著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

ここでは、Echinococcus granulosusからのin vitro培養条件、単離、および細胞外小胞(EV)の生成の増加について説明します。小型EVは、動的光散乱と透過型電子顕微鏡によって特徴付けられました。骨髄由来樹状細胞による取り込みとその表現型調節を、共焦点顕微鏡法とフローサイトメトリーを用いて研究しました。

要約

条虫による細胞外小胞の分泌は、寄生虫間だけでなく、宿主組織との細胞間コミュニケーションを可能にするために重要です。特に、小さな細胞外小胞(sEV)は、宿主の免疫調節や寄生虫の生存に重要な天然抗原を輸送するナノキャリアとして機能します。この記事では、 Echinococcus granulosus の幼虫期培養からsEVを単離するための段階的なプロトコルを提示し、マウスの骨髄から得られた樹状細胞によるsEVの取り込みを分析します。マウス骨髄から得られた樹状細胞は、 in vitro 培養の1週間後の成熟中に接着および抗原提示能力を獲得します。この記事では、超遠心分離法を用いたsEVの作製、精製、定量、動的光散乱顕微鏡および透過型電子顕微鏡の並行解析に関する包括的な情報を提供します。さらに、マウスの骨髄細胞を単離して培養し、Flt3Lを使用して樹状細胞への分化を促進するための詳細な実験プロトコルが概説されています。これらの樹状細胞は、ナイーブT細胞に抗原を提示することができ、それによって in vivoでの免疫応答のタイプを調節します。したがって、共焦点顕微鏡法およびフローサイトメトリー分析を含む代替プロトコルが提案されており、以前に寄生性sEVに曝露された樹状細胞の獲得性成熟表現型を確認するために提案されています。最後に、記載されたプロトコルは、全体としてまたは個々の部分に適用して、寄生虫 のin vitro 培養を行い、細胞外小胞を単離し、骨髄由来の樹状細胞培養を生成し、これらの細胞で取り込みアッセイを行うことができることは注目に値する。

概要

Echinococcus granulosus は、嚢胞性エキノコックス症1として知られる長期感染の原因となる人獣共通感染症の寄生虫です。家畜やヒトなどの中間宿主では、寄生虫感染は主に肝臓と肺に影響を及ぼし、幼虫期は液体で満たされた嚢胞またはプロトスコレス(幼虫自体)を含むメタセストードとして発生します。すべての条虫と同様に、この寄生虫は消化器系と排泄系の両方を欠いているため、代謝産物の取り込みと排泄、および細胞外小胞の放出を調節するための活発なエンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス細胞プロセスを進化させてきました2,3。細胞外小胞(EV)は、明らかにすべての細胞タイプから分泌される脂質二重層封入粒子です。特に、生合成の起源に関係なく、200 nm未満のEVと定義される小さな細胞外小胞(sEV)4は、細胞間免疫メディエーターとして作用することができます。この機能は、生存を確保するために宿主の免疫調節に依存する寄生虫において特に重要です3。免疫操作は、 in vivo でナイーブT細胞を活性化し、これらの寄生虫による慢性感染につながる適応免疫応答を開始できる唯一の細胞である宿主樹状細胞によるsEVの取り込みによって達成されます。樹状細胞は、自然免疫系の専門的な抗原提示細胞であり、抗原ペプチドをMajor Histocompatibility ComplexクラスIおよびクラスII(MHC IおよびMHC II)に処理してロードし、それらを膜上に示して排他的なナイーブT細胞プライミング(それぞれCD8+ およびCD4+ T細胞)5。樹状細胞は、共刺激マーカーCD80/CD86、CD40、MHC-IIの発現誘導により成熟を誘導し、外来抗原を認識して末梢組織から二次リンパ器官へ移動し、それらを排他的なナイーブT細胞プライミングにロードします6。したがって、このプロトコルの全体的な目標は、蠕虫寄生虫と宿主のコミュニケーションを現実的な方法で研究し、宿主の免疫細胞に到達すると感染の進行と慢性寄生虫疾患の進行に影響を与えるsEVの形で寄生成分のパッケージングと送達を分析することです。

sEVの研究を通じて蠕虫-宿主インターフェースの解析に取り組むことには、いくつかの利点があります。まず、扁形動物の外側を覆う外皮は、寄生虫とその宿主との間の主要な交差点を構成する二重膜構造であり、この構造からsEVを容易に生成または浸透させることができる7。第二に、sEVには寄生虫のライフサイクルのすべての段階からのタンパク質抗原が高度に含まれており、これは、寄生虫感染中に宿主の免疫系が抗原をサンプリングする自然な方法を表しています8,9。蠕虫sEVは、その生物学的生産、精製の容易さ(組織破壊やタンパク質分画を必要としない)、および宿主細胞との直接的な相互作用により、寄生虫と宿主の相互作用のin vivo条件をシミュレートするin vitro実験の開発を可能にします。最後に、sEVは、宿主細胞によって食作用または内在化できる寄生構造を持つ可能性を表しており、特に被嚢線虫の場合、寄生虫全体ではそうすることが不可能であることを克服する。

前述の利点と、蠕虫アシスが蔓延しており、通常は慢性疾患であり、寄生虫が生存戦略として宿主の免疫系を操作すると推定されるという事実を考慮すると、寄生虫由来のEVの単離と樹状細胞との相互作用におけるそれらの研究は、この免疫調節を探求するための貴重なフレームワークを提供します10。この意味で、住血吸虫、Fasciola hepatica、Brugia malayi、およびE. granulosusなどの線虫およびプラティ蠕虫を含む蠕虫からのEVの内在化は、樹状細胞9,11,12,13,14,15の成熟および活性化を誘導することが記載されている。

蠕虫由来EVの単離は、免疫学的相互作用の研究を可能にするだけでなく、アレルギー疾患または自己免疫疾患の防御ワクチンまたは免疫療法剤の開発につながる可能性があるだけでなく、他の生物学的相互作用および機能の探索も促進する8,16,17.これに関連して、寄生虫感染の自然史に役割を果たすEVは、寄生虫の発生と特定の宿主細胞との相互作用を調査するために利用できる可能性があります。さらに、寄生虫症の診断、治療反応のモニタリング、寄生虫感染症の制御と管理に貢献するための早期または鑑別バイオマーカーとして、潜在的な用途がある可能性があります17,18。

さらに、以前に実証したように、E. granulosusの幼虫期は、細胞質カルシウム濃度の変化の影響を受けやすく、これは寄生虫の生存率に役割を果たすだけでなく、エキソサイトーシス率も制御します19,20。この文脈では、細胞内のカルシウム上昇がEVの放出を促進することを知っているため、細胞内カルシウムエンハンサーをロペラミドとして使用することは、EVの数を増やすための重要な戦略になる可能性があります。このアプローチは、貨物および機能解析11,21,22のために十分な量のEVを生成するために大規模な集団を必要とするセルラーシステムにとって特に興味深いものです。現在のプロトコル(図1)では、E. granulosus幼虫期の純粋な培養物を得る方法と、sEV産生を強化する条件について詳しく説明しています。また、これらの小胞の単離と特性評価のワークフロー、および宿主免疫系調節の初期研究における重要なステップであるマウス樹状細胞によるそれらの取り込みについても説明します。

プロトコル

動物を含むすべての手順は、マールデルプラタの精密自然科学部の動物実験委員会によって評価および承認されました(許可番号:RD544-2020;RD624-625-2021;RD80-2022)。このプロトコルでは、NIHが発行した「Guide for the Care and Use of Laboratory Animals」とNational Health Service and Food Quality(SENASA)のガイドラインに従って、マウスを安楽死させました。

1. エキノコックス 幼虫期の栽培

注:すべての手順は無菌条件下で行われました。

  1. E. granulosus protoscoleces の入手
    1. 感染した牛の肺または肝臓からの21Gの針と10mLのシリンジ液の一部をシリンジで吸引し、嚢胞膨満を軽減します(図2A)。
      注:感染した肺と肝臓は、食肉処理場で定期的に屠殺するために提示された牛から来ています。それらは4°Cに保ち、屠殺から24時間以内に処理する必要があります。
    2. ハサミで嚢胞を開き、鉗子を使用して嚢胞から層状および胚細胞層を除去する。それらを、残っている水分液と一緒に滅菌ペトリ皿に置きます(図2B、C)。
      注:この時点で、倒立顕微鏡でペトリ皿を観察して、プロトスコレスと雛カプセルの品質を評価することをお勧めします。プロトスコレスの50%以上が崩壊した嚢胞から生物学的物質をプールすることは避けてください。これは、収縮した体細胞、暗い色、およびフックの喪失を伴う無秩序な吻によって識別されます。
    3. 抗生物質(100 μg/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、100 μg/mL、ゲンタマイシン100 μg/mL)を添加した滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で層を洗浄し、プロトスコレーゼを除去します。
      注:すべての洗浄は、抗生物質を補給したPBSを使用して行われます。
    4. パスツールピペットを使用して、protoscolex懸濁液を滅菌ガラスカーンチューブに移します。
    5. パスツールピペットを使用して、プロトスコレスを補充されたPBSで4°Cで洗浄し、死んだ寄生虫を取り除きます。懸濁液を激しく再懸濁して、プロトスコレックスの放出を促進するひなカプセルを壊します。protoscolecesがチューブの底に1〜2分間落ち着くのを待ちます。次に、死んだprotoscolecesを含む上清を捨てます。
      注:密度の違いにより、生きているプロトスコレスは死んだ寄生虫よりも早く落ち着きます。
    6. すべての死んだプロトスコレスと浮遊するプロトスコレスが除去されるまで、洗浄プロセスを繰り返します。
      注:死んだ寄生虫は、すべてが同じ速度で沈降すると除去されます。
    7. メチレン排除試験を使用してプロトスコレセスの生存率を判断します。
      1. 洗浄したprotoscolecesをピペットで再懸濁し、スライドに一滴垂らします。0.1 mg / mLメチレンブルーを一滴加え、カバースリップで覆います。.2〜3分待ってから顕微鏡で観察します。
      2. 生きている(染色されていない)プロトスコレックと死んでいる(青く染色された)プロトスコレスの総数を数え、生存可能なプロトスコレスの割合を計算します(図2D および挿入図)。
        注:プロトスコレセスの生存率は、培養を確立する前に約98%である必要があります。染色時間が長くなると、生きている寄生虫が染色される可能性があるため、染色時間は10分を超えてはなりません。
  2. E. granulosus metacestodes の入手
    1. 雌のCF1マウス(体重25±5g)に1500個のプロトスコレス(protocolexペレットの10μLに相当)を0.5mLの補充PBSに懸濁させて腹腔内に感染させることにより、実験的な二次性発疹性疾患を産生します(図2E)。
      注:抗生物質を添加したPBS中のプロトスコレーゼを4°Cで24時間、または感染前の3〜5日間培養中に維持することをお勧めします。
    2. メタチェストードは、感染後4〜6か月以内に発症します(図2F)。この期間中、制御された実験室条件(温度20±1°C、12時間の明暗サイクル、水と餌 を自由に提供)で動物を飼育します。嚢胞が発生したら、ケタミン-キシラジン(50 mg / kg /マウス-5 mg / kg /マウス)を使用してマウスを麻酔し、子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させます。.
    3. マウスの腹面を70%アルコールで洗浄し、腹腔を外科的に開いて、はさみと鉗子を使用して発達した中条虫を取り除きます。
    4. メタセストデスの塊を滅菌済みのペトリ皿に移します。
      注:メタセストード腫瘤は、結合組織に囲まれた複数の内部嚢胞で構成されています。
    5. 必要に応じて鉗子を使用してメタセストードを覆う結合組織を慎重に除去することにより、メタセストード腫瘤から嚢胞を放出します。
      注:この手順により、寄生虫に宿主組織が含まれていないことが保証されます。
    6. 得られたメタセストードを補充したPBSで4°Cで洗浄します(図2G)。
  3. E. granulosus protoscoleces と metacestodes の栽培
    1. 次のように培地を調製します:100 μg/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、100 μg/mLゲンタマイシン、4 mg/mLグルコース、50 mM Hepes緩衝液pH 7.5、および培地199を加えて所望の最終容量に到達し、反転して穏やかに混合します。
    2. 調製した培地5 mLを各Leightonチューブに移します(図2H–I)。
    3. 寄生虫を培地に加え、培地を変更せずに37°Cで5日間インキュベートします。レイトンチューブを15°の角度でインキュベートして、生物学的物質が平らな表面全体に均一に分布するようにします。これにより、寄生虫の培地への曝露が最大限に増加し、ゴム栓との接触が防止されます。
      注:9,000〜10,000個のプロトスコレーゼまたは50個のメタセストードを追加します(直径は5 mm〜15 mmで、チューブあたり10個の嚢胞として分布します)。
    4. 必要に応じて、ジメチルスルホキシドに16〜24時間溶解した20μMのロペラミド(亜致死濃度)を寄生虫培地に加えて、細胞質カルシウムレベルを増加させ、 E.granulosusの幼虫期によるEV放出を促進します。
      注:細胞内カルシウム濃度の増加がEV産生を促進することを考えると、カルシウム恒常性に影響を与える化合物で寄生虫を処理すると、EVの放出が増加します。

2. 細胞外小胞の精製

  1. 各レイトンチューブから寄生虫培地を回収し、15 mLのコニカルチューブに移します。
    注:培地は、最初の遠心分離の前に24時間保存でき、小胞の濃度またはサイズ分布への影響は最小限に抑えられます。プロトスコレーゼは、PBSバッファーで3回洗浄し、回収し、1.5mLチューブで-20°Cで保存することができます。
  2. 300 x g で4°Cで10分間遠心分離し、ピペットを使用して上清を新しい15 mLコニカルチューブに移します。
    注:このステップでは、死んだprotoscolecesを削除します。各遠心分離ステップの後、汚染を避けるために、少なくとも0.5cmの上清がペレットの上に残っていることを確認してください。
  3. 上清を2,000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、ピペットを使用して新しい1.5 mLチューブに移します。
    注:この手順では、大きなセルの破片を取り除きます。
  4. 10,000 x g で4°Cで30分間遠心分離し、小さな細胞破片を除去します。
  5. 上清をピペットを使用して超遠心ローターに適したチューブに移します。超遠心ローターに入れる前に、各チューブの片側にマーカーで印を付けます。次に、マークされた面を上にしてチューブをローターに入れます。
    注:このマークは、超遠心分離後のペレットの位置を特定するための基準点として機能します。チューブは4分の3が完全で、正確にバランスが取れている必要があります。したがって、必要に応じて PBS を追加します。上清の量が1本のチューブの容量を超える場合は、サンプルを複数のチューブに分割し、再懸濁中にそれらを結合します。
  6. 100,000 x g で4°Cで1時間遠心分離し、素早い動作で上清を注ぎます。チューブを逆さまにして1分間休ませます。この段階では、ペレットが見えない場合があります。
    注:使用されるローターのkファクターは103です。
  7. ペレットを少なくとも3mLのPBSで洗浄して、汚染されたタンパク質を取り除きます。チューブの上側から下側まで、すべてのチューブ面で上下に複数回ピペッティングして、ペレットを再懸濁しますが、主にペレットが存在すると予想されるマークされた面で行います。
    注:該当する場合は、同じ上清から得られた再懸濁ペレットを1本のチューブにプールします。
  8. 100,000 x g で4°Cで1時間遠心分離し、素早い動作で上清を注ぎます。チューブを逆さまにして1分間休ませます。
    注:使用されるローターのkファクターは103です。
  9. ステップ2.7で説明したプロセスに従って、ペレットを30 μLのPBSに再懸濁します。
    注:この時点で、再懸濁したペレットの総タンパク質濃度を測定して、分泌されたsEVの量を推定することをお勧めします。タンパク質濃度は、微量分光光度計を使用して280nmの吸光度を測定することで測定できます。
  10. サンプルを1.5mLチューブに移します。細胞外小胞を-80°Cで凍結します。
    注:下流のアプリケーションで小胞の完全性を維持するために、再懸濁したペレットをできるだけ早く凍結し、凍結融解サイクルが繰り返されないようにします。

3. 単離された小胞の特性評価

  1. 動的光散乱(DLS)を用いたEVサイズの決定
    注:動的光散乱は、複雑な流体中のナノ粒子のサイズ(流体力学的半径、Rhに基づく)と形状を評価するための信頼性と感度の高い方法です。DLSおよびゼータ電位の測定は、633nmのHe-Ne単色レーザービームを使用して行われました。サンプリング日に分析が不可能な場合は、サンプルを事前にろ過したバッファーで凍結してから保存することができます。
    1. サンプルを解凍し、測定が行われるまで氷上に保ちます。
      注:サンプルを凍結すると、sEVの粒子分布と完全性に影響を与える可能性があります。したがって、凍結と解凍のサイクルは、ピーク高さが減少するとLSシグナルが減少する可能性があるため、避けてください。
    2. DLSに使用する水性サンプルを0.2μmのポアサイズフィルターでろ過します。
      注:LS実験では、測定を妨げる可能性のある大きな粒子やほこりを取り除くために、すべての溶液、バッファー、水性サンプルをろ過することが不可欠です。
    3. サンプルを事前にろ過したPBSで1:10〜1:50に希釈します。
    4. サンプルの処理時間が長くなるとLS強度が低下する可能性があるため、沈降を防ぐために、各測定の前にサンプルを穏やかに反転してサンプルを混合します。
    5. サンプル1 mLを清潔なキュベットに加え、つや消しされていない面を装置の左側のレーザー経路に配置します。蓋を閉め、平衡化のために2〜3分待ってからサンプルを測定します。
    6. ゼータ電位測定を実行する前に、流体力学半径(Rh)でサイズを測定します。25°C±1°Cで単一の散乱角度(θ = 90°〜150°)で測定値を記録します。
    7. [コントロールパネル]をクリックして読み取り値を確認し、データ取得を開始します。
      注:平均Rh値とsEVの評価されたサイズ分布に基づいて、30 nmから200 nmの間のピークを観察する必要があります(図3)。Rh 中の 15 nm 未満のピークは、懸濁液中の核酸およびタンパク質に起因します。通常、サイズ分布は平均流体力学的半径から計算されます。ただし、Z平均(サンプル内の平均粒子サイズ)、多分散指数(PDI、サンプルのサイズの不均一性を決定する)、および散乱光強度の角度依存性も報告できます。
  2. 透過型電子顕微鏡(TEM)による構造と粒子径の決定
    注:固定、脱水、樹脂包埋、およびホールマウントsEV調製のためのコントラストを含む標準プロトコルを使用して、sEVのサイズ、構造、および純度を評価するために、ネガティブ染色透過型電子顕微鏡法を実施します。
    1. ステップ2.10で抽出した濃縮sEVサンプルを解凍し、氷上に保ちます。
    2. sEVを1.5mLチューブに固定します。0.1 M カコジル酸ナトリウム緩衝液 (pH 7) に 2.5% グルタルアルデヒド 5–10 μL の 2.5% グルタルアルデヒドを ~5 μL の sEV サンプルペレット (必要な sEV 濃度 ≈ 1 x 108–10 9 mL-1) に慎重に適用し、4 °C で 2 時間インキュベートします。
      注:sEVは、0.1 Mカコジル酸ナトリウムバッファーに4°Cで最大1週間保存してから、さらに処理することができます。したがって、TEM分析に外部の技術サービスが必要な場合は、固定されたsEVサンプルを1.5 mLチューブで冷蔵して送付してください。
    3. 再懸濁したペレット5μLを、300メッシュのFormvarカーボンコーティングされたEM銅グリッドに堆積させます。サンプルごとに2つまたは3つのグリッドを準備します。
    4. 乾燥した環境でサンプルを20分間吸着させ、フィルターペーパーを使用してグリッドから余分なサンプルを取り除きます。
    5. PBS100μL滴をフィルムの上に置きます。きれいな鉗子を使用して、グリッド(吸着されたサンプル側を下にして)をPBSドロップに移して洗浄します。
    6. 吸着したサンプルの反対側を乾燥させ、グリッドのサンプル側が次のステップで乾燥しないようにします。
      注:後続のすべてのステップでは、試薬の滴を平らなフィルムに置き、鉗子を使用してグリッドを液滴に移します。
    7. グリッドを1%グルタルアルデヒドの50μL滴下に5分間移します。
    8. 100 μLの蒸留水でグリッドを洗浄し、3分間放置します。9回繰り返して合計10回の洗浄を行います。
    9. サンプルグリッドを、1% w/v 酢酸ウラニル溶液(pH 7)を 50 μL 滴下して 1 分間対比します。
    10. 100 μL の 4% 酢酸ウラニルと 900 μL の 2% メチルセルロースの混合物にグリッドを造影し、埋め込みます。
    11. グリッドをループ上に残したまま5〜10分間風乾し、80〜100kVの電子顕微鏡で分解能0.2nm、倍率100,000倍で観察します。
    12. グリッドは乾燥した収納ボックスに保管して、長期保管してください。

4. 骨髄由来樹状細胞の作製

注:この手順は、活発な増殖および分化能力を持つ堅牢な造血システムを特徴とする若いマウスを使用して実行する必要があります。対照的に、高齢のマウスは、造血機能の低下、幹細胞の予備力の減少、ニッチ相互作用の変化、および病原体や免疫老化などの加齢に伴う変化に対する長期的な免疫と応答に不可欠な記憶貯蔵庫の発達を示します。

  1. 5〜8週齢の雌のCF-1マウスを施設の倫理ガイドラインに従って安楽死させ、動物の苦痛を最小限に抑えます。
  2. マウスを組織培養フードに入れる前に、マウスにエタノールをスプレーします。
    注:次の手順は、滅菌条件下で実行する必要があります。
  3. マウスを解剖ボードの仰臥位に置きます。鉗子と解剖ハサミを使用して、尿道の上に垂直の「T」字切開を行い、腹膜を壊したり臓器、特に腸に穴を開けたりしないように注意しながら、下肢の上部まで水平に伸ばします。
  4. 鉗子を使用して、両方の後肢に沿って皮膚を分離し、脚の骨と組織を露出させます。手で、足首から腹部に向かって押している各脚の皮膚を取り除き、皮膚を反対側に引っ張ります。その後、両足に皮膚がなくなります。
    注意: マウスの体を病原体残留物袋に入れて廃棄します。
  5. はさみと鉗子を使用して、大腿骨と脛骨を慎重に取り除き、破損を防ぎます。各骨の先端を鉗子で固定し、腱を切って骨の周りの筋膜を取り除きます。ペーパーナプキンで筋肉組織を完全に洗浄します。
  6. 各骨が除去されたら、5%FBS、100 U / mlペニシリン、100 U / mLストレプトマイシン、および10 μg / mLゲンタマイシンを補充したRPMI培地で調製した2 mLの完全な培地を含む滅菌50 mLチューブに入れて、破片を取り除きます。.続いて、培地を吸引して廃棄し、骨を70%エタノールで5分間2回洗浄します。
  7. 骨を滅菌ペトリ皿に移します。
  8. 鋭利な解剖ハサミを使用して2つの骨端を切り取り、骨髄細胞にアクセスします。
  9. 完全な培地が入った20mLシリンジに取り付けられた25Gの針を使用して、4つの骨のそれぞれから骨髄細胞を滅菌シャーレに慎重に洗い流します。骨髄が抽出されるにつれて、骨はより透明になります。
    注:2つの大腿骨と脛骨から骨髄細胞を溶出するには、20 mLの完全培地容量で十分です。
  10. ピペッティングにより溶出した骨髄と培地を穏やかに均質化し、骨結合組織と細胞のしこりを取り除きます。その後、サンプルを滅菌済みの50 mLコニカルチューブに移し、細胞を滅菌済みの70 μmポリプロピレン製セルストレーナーに通して、結合組織と骨の破片を取り除きます。
  11. 細胞を450 x g で4°Cで7分間遠心分離します。 上清を慎重に取り除いて廃棄し、ペレットがチューブ壁に付着したままであることを確認します。
  12. 細胞を室温(RT)で1分間インキュベートした後、500 μLの赤血球(RBC)溶解バッファーに再懸濁します。3 mLの完全培地を加えて溶解バッファーを中和します。
  13. 細胞を450 x g で4°Cで7分間遠心分離します。 上清を捨て、ペレットを5 mLの完全培地に再懸濁します。
  14. 細胞懸濁液を滅菌済みの70 μmポリプロピレン製セルストレーナーに通し、滅菌済みの50 mLコニカルチューブに通して、溶解した赤血球から細胞凝集体を除去します。
  15. 血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
  16. 300 ng/mLの組換えマウスFms関連チロシンキナーゼ3リガンド(Flt3L)を培地に加えます。
  17. マルチウェルプレートに1 x 106 細胞/mLの濃度で細胞をプレート化します。
  18. 細胞を37°Cで7日間、加湿雰囲気(5% CO2)でインキュベートします。
    注:細胞が分化して成長している間、細胞を振とうすることは避けて、自然成熟を防ぎます。
  19. 3日目に、各ウェルから1 mLの培地を取り出し(細胞の乱れを避け)、1 mLの予熱済み新鮮完全培地に1 mLに150 ng/mLの組換えマウスFlt3Lを補充します。

5. 骨髄由来樹状細胞とE. granulosusの細胞外小胞との相互作用

  1. 細胞外小胞膜染色
    1. 手順2.10で保管したsEVを解凍し、氷上に置きます。
    2. 精製したsEV10 μLを10 μLの標識ビヒクル(希釈剤C)に再懸濁します。
    3. 20 μLの2x PKH26色素溶液を添加して、最終濃度を2 μMにします。ピペットで穏やかに混合し、暗所で37°Cで35分間インキュベートします。
      注:2x PKH26色素溶液(4 μM)は、染色の直前に0.5 μLのPKH26エタノール色素溶液を125 μLの希釈剤Cに加えて調製する必要があります。
    4. インキュベーション中は3〜5分ごとに穏やかに混合し、均一な染色を確保します。
    5. BSA 1%を40 μL加え、室温で10分間インキュベートして染色プロセスを停止します。
    6. sEVを1mLのPBSで洗浄し、100,000 x g で4°Cで1時間遠心分離して、余分な色素を除去します。
      注:ローターのkファクターは103です。
    7. ステップ2.7に記載されているプロトコルに従って、ペレットを90 μLのPBSに再懸濁します。
  2. E. granulosusの細胞外小胞によるマウス骨髄由来樹状細胞の刺激
    1. 培養プレートウェルから骨髄由来樹状細胞(BMDC)を採取し、1.5 mLチューブに移します。
      注:細胞の自発的な成熟を避けるために、慎重に取り扱ってください。
    2. 培地を450 x g で5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。
      注:遠心分離から上清を予約して、その後のフローサイトメトリー分析ステップで細胞を再播種します。
    3. フローサイトメトリー解析のために、ステップ2.10の未染色sEV30 μLにBMDCを再懸濁し、ステップ5.1.7のPBS含有染色sEV90 μLに再懸濁します。共焦点顕微鏡用。5% CO2を含む加湿雰囲気下で37°Cで30分間インキュベートします。サンプルを10分ごとに穏やかに混合します。
      注:BMDCとsEV間の効果的な接触を確保するため、インキュベーションの最初の30分間は、1.5 mLチューブを使用して最小限の容量で実施する必要があります。
    4. 共焦点顕微鏡法では、24ウェルプレートにセットしたアルシアンブルー処理ガラスカバースリップ(直径12 mm)に細胞を移します。5 % CO2 の加湿チャンバー内で 37 °C でさらに 30 分間インキュベートします。
      注:アルシアンブルー処理は、カバーガラスに正電荷を付与し、BMDCの負に帯電した原形質膜の接着を促進します。
      1. カバースリップを準備するには、ろ過した1%アルシアンブルー8 GX染料に浸し、沸騰させずに電子レンジで1〜2分間加熱します。それらを熱い溶液で10分間インキュベートし、2〜3分ごとに渦巻かせます。
      2. 次に、カバーガラスを脱イオン蒸留水で洗って余分なアルシアンブルーを取り除き、ペーパータオルで乾かします。最後に、カバースリップをオートクレーブし、使用するまで滅菌状態で保管します。
    5. フローサイトメトリー解析では、BMDCs-sEVを採取したのと同じウェルに戻し(ステップ5.2.1を参照)、ステップ5.2.2で予約した上清を添加し、5% CO2を含む加湿雰囲気で37°Cで18時間インキュベートします。
      注:収集後の残りの細胞の乾燥を防ぐために、約500μLの培地をウェルに残します。
    6. ポジティブコントロールとネガティブコントロールを使用して、BMDCの成熟を評価します。ポジティブコントロールとして、100 ng/mLのリポ多糖(LPS)で細胞を18時間刺激します。エンドサイトーシスのネガティブコントロールのためには、BMDCをsEVと4°Cでインキュベートします。また、刺激を受けない樹状細胞制御も含まれる。
  3. E. granulosus由来の細胞外小胞の共焦点顕微鏡法は、骨髄由来樹状細胞によって捕捉され、内在化されました。
    1. ステップ5.2.4で説明したインキュベーション期間が完了したら、PBSを吸引してカバースリップから廃棄します。
    2. カバーガラス上に100 μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を添加してBMDCを固定し、室温で10分間インキュベートします。
      注意: ボリュームがカバーガラスの表面張力を維持していることを確認してください。
    3. PFAを吸引して廃棄し、PBS-BSA 2%でカバーガラスを3回洗浄します。
    4. 1/100に希釈した抗MHCクラスII-FITC抗体を含むPBS100 μLを加え、暗所でRTで1時間インキュベートします。
    5. 抗体溶液を吸引して廃棄し、カバーガラスをPBS-BSA 2%で3回洗浄します。
    6. 50 ng/mL DAPIを100 μL加え、湿式チャンバー内で室温で30分間インキュベートして、核を対比染色します。
    7. 染料溶液を吸引して廃棄し、カバーガラスをPBS-BSA 2%で3回洗浄します。
    8. カーブした細いポイント鉗子でカバースリップをはがし、ペーパータオルで乾かして余分な液体を取り除きます。
    9. カバーガラスを下向きにして、ポリビニルアルコールとグリセロールからなる封入剤を使用してスライドガラスに取り付けます。37°Cで2時間乾燥させるか、暗闇の中で4°Cで一晩乾燥させます。
    10. カバーガラスとスライドガラスの間の気泡を取り除くには、鉗子でカバーガラスをそっと押し下げます。
    11. FITCが485/538 nm、DAPIが358/461 nm、PKH26が551/567 nmの励起/発光波長の60倍油浸対物レンズを使用して、マウントされたサンプルを共焦点顕微鏡で観察します。
  4. フローサイトメトリーによる細胞外小胞刺激骨髄由来樹状細胞の表現型評価
    1. ステップ5.2.5で説明したインキュベーション期間の後、ピペットで培地を数回上下に洗い流してBMDCを回収します。
    2. 培地含有BMDCを回収し、1.5mLチューブに入れます。
    3. 450 x g で4°Cで5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。
      注:オプションで、サイトカイン分泌を分析するには、ピペットで上清を除去し、新しい1.5mLチューブに移し、さらに酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)テストのために-20°Cで保存します。
    4. フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、アロフィコシアニン(APC)、またはフィコエリスリン標識モノクローナル抗体を含むPBS100 μLにBMDCを再懸濁し、CD11c、CD40、CD80、CD86、MHCクラスI、およびMHCクラスIIに向けられ、暗所で4°Cで15分間インキュベートします。
    5. BMDCをPBSで洗浄し、4°Cで450 × g で5分間遠心分離します。
    6. BMDCを500 μLの1% PFAに再懸濁して固定し、フローサイトメーターで取得するまで4°Cで保存します。

結果

図1に、E. granulosus幼虫期の純粋培養を維持するための主なステップ、sEVの単離と特性評価、およびマウス樹状細胞によるそれらの取り込みをまとめたフローチャートが示されています。E. granulosus protoscolecesおよびmetacestodesから高いsEV産生を達成するために、以前に実験室で開発されたin vitro培養法を採用して、研究対象の寄?...

ディスカッション

寄生虫の培養、寄生虫由来のsEVの単離、骨髄からの樹状細胞の分化、およびこれらの細胞によるsEVの取り込みの解析のためのプロトコールワークフローを 図1に示します。その目的は、全体としてまたは別々に実施される可能性のある各プロトコルセクションを詳細に説明し、方法論の実施を保証するための主要な考慮事項を強調することでし?...

開示事項

著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

著者はLicを認めています。セシリア・グティエレス・アイエスタ(Servicio de Microscopía Electrónica, CONICET, Bahía Blanca, Argentina)とLic.レオナルド・セチとリック。エリアナ・マザ(INIFTA、ラプラタ国立大学、アルゼンチン)は、透過型電子顕微鏡法と動的光散乱に関する技術支援をそれぞれ担当しました。また、ドラにも感謝しています。グラシエラサレルノ、ドラ。Corina Berón氏とGonzalo Caló博士は、アルゼンチンのINBIOTEC-CONICET-FIBAで超遠心分離機を使用しました。著者はLicに感謝します。ケリー(SENASA、マルデルプラタ、アルゼンチン)とLic。H. Núnez García (CONICET, Universidad Nacional de Mar del Plata, Argentina) はマウスの福祉評価への協力に対して、また Med. Vet. J. Reyno, Med. Vet. S. Gonzalez and Med. Vet L. Netti は寄生虫物質の入手に貢献していただきました。この研究は、実験費、試薬費、機器費を含め、ANPCyTが資金提供したPICT 2020 No. 1651の支援を受けました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL tubesHensoN14059
24-well plate JetBiofilCAP011024Polystyrene, flat bottom, Sterile
6-well plate  Henso Medical Co. Ltd.N14221Flat-shape bottom, PS material, Sterile
70 mm polypropylene cell strainerBiologix Group Limited15-1070Sterile
Alcian blue 8 GX dye Santa Cruzsc-214517B
Automatic CO2 incubatorNuarireUN-5100E/G DH
Bovine Serum AlbuminWiener lab1443151
CD11c Monoclonal antibody-PECy5   100 µgeBioscience15-0114-82clone (N418)
CD40 Monoclonal antibody-FITC 100 µgeBioscience11-0402-82clone (HM40-3)
CD80 Monoclonal antibody-APC 100 µgeBioscience17-0801-82clone (16-10A-1)
CD86 Monoclonal antibody-FITC  100 µgeBioscience11-0862-82clone (GL-1)
CentrifugeThermo ScientificIEC CL31R Multispeed
Confocal MicroscopeNikonNikon Confocal Microscope C1
Conical tubes 15 mL dia.17 x 120 mmCitotest4610-1865
DAPISigma107K4034
D-GlucoseMerk1.78343
Dimethyl Sulfoxide Anedra6646
Fetal Bovine Serum 500 mLSigma-Aldrich  12352207
Flow Cytometry SystemBD BiosciencesBD FACSCanto™ II
Folded Capillary Zeta Cell Malvern PanalyticalDTS1070
Gentamicin sulfate saltSigmaG1264
Glutaraldehyde solutionFluka49630
HepesGibco11344041
Hypodermic  needle 21 G x 1"25/8WeigaoSterile
Hypodermic  needle 25 G x 5/8"WeigaoSterile
Inverted microscope LeicaDMIL LED Fluo 
KetamineHolliday
Lipopolysaccharide  5 mgInvitrogentlrl-rslpsLPS from the Gram-negative bacteria E. coli K12 . TLR2/4 Agonists
Loperamide hydrochlorideSigma-Aldrich5.08162
Medium 199 Gibco11150059
Methylene BlueAnedra6337
MHC class I (H2kb) Monoclonal antibody-PE 100 µgeBioscience12-5958-82clone (AF6-88.5.5.3)
MHC class II (IA/IE) Monoclonal antibody-FITC  100 µgeBioscience11-5321-82clone (M5/114.15.2)
MicroscopeOlympusCX31
Mouse recombinant murine Flt3L.PrepoTech250-31L-10UG
NanodropThermo ScientificND-One
ParaformaldehydeAgar ScientificR1018
Penicillin G sodium saltSigmaP3032-10MU
PKH26Sigma-AldrichMINI26
Potassium Phosphate MonobasicTimperFor Phosphate Buffered Saline (PBS)
RBC lysis buffer 100 mLRoche11814389001
RPMI medium  1640 1x 500 mLSigma-Aldrich (Gibco)11875093
Sodium Cacodylate  Sigma-AldrichC0250
Sodium ChlorideAnedra7647-14-5For Phosphate Buffered Saline (PBS)
Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) p. a.Biopack1639.07For Phosphate Buffered Saline (PBS)
Streptomycin sulfate saltSigmaS9137
Syringe 10 mLBremenSterile
Thickwall polycarbonate tubesBeckman Coulter13 x 55 mm , nominal capacity 4 mL
Transmission Electron MicroscopeJeolJEOL JSM 100CX II
UltracentrifugeBeckmanOptima LE-80k 90 Ti rotor
XylazineRichmond
Zetasizer Nano Malvern Nano ZSizer-ZEN3600To perform Dynamic Light scattering and zeta potential measurements

参考文献

  1. Wen, H. et al. Echinococcosis: advances in the 21st century. Clin Microbiol Rev. 32 (2), e00075-18 (2019).
  2. Geary, T. G., Thompson, D. P. Development of antiparasitic drugs in the 21st century. Vet Parasitol. 115 (2), 167–184 (2003).
  3. Drurey, C., Maizels, R. M. Helminth extracellular vesicles: Interactions with the host immune system. Mol Immunol. 137, 124–133 (2021).
  4. Welsh, J. A. et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J. Extracell Vesicles. 13 (2), e12404 (2024).
  5. Cresswell, P. Antigen processing and presentation. Immunol Rev. 207, 5–7 (2005).
  6. Buzas, E. I. The roles of extracellular vesicles in the immune system. Nat Rev Immunol. 23 (4), 236–250 (2023).
  7. Bennett, A. P. S., de la Torre-Escudero, E., Oliver, N. A. M., Huson, K. M., Robinson, M. W. The cellular and molecular origins of extracellular vesicles released by the helminth pathogen Fasciola hepatica. Int J Parasitol. 50 (9), 671–683 (2020).
  8. Drurey, C., Coakley, G., Maizels, R. M. Extracellular vesicles: new targets for vaccines against helminth parasites. Int J Parasitol. 50 (9), 623–633 (2020).
  9. Nicolao, M. C. et al. Characterization of protein cargo of Echinococcus granulosus extracellular vesicles in drug response and its influence on immune response. Parasit Vectors. 16 (1), 255 (2023).
  10. Sánchez-López, C.M., Trelis, M., Bernal, D., Marcilla, A. Overview of the interaction of helminth extracellular vesicles with the host and their potential functions and biological applications. Mol Immunol. 134, 228–235 (2021).
  11. Nicolao, M. C., Rodriguez, R. C., Cumino, A. C. Extracellular vesicles from Echinococcus granulosus larval stage: Isolation, characterization and uptake by dendritic cells. PLoS Negl Trop Dis. 13 (1), e0007032 (2019).
  12. Kuipers, M. E. et al. DC-SIGN mediated internalisation of glycosylated extracellular vesicles from Schistosoma mansoni increases activation of monocyte-derived dendritic cells. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1753420 (2020).
  13. Murphy, A. et al. Fasciola hepatica extracellular vesicles isolated from excretory-secretory products using a gravity flow method modulate dendritic cell phenotype and activity. PLoS Negl Trop Dis. 14 (9), e0008626 (2020).
  14. Ricciardi, A. et al. Extracellular vesicles released from the filarial parasite Brugia malayi downregulate the host mTOR pathway. PLoS Negl Trop Dis. 15 (1), e0008884 (2021).
  15. Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nat Protoc. 18 (5), 1462–1487 (2023).
  16. Brezgin, S. et al. Basic guide for approaching drug delivery with extracellular vesicles. Int J Mol Sci. 25 (19), 10401 (2024).
  17. Pinheiro, A. A. et al. Potential of extracellular vesicles in the pathogenesis, diagnosis, and therapy for parasitic diseases. J Extracell Vesicles. 13 (8), e12496 (2024).
  18. Barnadas-Carceller, B., Del Portillo, H. A., Fernandez-Becerra, C. Extracellular vesicles as biomarkers in parasitic disease diagnosis. Curr Top Membr. 94, 187–223 (2024).
  19. Nicolao, M. C., Denegri, G. M., Carcamo, J. G., Cumino, A. C. P-glycoprotein expression and pharmacological modulation in larval stages of Echinococcus granulosus. Parasitol Int. 63 (1), 1–8 (2014).
  20. Nicolao, M. C., Cumino, A. C. Biochemical and molecular characterization of the calcineurin in Echinococcus granulosus larval stages. Acta Trop. 146, 141–151 (2015).
  21. Savina, A., Furlan, M., Vidal, M., Colombo, M. I. Exosome release is regulated by a calcium-dependent mechanism in K562 cells. J Biol Chem. 278 (22), 20083–20090 (2003).
  22. Ambattu, L. A. et al. High frequency acoustic cell stimulation promotes exosome generation regulated by a calcium-dependent mechanism. Commun Biol. 3 (1), 553 (2020).
  23. White, R. et al. Special considerations for studies of extracellular vesicles from parasitic helminths: A community-led roadmap to increase rigour and reproducibility. J Extracell Vesicles. 12 (1), e12298 (2023).
  24. Casado, N., Rodriguez-Caabeiro, F., Hernandez, S. In vitro survival of Echinococcus granulosus protoscolices in several media, at +4 degrees C and +37 degrees C. Z Parasitenkd. 72 (2), 273–278 (1986).
  25. Casado, N., Rodriguez-Caabeiro, F., Jiménez, A., Criado, A., de Armas, C. In vitro effects of levamisole and ivermectin against Echinococcus granulosus protoscoleces. Int J Parasitol. 19 (8), 945–947 (1989).
  26. Al-Lamki, R. S., Bradley, J. R., Pober, J. S. Human organ culture: updating the approach to bridge the gap from in vitro to in vivo in inflammation, cancer, and stem cell biology. Front Med. 4, 148 (2017).
  27. Rodriguez-Caabeiro, F., Casado, N.. Evidence of in vitro germinal layer development in Echinococcus granulosus cysts. Parasitol Res.74 (6),558–562 (1988).
  28. Loos, J. A., Cumino, A. C. In vitro anti-echinococcal and metabolic effects of metformin involve activation of AMP-activated protein kinase in larval stages of Echinococcus granulosus. PLoS One. 10 (5), e0126009 (2015).
  29. Erwin, N., Serafim, M.F., He, M. Enhancing the cellular production of extracellular vesicles for developing therapeutic applications. Phar. Res. 40 (4), 833–853 (2023).
  30. Sako, Y. et al. Identification of a novel small molecule that enhances the release of extracellular vesicles with immunostimulatory potency via induction of calcium influx. ACS Chem Biol. 18 (4), 982–993 (2023).
  31. He, L.P., Mears, D., Atwater, I., Rojas, E., Cleemann, L. Loperamide mobilizes intracellular Ca2+ stores in insulin-secreting HIT-T15 cells. Br J Pharmacol. 139 (2), 351–361 (2003).
  32. Dalton, J.P., Skelly, P., Halton, D. W. Role of the tegument and gut in nutrient uptake by parasitic platyhelminths. Can J Zool. 82 (2), 211–232 (2004).
  33. Dos Santos, G. B. et al. Excretory/secretory products in the Echinococcus granulosus metacestode: is the intermediate host complacent with infection caused by the larval form of the parasite?. Int J Parasitol. 46 (13–14), 843–856 (2016).
  34. Siles-Lucas, M. et al. Isolation and characterization of exosomes derived from fertile sheep hydatid cysts. Vet Parasitol. 236, 22–33 (2017).
  35. Yang, J. et al. Identification of different extracellular vesicles in the hydatid fluid of Echinococcus granulosus and immunomodulatory effects of 110 K EVs on sheep PBMCs. Front Immunol. 12, 602717 (2021).
  36. Khosravi, M. et al. Characterisation of extracellular vesicles isolated from hydatid cyst fluid and evaluation of immunomodulatory effects on human monocytes. J Cell Mol Med. 27 (17), 2614–2625 (2023).
  37. Sotillo, J. et al. The protein and microRNA cargo of extracellular vesicles from parasitic helminths–current status and research priorities. Int J Parasitol. 50 (9), 635–645 (2020).
  38. Kuipers, M. E. et al. Optimized protocol for the isolation of extracellular vesicles from the parasitic worm Schistosoma mansoni with improved purity, concentration, and yield. J Immunol Res. 2022 (1), 5473763 (2022).
  39. Fernandez-Becerra, C. et al. Guidelines for the purification and characterization of extracellular vesicles of parasites. J Extracell Biol. 2 (10), e117 (2023).
  40. Chaiyadet, S. et al. Silencing of Opisthorchis viverrini tetraspanin gene expression results in reduced secretion of extracellular vesicles. Front Cell Infect Microbiol. 12, 827521 (2022).
  41. Théry, C. et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  42. Szatanek, R. et al. The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization. Int J Mol Sci. 18 (6), 1153 (2017).
  43. Blundell, E. L. C. J., Mayne, L. J., Billinge, E. R., Platt, M. Emergence of tunable resistive pulse sensing as a biosensor. Anal Methods. 7 (17), 7055–7066 (2015).
  44. Vucetic, A., Filho, A., Dong, G., Olivier, M. Isolation of extracellular vesicles from Leishmania spp. Methods Mol Biol. 555–574 (2020).
  45. Caputo, F. et al. Measuring particle size distribution and mass concentration of nanoplastics and microplastics: Addressing some analytical challenges in the submicron size range. J Colloid Interface Sci. 588, 401–417 (2021).
  46. Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nat Protoc. 16 (3),1548–1580 (2021).
  47. Trombetta, E. S., Mellman, I. The cell biological basis of antigen presentation in vitro and in vivo. Ann Rev Immunol. 23 (1), 975–1028 (2005).
  48. Hammer, G. E., Ma, A. Molecular control of state dendritic cell maturation and immuno homeostasis. Ann Rev Immunol. 31 (1), 743–791 (2013).
  49. Weigel, B. J. et al. Comparative analysis of murine marrow–derived dendritic cells generated by Flt3L or GM-CSF/IL-4 and matured with immune stimulatory agents on the in vivo induction of antileukemia responses. Blood. 100 (12), 4169–4176 (2002).
  50. March, N. et al. Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand. Cancer Res. 60, 3239–3246 (2000).
  51. Heath, W. R. et al. Cross-presentation, dendritic cell subsets, and the generation of immunity to cellular antigens. Immunol Rev. 199 (1), 9–26 (2004).
  52. Naik, S. et al. Cutting edge: generation of splenic CD8+ and CD8− dendritic cell equivalents in Fms-like tyrosine kinase 3 ligand bone marrow cultures. J Immunol. 174 (11), 6592–6597 (2005).
  53. Sauter, M. et al. Protocol to isolate and analyze mouse bone marrow derived dendritic cells (BMDC). STAR Protoc. 3 (3), 101664 (2022).
  54. Helft, J. et al. GM-CSF mouse bone marrow cultures comprise a heterogeneous population of CD11c(+) MHCII(+) macrophages and dendritic cells. Immunity. 42 (6), 1197–1211 (2015).
  55. Borup, A. et al. Comparison of separation methods for immunomodulatory extracellular vesicles from helminths. J Extracell Biol. 1 (5), e41 (2022).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

217 Echinococcus granulosus EV

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved