of a novel small molecule that enhances the release of extracellular vesicles with immunostimulatory potency via induction of calcium influx. ACS Chem Biol. 18 (4), 982–993 (2023).
  31. He, L.P., Mears, D., Atwater, I., Rojas, E., Cleemann, L. Loperamide mobilizes intracellular Ca2+ stores in insulin-secreting HIT-T15 cells. Br J Pharmacol. 139 (2), 351–361 (2003).
  32. Dalton, J.P., Skelly, P., Halton, D. W. Role of the tegument and gut in nutrient uptake by parasitic platyhelminths. Can J Zool. 82 (2), 211–232 (2004).
  33. Dos Santos, G. B. et al. Excretory/secretory products in the Echinococcus granulosus metacestode: is the intermediate host complacent with infection caused by the larval form of the parasite?. Int J Parasitol. 46 (13–14), 843–856 (2016).
  34. Siles-Lucas, M. et al. Isolation and characterization of exosomes derived from fertile sheep hydatid cysts. Vet Parasitol. 236, 22–33 (2017).
  35. Yang, J. et al. Identification of different extracellular vesicles in the hydatid fluid of Echinococcus granulosus and immunomodulatory effects of 110 K EVs on sheep PBMCs. Front Immunol. 12, 602717 (2021).
  36. Khosravi, M. et al. Characterisation of extracellular vesicles isolated from hydatid cyst fluid and evaluation of immunomodulatory effects on human monocytes. J Cell Mol Med. 27 (17), 2614–2625 (2023).
  37. Sotillo, J. et al. The protein and microRNA cargo of extracellular vesicles from parasitic helminths–current status and research priorities. Int J Parasitol. 50 (9), 635–645 (2020).
  38. Kuipers, M. E. et al. Optimized protocol for the isolation of extracellular vesicles from the parasitic worm Schistosoma mansoni with improved purity, concentration, and yield. J Immunol Res. 2022 (1), 5473763 (2022).
  39. Fernandez-Becerra, C. et al. Guidelines for the purification and characterization of extracellular vesicles of parasites. J Extracell Biol. 2 (10), e117 (2023).
  40. Chaiyadet, S. et al. Silencing of Opisthorchis viverrini tetraspanin gene expression results in reduced secretion of extracellular vesicles. Front Cell Infect Microbiol. 12, 827521 (2022).
  41. Théry, C. et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  42. Szatanek, R. et al. The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization. Int J Mol Sci. 18 (6), 1153 (2017).
  43. Blundell, E. L. C. J., Mayne, L. J., Billinge, E. R., Platt, M. Emergence of tunable resistive pulse sensing as a biosensor. Anal Methods. 7 (17), 7055–7066 (2015).
  44. Vucetic, A., Filho, A., Dong, G., Olivier, M. Isolation of extracellular vesicles from Leishmania spp. Methods Mol Biol. 555–574 (2020).
  45. Caputo, F. et al. Measuring particle size distribution and mass concentration of nanoplastics and microplastics: Addressing some analytical challenges in the submicron size range. J Colloid Interface Sci. 588, 401–417 (2021).
  46. Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nat Protoc. 16 (3),1548–1580 (2021).
  47. Trombetta, E. S., Mellman, I. The cell biological basis of antigen presentation in vitro and in vivo. Ann Rev Immunol. 23 (1), 975–1028 (2005).
  48. Hammer, G. E., Ma, A. Molecular control of state dendritic cell maturation and immuno homeostasis. Ann Rev Immunol. 31 (1), 743–791 (2013).
  49. Weigel, B. J. et al. Comparative analysis of murine marrow–derived dendritic cells generated by Flt3L or GM-CSF/IL-4 and matured with immune stimulatory agents on the in vivo induction of antileukemia responses. Blood. 100 (12), 4169–4176 (2002).
  50. March, N. et al. Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand. Cancer Res. 60, 3239–3246 (2000).
  51. Heath, W. R. et al. Cross-presentation, dendritic cell subsets, and the generation of immunity to cellular antigens. Immunol Rev. 199 (1), 9–26 (2004).
  52. Naik, S. et al. Cutting edge: generation of splenic CD8+ and CD8− dendritic cell equivalents in Fms-like tyrosine kinase 3 ligand bone marrow cultures. J Immunol. 174 (11), 6592–6597 (2005).
  53. Sauter, M. et al. Protocol to isolate and analyze mouse bone marrow derived dendritic cells (BMDC). STAR Protoc. 3 (3), 101664 (2022).
  54. Helft, J. et al. GM-CSF mouse bone marrow cultures comprise a heterogeneous population of CD11c(+) MHCII(+) macrophages and dendritic cells. Immunity. 42 (6), 1197–1211 (2015).
  55. Borup, A. et al. Comparison of separation methods for immunomodulatory extracellular vesicles from helminths. J Extracell Biol. 1 (5), e41 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

217Echinococcus granulosusEV

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved