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Résumé

Ici, nous décrivons les conditions de culture in vitro , l’isolement et la génération accrue de vésicules extracellulaires (VE) à partir d’Echinococcus granulosus. Les petits VE ont été caractérisés par une diffusion dynamique de la lumière et une microscopie électronique à transmission. L’absorption par les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse et leur modulation phénotypique ont été étudiées à l’aide de la microscopie confocale et de la cytométrie en flux.

Résumé

La sécrétion de vésicules extracellulaires par les cestodes est cruciale pour permettre la communication cellulaire non seulement entre les parasites, mais aussi avec les tissus de l’hôte. En particulier, les petites vésicules extracellulaires (sEV) agissent comme des nano-transporteurs transférant des antigènes naturels, qui sont essentiels à l’immunomodulation de l’hôte et à la survie du parasite. Cet article présente un protocole étape par étape pour isoler les sEVs à partir de cultures larvaires d’Echinococcus granulosus et analyse leur absorption par des cellules dendritiques obtenues à partir de moelle osseuse murine, qui acquièrent une capacité d’adhésion et de présentation de l’antigène au cours de leur maturation après une semaine de culture in vitro . Cet article fournit des informations complètes pour générer, purifier et quantifier les sEV à l’aide de l’ultracentrifugation, ainsi que des analyses parallèles de la diffusion dynamique de la lumière et de la microscopie électronique à transmission. De plus, un protocole expérimental détaillé est décrit pour isoler et cultiver des cellules de moelle osseuse de souris et conduire leur différenciation en cellules dendritiques à l’aide de Flt3L. Ces cellules dendritiques peuvent présenter des antigènes aux lymphocytes T naïfs, modulant ainsi le type de réponse immunitaire in vivo. Ainsi, des protocoles alternatifs, dont la microscopie confocale et l’analyse par cytométrie en flux, sont proposés pour vérifier le phénotype de maturation acquis des cellules dendritiques préalablement exposées aux sEVs parasites. Enfin, il convient de noter que le protocole décrit peut être appliqué dans son ensemble ou en parties individuelles pour réaliser des cultures in vitro de parasites, isoler des vésicules extracellulaires, générer des cultures de cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse et effectuer des tests d’absorption avec ces cellules.

Introduction

Echinococcus granulosus est un helminthe parasite zoonotique responsable d’une infection à long terme connue sous le nom d’échinococcose kystique1. Chez les hôtes intermédiaires, tels que le bétail et les humains, l’infection parasitaire affecte principalement le foie et les poumons, où le stade larvaire se développe sous forme de kystes remplis de liquide ou de métacestodes contenant des protoscoleces (une larve elle-même). Comme tous les cestodes, ce parasite n’a pas de système digestif ni de système excréteur et a donc développé des processus cellulaires endocytaires et exocytaires actifs pour réguler l’absorption et l’excrétion des métabolites ainsi que la libération de vésicules extracellulaires2,3. Les vésicules extracellulaires (VE) sont des particules enfermées dans des lipides bicouches sécrétées par apparemment tous les types de cellules. En particulier, les petites vésicules extracellulaires (sEV), définies comme des VE inférieures à 200 nm indépendamment de leur origine biogénique4, peuvent agir comme médiateurs immunitaires intercellulaires. Cette fonction est particulièrement importante chez les parasites, qui dépendent de l’immunomodulation de l’hôte pour assurer leur survie3. La manipulation immunitaire est réalisée par l’absorption de sEV par les cellules dendritiques de l’hôte, les seules cellules capables d’activer des cellules T naïves in vivo et d’initier une réponse immunitaire adaptative qui conduira à une infection chronique par ces vers parasites. Les cellules dendritiques, cellules présentatrices d’antigènes professionnelles du système immunitaire inné, traitent et chargent des peptides antigéniques sur le complexe majeur d’histocompatibilité de classe I et de classe II (CMH I et CMH II) et les exposent sur leurs membranes pour un amorçage exclusif des lymphocytes T naïfs (lymphocytes T CD8+ et CD4+ , respectivement)5. Les cellules dendritiques suivantes induisent leur maturation en induisant l’expression des marqueurs co-stimulateurs CD80/CD86 et CD40 et MHC-II et migrent des tissus périphériques vers les organes lymphoïdes secondaires lors de la reconnaissance d’antigènes étrangers, les chargeant pour une amorçage exclusif des lymphocytes T naïfs6. Ainsi, l’objectif global de ce protocole est d’étudier la communication helminthe-parasite-hôte de manière réaliste, en analysant l’emballage et la livraison de composants parasites sous forme de sEVs, qui, en atteignant les cellules immunitaires de l’hôte, influencent le développement de l’infection et la progression de la maladie parasitaire chronique.

Aborder l’analyse de l’interface helminthe-hôte par l’étude des sEVs présente plusieurs avantages. Tout d’abord, le tégument, l’enveloppe externe des vers plats, est une structure à double membrane qui constitue un point de passage majeur entre le parasite et son hôte, permettant aux sEVs d’être facilement générés ou imprégnés à partir de cette structure7. Deuxièmement, les sEV sont fortement chargés en antigènes protéiques à tous les stades du cycle de vie du parasite, représentant la manière naturelle par laquelle le système immunitaire de l’hôte échantillonne les antigènes pendant l’infection par le ver 8,9. En raison de leur production biologique, de leur facilité de purification (sans nécessiter de perturbation tissulaire ou de fractionnement des protéines) et de leur interaction directe avec les cellules hôtes, les helminthes sEV permettent de développer des expériences in vitro pour simuler les conditions in vivo de l’interaction parasite-hôte. Enfin, les sEVs représentent la possibilité d’avoir des structures parasites qui peuvent être phagocytées ou internalisées par les cellules hôtes, en surmontant l’impossibilité de le faire avec des parasites entiers, en particulier dans le cas de vers enkystés.

Compte tenu des avantages mentionnés et du fait que les helminthiases sont des maladies prévalentes et généralement chroniques dans lesquelles les parasites manipulent probablement le système immunitaire de l’hôte comme stratégie de survie, l’isolement des VE dérivées du parasite et leur étude en interaction avec les cellules dendritiques fournissent un cadre précieux pour explorer cette immunomodulation10. En ce sens, il a été décrit que l’internalisation des VE des helminthes, y compris les nématodes et les plathelminthes tels que Schistosoma mansoni, Fasciola hepatica, Brugia malayi et E. granulosus, induit la maturation et l’activation des cellules dendritiques 9,11,12,13,14,15.

L’isolement des VE dérivées d’helminthes permet non seulement d’étudier les interactions immunologiques, ce qui pourrait conduire au développement de vaccins protecteurs ou d’agents immunothérapeutiques pour les maladies allergiques ou auto-immunes, mais facilite également l’exploration d’autres interactions et fonctions biologiques 8,16,17. Dans ce contexte, les VE, qui jouent un rôle dans l’histoire naturelle des infections parasitaires, pourraient être utilisées pour étudier le développement des parasites et les interactions avec des cellules hôtes spécifiques. De plus, ils pourraient avoir des applications potentielles en tant que biomarqueurs précoces ou différentiels pour le diagnostic des maladies parasitaires, le suivi des réponses thérapeutiques et la contribution au contrôle et à la gestion des infections parasitaires17,18.

De plus, comme démontré précédemment, le stade larvaire d’E. granulosus est sensible aux modifications de la concentration de calcium cytosolique, ce qui, en plus de jouer un rôle dans la viabilité du parasite, contrôle également le taux d’exocytose19,20. Dans ce contexte, et sachant que l’élévation intracellulaire du calcium augmente la libération de VE, l’utilisation d’un activateur de calcium intracellulaire comme le lopéramide pourrait être une stratégie cruciale pour augmenter le nombre de VE. Cette approche est particulièrement intéressante pour les systèmes cellulaires qui nécessitent de grandes populations pour générer une quantité adéquate de VE pour l’analyse du fret et fonctionnelle 11,21,22. Le protocole actuel (figure 1) détaille les méthodes d’obtention de cultures pures du stade larvaire d’E. granulosus et les conditions qui favorisent la production de sEV. Il décrit également le flux de travail pour l’isolement et la caractérisation de ces vésicules, ainsi que leur absorption par les cellules dendritiques murines, une étape essentielle dans l’étude initiale de la modulation du système immunitaire de l’hôte.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été évaluées et approuvées par le Comité d’expérimentation animale de la Faculté des sciences exactes et naturelles, Mar del Plata (numéros de permis : RD544-2020 ; RD624-625-2021 ; RD80-2022). Dans ce protocole, les souris ont été euthanasiées, conformément au « Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire » publié par le NIH et aux directives du National Health Service and Food Quality (SENASA).

1. Culture au stade larvaire d’Echinococcus

REMARQUE : Toutes les procédures ont été effectuées dans des conditions aseptiques.

  1. E. granulosus protoscoleces obtention
    1. Aspirer à l’aide d’une aiguille de 21 g et d’une seringue de 10 mL une partie du liquide hydatique du poumon ou du foie des bovins infectés pour réduire la turgescence du kyste (figure 2A).
      REMARQUE : Les poumons et le foie infectés proviennent de bovins présentés à l’abattage habituel à l’abattoir. Ils doivent être conservés à 4 °C et transformés dans les 24 heures suivant l’abattage.
    2. Ouvrez le kyste avec des ciseaux et retirez les couches laminaires et germinales du kyste à l’aide d’une pince. Placez-les sur une boîte de Pétri stérile, avec tout liquide hydatique restant (Figure 2B,C).
      REMARQUE : À ce stade, il est recommandé d’observer la boîte de Pétri au microscope inversé pour évaluer la qualité des protoscoléces et des capsules de couvain. Évitez d’accumuler le matériel biologique des kystes avec plus de 50 % des protoscoleces effondrés, qui sont identifiés par leur soma contracté, leur couleur plus foncée et leur rostellum désorganisé avec perte de crochets.
    3. Lavez les couches avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile complétée par des antibiotiques (100 μg/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 100 μg/mL de gentamicine 100 μg/mL) pour éliminer les protoscoleces.
      REMARQUE : Tous les lavages seront effectués avec du PBS complété par des antibiotiques.
    4. Transférez la suspension de protoscolex dans un tube de Khan en verre stérile à l’aide d’une pipette Pasteur.
    5. Laver les protoscoleces avec du PBS supplémenté à 4 °C à l’aide d’une pipette Pasteur pour éliminer les parasites morts. Remettez vigoureusement la suspension en suspension pour briser les capsules de couvain facilitant la libération de protoscolex. Laissez les protoscoleces se déposer pendant 1 à 2 minutes au fond du tube ; Jetez ensuite le surnageant contenant les Protoscoleces morts.
      REMARQUE : En raison d’une différence de densité, les protoscoleces vivants s’installent plus rapidement que les parasites morts.
    6. Répétez le processus de lavage jusqu’à ce que tous les protoscoleces morts et flottants aient été éliminés.
      REMARQUE : Les parasites morts sont éliminés lorsque tous s’installent au même rythme.
    7. Déterminer la viabilité des protoscoleces à l’aide du test d’exclusion du méthylène.
      1. Remettez en suspension les protoscoleces lavés à l’aide d’une pipette et déposez une goutte sur une lame. Ajouter une goutte de 0,1 mg/mL de bleu de méthylène et couvrir avec une lamelle. Attendez 2 à 3 minutes et observez au microscope.
      2. Comptez le nombre total de protoscoleces vivants (non colorés) et morts (teintés en bleu), et calculez le pourcentage de protoscoleces viables (figure 2D et encadré).
        REMARQUE : La viabilité des protoscoleces doit être d’environ 98 % avant l’établissement des cultures. Le temps de coloration ne doit pas dépasser 10 minutes, car des durées plus longues peuvent entraîner la coloration de parasites vivants.
  2. E. granulosus metacestodes obtention
    1. Produire une hydatique secondaire expérimentale en infectant par voie intrapéritonéale des souris CF1 femelles (poids corporel de 25 ± 5 g) avec 1500 protoscoleces (équivalent à 10 μL de la pastille protocolex) en suspension dans 0,5 mL de PBS supplémenté (Figure 2E).
      REMARQUE : Il est recommandé de maintenir les protoscoleces dans du PBS complété par des antibiotiques à 4 °C pendant 24 h ou en culture pendant 3 à 5 jours avant l’infection.
    2. Les métacestodes se développent dans les 4 à 6 mois suivant l’infection (figure 2F). Pendant cette période, loger les animaux dans des conditions de laboratoire contrôlées (température de 20 ± 1 °C, cycle lumière/obscurité de 12 h, eau et nourriture fournies à volonté). Une fois que les kystes se sont développés, anesthésiez les souris à l’aide de kétamine-xylazine (50 mg/kg/souris-5 mg/kg/souris) et euthanasiez-les par luxation cervicale.
    3. Nettoyez la surface ventrale de la souris avec de l’alcool à 70 % et ouvrez chirurgicalement la cavité péritonéale pour retirer les métacestodes développés à l’aide de ciseaux et de pinces.
    4. Transférez les masses de métacestodes dans une boîte de Pétri stérile.
      REMARQUE : Les masses métacestodes sont constituées de plusieurs kystes internes entourés de tissu conjonctif.
    5. Libérez les kystes des masses métacestodes en retirant soigneusement le tissu conjonctif recouvrant les métacestodes à l’aide d’une pince si nécessaire.
      REMARQUE : Cette étape permet de s’assurer que les parasites sont exempts de tissu hôte.
    6. Laver les métacestodes obtenus avec du PBS supplémenté à 4 °C (Figure 2G).
  3. E. granulosus protoscoleces et métacestodes culture
    1. Préparez le milieu de culture comme suit : Ajouter 100 μg/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 100 μg/mL de gentamicine, 4 mg/mL de glucose, 50 mM de tampon Hepes pH 7,5 et le milieu 199 pour atteindre le volume final désiré et mélanger doucement par inversion.
    2. Transvaser 5 mL du milieu de culture préparé dans chaque tube Leighton (figure 2H–I).
    3. Ajouter les parasites dans le milieu de culture et incuber à 37 °C pendant 5 jours sans changer de milieu. Incuber les tubes Leighton à un angle de 15° pour assurer une répartition uniforme de la matière biologique sur la surface plane. Cela maximise l’exposition du parasite au milieu de culture tout en évitant le contact avec le bouchon en caoutchouc.
      REMARQUE : Ajouter 9 000 à 10 000 protoscoléces ou 50 métacestodes (avec des diamètres variant entre 5 mm et 15 mm répartis en 10 kystes par tube).
    4. Si vous le souhaitez, ajoutez 20 μM de lopéramide (une concentration sublétale) dissous dans du sulfoxyde de diméthyle pendant 16 à 24 h dans le milieu de culture du parasite pour augmenter le taux de calcium cytosolique et améliorer la libération de VE par le stade larvaire d’E. granulosus.
      REMARQUE : Étant donné qu’une augmentation des concentrations intracellulaires de calcium augmente la production de VE, le traitement du parasite avec des composés qui affectent l’homéostasie du calcium augmentera la libération de VE.

2. Purification des vésicules extracellulaires

  1. Prélever le milieu de culture de parasites dans chaque tube Leighton et le transférer dans un tube conique de 15 ml.
    REMARQUE : Le milieu de culture peut être stocké pendant 24 h avant la première centrifugation avec un impact minimal sur la concentration ou la distribution granulométrique des vésicules. Les Protoscoleces peuvent être lavés trois fois avec un tampon PBS, récoltés et stockés à -20 °C dans des tubes de 1,5 ml.
  2. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C et transférer le surnageant dans un nouveau tube conique de 15 mL à l’aide d’une pipette.
    REMARQUE : Cette étape permet d’éliminer les protoscoleces morts. Après chaque étape de centrifugation, assurez-vous qu’au moins 0,5 cm de surnageant reste au-dessus de la pastille pour éviter toute contamination.
  3. Centrifugez le surnageant à 2 000 x g pendant 10 min à 4 °C et transférez-le dans de nouveaux tubes de 1,5 ml à l’aide d’une pipette.
    REMARQUE : Cette étape élimine les débris cellulaires plus gros.
  4. Centrifuger à 10 000 x g pendant 30 min à 4 °C pour éliminer les petits débris cellulaires.
  5. Transférez le surnageant dans un tube adapté au rotor de l’ultracentrifugeuse à l’aide d’une pipette. Marquez un côté de chaque tube avec un marqueur avant de le placer dans le rotor de l’ultracentrifugeuse. Ensuite, placez le tube dans le rotor avec le côté marqué vers le haut.
    REMARQUE : La marque sert de point de référence pour localiser le granulé après l’ultracentrifugation. Les tubes doivent être remplis aux trois quarts et équilibrés avec précision ; par conséquent, si nécessaire, ajoutez PBS. Si le volume surnageant dépasse la capacité d’un seul tube, divisez les échantillons en plusieurs tubes et combinez-les lors de la remise en suspension.
  6. Centrifuger à 100 000 x g pendant 1 h à 4 °C et vider le surnageant en une action rapide. Laisser reposer le tube à l’envers pendant 1 min. La pastille peut ne pas être visible à ce stade.
    REMARQUE : Le facteur k pour le rotor utilisé est de 103.
  7. Lavez la pastille avec au moins 3 ml de PBS pour éliminer les protéines contaminantes. Remettez la pastille en suspension en la pipetant plusieurs fois de la partie supérieure du tube vers le bas sur toutes les faces du tube, mais principalement du côté marqué où la pastille est censée se trouver.
    REMARQUE : Le cas échéant, regrouper les granulés remis en suspension dérivés du même surnageant dans un seul tube.
  8. Centrifuger à 100 000 x g pendant 1 h à 4 °C et vider le surnageant en une action rapide. Laisser reposer le tube à l’envers pendant 1 min.
    REMARQUE : Le facteur k pour le rotor utilisé est de 103.
  9. Remettre la pastille en suspension dans 30 μL de PBS en suivant le processus décrit à l’étape 2.7.
    REMARQUE : À ce stade, il est recommandé de mesurer la concentration totale de protéines dans la pastille remise en suspension pour estimer la quantité de sEV sécrétées. La concentration en protéines peut être déterminée en mesurant l’absorbance à 280 nm à l’aide d’un spectrophotomètre de microvolume.
  10. Transférez l’échantillon dans un tube de 1,5 mL. Congelez les vésicules extracellulaires à -80 °C.
    REMARQUE : Pour préserver l’intégrité de la vésicule pour les applications en aval, congelez la pastille remise en suspension le plus rapidement possible et évitez les cycles répétés de gel-dégel.

3. Caractérisation des vésicules isolées

  1. Détermination de la taille d’un VE à l’aide de la diffusion dynamique de la lumière (DLS)
    REMARQUE : La diffusion dynamique de la lumière est une méthode fiable et sensible pour évaluer la taille (basée sur le rayon hydrodynamique, Rh) et la forme des nanoparticules dans les fluides complexes, quel que soit leur type. Les mesures de potentiel DLS et zêta ont été effectuées à l’aide d’un faisceau laser monochromatique He-Ne à 633 nm. Si l’analyse n’est pas possible le jour de l’échantillonnage, les échantillons peuvent être congelés dans un tampon préfiltré avant d’être stockés.
    1. Décongeler les échantillons et les maintenir sur glace jusqu’à ce que les mesures soient prises.
      REMARQUE : La congélation des échantillons peut affecter la distribution des particules et l’intégrité des sEV. Par conséquent, évitez les cycles de gel et de dégel, car ils peuvent entraîner une diminution du signal LS avec des hauteurs de crête réduites.
    2. Filtrez les échantillons aqueux utilisés pour le DLS à travers un filtre de taille de pores de 0,2 μm.
      REMARQUE : Dans les expériences LS, il est essentiel de filtrer toutes les solutions, tampons et échantillons aqueux pour éliminer les grosses particules et la poussière, qui peuvent interférer avec les mesures.
    3. Diluer les échantillons de 1:10 à 1:50 dans du PBS pré-filtré.
    4. Mélangez les échantillons par inversion douce avant chaque mesure pour éviter la sédimentation, car l’intensité de la LS peut diminuer en raison d’un temps de traitement plus long des échantillons.
    5. Ajoutez 1 ml de l’échantillon dans une cuvette propre, en positionnant le côté non givré dans le trajet du laser à gauche dans l’instrument. Fermez le couvercle et attendez 2 à 3 minutes pour l’équilibrage avant de mesurer l’échantillon.
    6. Mesurez la taille en termes de rayon hydrodynamique (Rh) avant d’effectuer la mesure du potentiel zêta. Enregistrez les mesures à un seul angle de diffusion (θ = 90° à 150°) à 25 °C ± 1 °C.
    7. Cliquez sur Panneau de configuration pour vérifier les relevés et lancer l’acquisition des données.
      REMARQUE : D’après les valeurs moyennes de Rh et les distributions de taille évaluées pour les sEV, un pic entre 30 nm et 200 nm doit être observé (figure 3). Les pics inférieurs à 15 nm dans Rh sont attribués aux acides nucléiques et aux protéines en suspension. En règle générale, les distributions de taille sont calculées à partir du rayon hydrodynamique moyen. Cependant, la moyenne Z (taille moyenne des particules dans l’échantillon), l’indice de polydispersité (PDI, qui détermine l’hétérogénéité de la taille d’un échantillon) et la dépendance angulaire de l’intensité de la lumière diffusée peuvent également être rapportés.
  2. Détermination de la structure et de la taille des particules par microscopie électronique à transmission (MET)
    REMARQUE : Effectuez une microscopie électronique à transmission de coloration négative pour évaluer la taille, la structure et la pureté des sEV, à l’aide d’un protocole standard qui comprend la fixation, la déshydratation, l’enrobage de résine et le contraste pour les préparations de sEV à monture entière.
    1. Décongelez les échantillons concentrés de sEV de l’étape 2.10 et maintenez-les sur de la glace.
    2. Fixez les sEV dans des tubes de 1,5 ml. Appliquer avec précaution 5 à 10 μL de glutaraldéhyde à 2,5 % dans un tampon cacodylate de sodium 0,1 M (pH 7) sur ~5 μL de la pastille d’échantillon sEV (concentration requise de sEV ≈ 1 x 108–1 x 109 mL-1) et incuber pendant 2 h à 4 °C.
      REMARQUE : Les sEV peuvent être stockés jusqu’à 1 semaine à 4 °C dans un tampon de cacodylate de sodium de 0,1 M avant d’être traités ultérieurement. Par conséquent, si des services techniques externes sont nécessaires pour l’analyse TEM, envoyer les échantillons fixes sEV réfrigérés dans des tubes de 1,5 mL.
    3. Déposez 5 μL des granulés remis en suspension sur les grilles en cuivre EM revêtues de carbone Formvar de 300 mailles. Préparez deux ou trois grilles pour chaque échantillon.
    4. Laissez l’échantillon s’adsorber pendant 20 minutes dans un environnement sec et retirez l’excédent d’échantillon de la grille à l’aide de papier filtre.
    5. Placez des gouttes de 100 μL de PBS sur une feuille de film. À l’aide d’une pince propre, transférez les grilles (avec l’échantillon adsorbé vers le bas) dans les gouttes PBS pour le lavage.
    6. Séchez le côté opposé de l’échantillon adsorbé, en vous assurant que le côté de l’échantillon des grilles ne sèche pas pendant l’une des étapes suivantes.
      REMARQUE : Pour toutes les étapes suivantes, placez des gouttes de réactifs sur un film plat et transférez les grilles sur les gouttes à l’aide d’une pince.
    7. Transférez les grilles dans une goutte de 50 μL de glutaraldéhyde à 1 % pendant 5 min.
    8. Lavez les grilles avec une goutte de 100 μL d’eau distillée et laissez-les reposer pendant 3 min. Répétez neuf fois pour un total de dix lavages.
    9. Comparez les grilles d’échantillonnage avec une goutte de 50 μL de solution d’acétate d’uranyle à 1 % p/v, pH 7, pendant 1 min.
    10. Contrastez et intégrez les grilles dans un mélange de 100 μL d’acétate d’uranyle à 4 % et de 900 μL de méthylcellulose à 2 %.
    11. Faites sécher les grilles à l’air libre pendant 5 à 10 minutes pendant qu’elles restent en boucle et observez-les au microscope électronique à 80-100 kV avec une résolution de 0,2 nm et un grossissement de 100 000x.
    12. Stockez les grilles dans des boîtes de stockage à sec pour un stockage à long terme.

4. Génération de cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse

REMARQUE : Cette procédure doit être effectuée à l’aide de jeunes souris, qui sont caractérisées par des systèmes hématopoïétiques robustes avec des capacités de prolifération et de différenciation actives. En revanche, les souris plus âgées présentent un déclin de la fonction hématopoïétique, des réserves de cellules souches réduites, des interactions de niche modifiées et un réservoir de mémoire plus développé, ce qui est crucial pour l’immunité à long terme et la réponse aux agents pathogènes ou aux changements liés à l’âge tels que l’immunosénescence.

  1. Euthanasier une souris CF-1 femelle âgée de 5 à 8 semaines conformément aux directives éthiques de l’établissement, en minimisant la souffrance animale.
  2. Vaporisez la souris avec de l’éthanol avant de la placer dans une hotte de culture tissulaire.
    REMARQUE : Les étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions stériles.
  3. Placez la souris sur une planche de dissection en position couchée. À l’aide d’une pince et de ciseaux à disséquer, faites une incision verticale en « T » au-dessus de l’urètre et étendez-la horizontalement jusqu’au sommet des membres inférieurs, en prenant soin de ne pas briser le péritoine ou de perforer des organes, en particulier l’intestin.
  4. Séparez la peau le long des deux membres postérieurs pour exposer les os et les tissus des jambes à l’aide d’une pince. Avec les mains, retirez la peau de chaque jambe en poussant de la cheville vers l’abdomen, en tirant la peau vers le côté opposé. Les deux jambes seront alors exemptes de peau.
    REMARQUE : Jetez le corps de la souris dans le sac de résidus d’agents pathogènes.
  5. À l’aide de ciseaux et de pinces, retirez soigneusement le fémur et le tibia, en évitant la casse. Fixez l’extrémité de chaque os à l’aide d’une pince et coupez les tendons pour enlever les fascias musculaires autour des os. Nettoyage complet du tissu musculaire avec des serviettes en papier.
  6. Au fur et à mesure que chaque os est retiré, placez-le dans un tube stérile de 50 mL contenant 2 mL de milieu complet préparé avec un milieu RPMI complété par 5 % de FBS, 100 U/ml de pénicilline, 100 U/mL de streptomycine et 10 μg/mL de gentamicine pour éliminer les débris. Ensuite, aspirez et jetez le milieu de culture et lavez les os deux fois avec de l’éthanol à 70 % pendant 5 min.
  7. Transférez les os dans une boîte de Pétri stérile.
  8. Coupez les deux épiphyses osseuses à l’aide de ciseaux de dissection tranchants pour accéder aux cellules de la moelle osseuse.
  9. Rincer soigneusement les cellules de la moelle osseuse de chacun des quatre os dans une boîte de Pétri stérile à l’aide d’une aiguille de 25 g attachée à une seringue de 20 ml contenant le milieu complet. Les os deviendront plus transparents au fur et à mesure de l’extraction de la moelle osseuse.
    REMARQUE : Un volume de 20 mL du milieu complet devrait être suffisant pour éluer les cellules de la moelle osseuse des deux fémurs et des tibias.
  10. Homogénéisez doucement le milieu avec la moelle éluée par pipetage pour éliminer le tissu conjonctif osseux et les grumeaux cellulaires. Ensuite, transférez l’échantillon dans un tube conique stérile de 50 ml, en faisant passer les cellules à travers une crépine cellulaire stérile en polypropylène de 70 μm pour éliminer le tissu conjonctif et les débris osseux.
  11. Centrifuger les cellules à 450 x g pendant 7 min à 4 °C. Retirez et jetez soigneusement le surnageant, en vous assurant que la pastille reste collée à la paroi du tube.
  12. Incuber les cellules pendant 1 min à température ambiante (RT), puis les remettre en suspension dans 500 μL de tampon de lyse des globules rouges (GR). Neutralisez le tampon de lyse en ajoutant 3 mL de milieu complet.
  13. Centrifuger les cellules à 450 x g pendant 7 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 5 mL de milieu complet.
  14. Passer la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire stérile en polypropylène de 70 μm dans un tube conique stérile de 50 mL pour éliminer les agrégats cellulaires des érythrocytes lysés.
  15. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
  16. Ajouter 300 ng/mL de ligand tyrosine kinase 3 recombinant, murin et apparenté à la Fms (Flt3L) dans le milieu de culture.
  17. Plaquez les cellules à une concentration de 1 x 106 cellules/mL dans une plaque multipuits.
  18. Incuber les cellules pendant 7 jours à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2.
    REMARQUE : Évitez de secouer les cellules pendant qu’elles se différencient et se développent pour éviter une maturation spontanée.
  19. Le jour 3, retirer 1 mL de milieu de chaque puits (en évitant de perturber les cellules) et le remplacer par 1 mL de milieu complet frais préchauffé complété par 150 ng/mL de Flt3L murin recombinant.

5. Interaction entre les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse et les vésicules extracellulaires d’E. granulosus

  1. Coloration de la membrane des vésicules extracellulaires
    1. Dégivrez les sEV stockés à l’étape 2.10 et maintenez-les sur la glace.
    2. Remettre en suspension 10 μL de sEVs purifiés dans 10 μL de véhicule d’étiquetage (diluant C).
    3. Ajouter 20 μL de solution de colorant PKH26 pour obtenir une concentration finale de 2 μM. Mélangez délicatement à l’aide d’une pipette et laissez incuber pendant 35 min à 37°C dans l’obscurité.
      REMARQUE : La solution de colorant PKH26 2x (4 μM) doit être préparée immédiatement avant la coloration en ajoutant 0,5 μL de solution de colorant éthanolique PKH26 à 125 μL de diluant C.
    4. Mélangez doucement toutes les 3 à 5 minutes pendant l’incubation pour assurer une coloration homogène.
    5. Ajouter 40 μL de BSA 1 % et incuber pendant 10 min à RT pour arrêter le processus de coloration.
    6. Lavez les sEVs avec 1 mL de PBS et centrifugez-les à 100 000 x g pendant 1 h à 4 °C pour éliminer l’excès de colorant.
      REMARQUE : Le facteur k pour le rotor est de 103.
    7. Remettre la pastille en suspension dans 90 μL de PBS en suivant le protocole décrit à l’étape 2.7.
  2. Stimulation de cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse murine avec des vésicules extracellulaires d’E. granulosus
    1. Prélever les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse (BMDC) de la plaque de culture et les transférer dans des tubes de 1,5 ml.
      REMARQUE : Manipuler avec précaution pour éviter la maturation cellulaire spontanée.
    2. Centrifugez le milieu à 450 x g pendant 5 min pour granuler les cellules.
      REMARQUE : Réservez les surnageants de la centrifugation pour replaquer les cellules lors des étapes d’analyse ultérieures de la cytométrie en flux.
    3. Remettre en suspension les BMDC dans 30 μL de sEV non colorés à partir de l’étape 2.10 pour l’analyse par cytométrie en flux ou dans 90 μL de sEV colorés contenant du PBS à partir de l’étape 5.1.7. pour la microscopie confocale. Incuber pendant 30 min à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2. Mélangez délicatement l’échantillon toutes les 10 min.
      REMARQUE : Pour assurer un contact efficace entre les BMDC et les sEV, les 30 premières minutes d’incubation doivent être effectuées dans un volume minimal à l’aide de tubes de 1,5 mL.
    4. Pour la microscopie confocale, transférez les cellules sur une lamelle en verre traité au bleu d’Alcian (12 mm de diamètre) placée dans une plaque à 24 puits. Incuber pendant 30 minutes supplémentaires à 37 °C dans une chambre humidifiée avec 5 % de CO2.
      REMARQUE : Le traitement bleu alcian confère une charge positive à la lamelle, facilitant l’adhérence des membranes plasmiques chargées négativement des BMDC.
      1. Pour préparer les lamelles, plongez-les dans un colorant filtré 1 % bleu d’Alcian 8 GX et faites-les chauffer au micro-ondes pendant 1 à 2 minutes sans les faire bouillir. Incuber-les dans la solution chaude pendant 10 min, en remuant toutes les 2 à 3 min.
      2. Ensuite, lavez les lamelles avec de l’eau distillée déminéralisée pour éliminer l’excès de bleu Alcian et séchez-les sur du papier absorbant. Enfin, autoclavez les lamelles et stockez-les dans des conditions stériles jusqu’à leur utilisation.
    5. Pour l’analyse par cytométrie en flux, transvaser les BMDCs-sEV dans le même puits où ils ont été récoltés (voir l’étape 5.2.1), ajouter les surnageants réservés à l’étape 5.2.2 et incuber pendant 18 h à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2.
      REMARQUE : Laissez environ 500 μL de milieu dans le puits pour éviter la dessiccation des cellules restantes après le prélèvement.
    6. Utilisez des témoins positifs et négatifs pour évaluer la maturation du BMDC. Stimulez les cellules avec 100 ng/mL de lipopolysaccharide (LPS) pendant 18 h en tant que contrôle positif. Pour un contrôle négatif de l’endocytose, incuber des BMDC avec des sEV à 4 °C. Incluez également un contrôle de cellules dendritiques non stimulées.
  3. Microscopie confocale de vésicules extracellulaires d’E. granulosus capturées et internalisées par des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse.
    1. Une fois la période d’incubation décrite à l’étape 5.2.4 terminée, aspirer et jeter le PBS de la lamelle.
    2. Fixer les BMDC en ajoutant 100 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % sur la lamelle et incuber pendant 10 min à RT.
      REMARQUE : Assurez-vous que le volume maintient la tension superficielle sur la lamelle.
    3. Aspirez et jetez le PFA, puis lavez trois fois la lamelle avec du PBS-BSA 2 %.
    4. Ajouter 100 μL de PBS contenant un anticorps anti-CMH de classe II-FITC dilué 1/100 et incuber pendant 1 h à RT dans l’obscurité.
    5. Aspirez et jetez la solution d’anticorps, puis lavez la lamelle trois fois avec du PBS-BSA 2 %.
    6. Ajouter 100 μL de 50 ng/mL de DAPI et incuber pendant 30 min à température ambiante dans une chambre humide pour contre-colorer les noyaux.
    7. Aspirez et jetez la solution de colorant et lavez la lamelle trois fois avec du PBS-BSA 2 %.
    8. Retirez la lamelle à l’aide d’une pince à pointe fine incurvée et séchez-la sur une serviette en papier pour éliminer l’excès de liquide.
    9. Montez la lamelle vers le bas sur une lame de verre à l’aide d’un support de montage composé d’alcool polyvinylique et de glycérol. Laisser sécher 2 h à 37 °C ou une nuit à 4 °C dans l’obscurité.
    10. Éliminez toutes les bulles d’air entre la lamelle et la glissière de verre en appuyant doucement sur la lamelle à l’aide d’une pince.
    11. Observez les échantillons montés sous un microscope confocal à l’aide d’un objectif à immersion dans l’huile 60x avec une longueur d’onde d’excitation/émission de 485/538 nm pour FITC, 358/461 nm pour DAPI et 551/567 nm pour PKH26.
  4. Évaluation phénotypique de cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse stimulées par des vésicules extracellulaires par cytométrie en flux
    1. Après la période d’incubation décrite à l’étape 5.2.5, prélever les BMDC en rinçant le milieu de haut en bas à plusieurs reprises à l’aide d’une pipette.
    2. Prélever les BMDC contenant du milieu et les placer dans des tubes de 1,5 ml.
    3. Centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C pour granuler les cellules.
      REMARQUE : Si vous le souhaitez, pour analyser la sécrétion de cytokines, retirez les surnageants à l’aide d’une pipette, transférez-les dans de nouveaux tubes de 1,5 ml et conservez-les à -20 °C pour d’autres tests ELISA (Enzyme-linked immunosorbent test).
    4. Remettre en suspension les BMDC dans 100 μL de PBS contenant de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC), de l’allophycocyanine (APC) ou des anticorps monoluminescents conjugués à la phycoérythrine dirigés vers les CD11c, CD40, CD80, CD86, CMH de classe I et CMH de classe II et incuber pendant 15 min à 4 °C dans l’obscurité.
    5. Laver les BMDC avec du PBS et les centrifuger à 450 × g pendant 5 min à 4 °C.
    6. Remettre en suspension les BMDC dans 500 μL de PFA à 1 % pour les fixer et les stocker à 4 °C jusqu’à acquisition dans un cytomètre en flux.

Résultats

La figure 1 présente un organigramme résumant les principales étapes du maintien de cultures pures du stade larvaire d’E. granulosus, l’isolement et la caractérisation des sEV, ainsi que leur absorption par les cellules dendritiques murines. Pour obtenir une production élevée de sEV à partir des protoscoleces et des métacestodes d’E. granulosus, une méthode de culture in vitro précédemment développée en laboratoi...

Discussion

La figure 1 décrit le flux de travail du protocole pour la culture des parasites, l’isolement des sEV dérivés du parasite, la différenciation des cellules dendritiques de la moelle osseuse et l’analyse de l’absorption des sEV par ces cellules. L’objectif était de décrire en détail chaque section du protocole qui pourrait être réalisée dans son ensemble ou séparément, en mettant en évidence les principales considérations pour garantir la...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Les auteurs reconnaissent Lic. Cecilia Gutiérrez Ayesta (Servicio de Microscopía Electrónica, CONICET, Bahía Blanca, Argentine) et Lic. Leonardo Sechi et Lic. Eliana Maza (INIFTA, Universidad Nacional de La Plata, Argentine) pour l’assistance technique en microscopie électronique à transmission et la diffusion dynamique de la lumière, respectivement. Nous remercions également Dra. Graciela Salerno, Dra. Corina Berón et le Dr Gonzalo Caló pour l’utilisation de l’ultracentrifugeuse à l’INBIOTEC-CONICET-FIBA, Argentine. Les auteurs remercient Lic. Kelly (SENASA, Mar del Plata, Argentine) et Lic. H. Núnez García (CONICET, Universidad Nacional de Mar del Plata, Argentine) pour leur collaboration à l’évaluation du bien-être des souris, et le vétérinaire J. Reyno, le vétérinaire S. Gonzalez et le vétérinaire L. Netti pour leur contribution à l’obtention de matériel parasitaire. Ces travaux, y compris les coûts d’expérimentation, de réactifs et d’équipement, ont été soutenus par le PICT 2020 n° 1651 financé par l’ANPCyT.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL tubesHensoN14059
24-well plate JetBiofilCAP011024Polystyrene, flat bottom, Sterile
6-well plate  Henso Medical Co. Ltd.N14221Flat-shape bottom, PS material, Sterile
70 mm polypropylene cell strainerBiologix Group Limited15-1070Sterile
Alcian blue 8 GX dye Santa Cruzsc-214517B
Automatic CO2 incubatorNuarireUN-5100E/G DH
Bovine Serum AlbuminWiener lab1443151
CD11c Monoclonal antibody-PECy5   100 µgeBioscience15-0114-82clone (N418)
CD40 Monoclonal antibody-FITC 100 µgeBioscience11-0402-82clone (HM40-3)
CD80 Monoclonal antibody-APC 100 µgeBioscience17-0801-82clone (16-10A-1)
CD86 Monoclonal antibody-FITC  100 µgeBioscience11-0862-82clone (GL-1)
CentrifugeThermo ScientificIEC CL31R Multispeed
Confocal MicroscopeNikonNikon Confocal Microscope C1
Conical tubes 15 mL dia.17 x 120 mmCitotest4610-1865
DAPISigma107K4034
D-GlucoseMerk1.78343
Dimethyl Sulfoxide Anedra6646
Fetal Bovine Serum 500 mLSigma-Aldrich  12352207
Flow Cytometry SystemBD BiosciencesBD FACSCanto™ II
Folded Capillary Zeta Cell Malvern PanalyticalDTS1070
Gentamicin sulfate saltSigmaG1264
Glutaraldehyde solutionFluka49630
HepesGibco11344041
Hypodermic  needle 21 G x 1"25/8WeigaoSterile
Hypodermic  needle 25 G x 5/8"WeigaoSterile
Inverted microscope LeicaDMIL LED Fluo 
KetamineHolliday
Lipopolysaccharide  5 mgInvitrogentlrl-rslpsLPS from the Gram-negative bacteria E. coli K12 . TLR2/4 Agonists
Loperamide hydrochlorideSigma-Aldrich5.08162
Medium 199 Gibco11150059
Methylene BlueAnedra6337
MHC class I (H2kb) Monoclonal antibody-PE 100 µgeBioscience12-5958-82clone (AF6-88.5.5.3)
MHC class II (IA/IE) Monoclonal antibody-FITC  100 µgeBioscience11-5321-82clone (M5/114.15.2)
MicroscopeOlympusCX31
Mouse recombinant murine Flt3L.PrepoTech250-31L-10UG
NanodropThermo ScientificND-One
ParaformaldehydeAgar ScientificR1018
Penicillin G sodium saltSigmaP3032-10MU
PKH26Sigma-AldrichMINI26
Potassium Phosphate MonobasicTimperFor Phosphate Buffered Saline (PBS)
RBC lysis buffer 100 mLRoche11814389001
RPMI medium  1640 1x 500 mLSigma-Aldrich (Gibco)11875093
Sodium Cacodylate  Sigma-AldrichC0250
Sodium ChlorideAnedra7647-14-5For Phosphate Buffered Saline (PBS)
Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) p. a.Biopack1639.07For Phosphate Buffered Saline (PBS)
Streptomycin sulfate saltSigmaS9137
Syringe 10 mLBremenSterile
Thickwall polycarbonate tubesBeckman Coulter13 x 55 mm , nominal capacity 4 mL
Transmission Electron MicroscopeJeolJEOL JSM 100CX II
UltracentrifugeBeckmanOptima LE-80k 90 Ti rotor
XylazineRichmond
Zetasizer Nano Malvern Nano ZSizer-ZEN3600To perform Dynamic Light scattering and zeta potential measurements

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