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요약

여기에서는 체외 배양 조건, 격리 및 Echinococcus granulosus의 세포외 소포체(EV) 생성 증가에 대해 설명합니다. 소형 EV는 동적 광 산란 및 투과 전자 현미경이 특징이었습니다. 골수 유래 수지상 세포의 흡수와 표현형 조절은 컨포칼 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 연구되었습니다.

초록

세스토데스에 의한 세포외 소포체의 분비는 기생충 사이뿐만 아니라 숙주 조직과의 세포 통신을 가능하게 하는 데 중요합니다. 특히, 작은 세포외 소포체(sEV)는 숙주 면역 조절과 기생충 생존에 중요한 자연 항원을 전달하는 나노 운반체 역할을 합니다. 이 기사에서는 Echinococcus granulosus 의 유충 단계 배양에서 sEV를 분리하는 단계별 프로토콜을 제시하고 in vitro 배양 1주일 후 성숙 과정에서 접착력 및 항원 제시 능력을 획득하는 쥐 골수에서 얻은 수지상 세포에 의한 흡수를 분석합니다. 이 기사는 동적 광 산란 및 투과 전자 현미경의 병렬 분석과 함께 초원심분리를 사용하여 sEV를 생성, 정제 및 정량화하기 위한 포괄적인 정보를 제공합니다. 또한 Flt3L을 사용하여 마우스 골수 세포를 분리 및 배양하고 수지상 세포로 분화를 유도하기 위한 상세한 실험 프로토콜이 요약되어 있습니다. 이러한 수지상 세포는 미접촉 T 세포에 항원을 제공하여 생체 내 면역 반응 유형을 조절할 수 있습니다. 따라서 컨포칼 현미경 검사 및 유세포 분석 분석을 포함한 대체 프로토콜은 이전에 기생 sEV에 노출된 수지상 세포의 획득된 성숙 표현형을 확인하기 위해 제안됩니다. 마지막으로, 설명된 프로토콜은 기생충 in vitro 배양을 수행하고, 세포 외 소포를 분리하고, 골수 유래 수지상 세포 배양을 생성하고, 이러한 세포로 흡수 분석을 수행하기 위해 전체 또는 개별 부분에 적용될 수 있다는 점에 주목할 가치가 있습니다.

서문

에키노코커스 그래뉼로수스(Echinococcus granulosus )는 낭포성 에키노코코시스(cystic echinococcosis)로 알려진 장기 감염을 일으키는 인수공통감염감염균(zoonotic parasitic helminth)이다1. 가축과 인간과 같은 중간 숙주에서 기생충 감염은 주로 간과 폐에 영향을 미치며, 유충 단계는 원형(유충 자체)을 포함하는 액체로 채워진 낭종 또는 메타세스토드로 발달합니다. 모든 cestodes와 마찬가지로 이 기생충은 소화 기관과 배설 기관이 모두 없기 때문에 활성 내포성 및 외세포 세포 과정을 진화시켜 대사 산물의 흡수 및 배설뿐만 아니라 세포 외 소포체의 방출을 조절합니다2,3. 세포외 소포체(EV)는 분명히 모든 세포 유형에서 분비되는 지질 이중층으로 둘러싸인 입자입니다. 특히, 생물발생 기원에 관계없이 200nm보다 작은 EV로 정의되는 작은 세포외 소포체(sEV)4는 세포 간 면역 매개체로 작용할 수 있습니다. 이 기능은 생존을 보장하기 위해 숙주 면역조절에 의존하는 기생충에서 특히 중요합니다3. 면역 조작은 숙주 수지상 세포에 의한 sEV의 흡수를 통해 이루어지며, 숙주 수지상 세포는 생체 내에서 미접촉 T 세포를 활성화하고 이러한 기생충에 의한 만성 감염으로 이어질 수 있는 적응 면역 반응을 시작할 수 있는 유일한 세포입니다. 선천면역계의 전문 항원 제시 세포인 수지상 세포는 항원 펩타이드를 주요 조직적합성 복합체 클래스 I 및 클래스 II(MHC I 및 MHC II)에 처리 및 로드하고 독점적인 미접촉 T 세포 프라이밍(각각 CD8+ 및 CD4+ T 세포)을 위해 멤브레인에 표시합니다5. 다음 수지상 세포는 공동 자극 마커 CD80/CD86 및 CD40 및 MHC-II의 발현 유도에 의해 성숙을 유도하고 외부 항원을 인식하면 말초 조직에서 2차 림프 기관으로 이동하여 독점적인 미접촉 T 세포 프라이밍을 위해 로드합니다6. 따라서 이 프로토콜의 전반적인 목표는 기생충-숙주 의사소통을 현실적인 방식으로 연구하고, 숙주 면역 세포에 도달했을 때 감염 발병과 만성 기생충 질환의 진행에 영향을 미치는 sEV 형태의 기생충 구성 요소의 포장 및 전달을 분석하는 것입니다.

sEV 연구를 통해 기생충-호스트 인터페이스 분석을 다루면 몇 가지 이점이 있습니다. 첫째, 편형동물의 바깥쪽 덮개인 피막(tegument)은 기생충과 숙주 사이의 주요 교차점을 구성하는 이중막 구조로, 이 구조에서 sEV가 쉽게 생성되거나 침투할 수 있도록 합니다7. 둘째, sEV는 기생충 생애주기의 모든 단계에서 단백질 항원으로 가득 차 있으며, 이는 숙주 면역 체계가 기생충 감염 중에 항원을 샘플링하는 자연스러운 방법을 나타냅니다 8,9. 기생충 sEV는 생물학적 생산, 정제의 용이성(조직 파괴 또는 단백질 분획이 필요 없음) 및 숙주 세포와의 직접적인 상호 작용으로 인해 기생충-숙주 상호 작용의 생체 내 조건을 시뮬레이션하기 위한 체외 실험을 개발할 수 있습니다. 마지막으로, sEV는 숙주 세포에 의해 식세포화되거나 내재화될 수 있는 기생 구조를 가질 수 있는 가능성을 나타내며, 특히 엔시스테드 웜의 경우 전체 기생충에 대해 그렇게 할 수 없다는 것을 극복합니다.

앞서 언급한 장점과 기생충이 생존 전략으로 숙주 면역 체계를 조작하는 것으로 추정되는 만성 질환이 널리 퍼져 있다는 사실을 고려할 때, 기생충 유래 EV의 분리 및 수지상 세포와의 상호 작용에 대한 연구는 이러한 면역 조절을 탐구하기 위한 귀중한 프레임워크를 제공합니다10. 이러한 의미에서, 주혈흡충(Schistosoma mansoni), 파시올라 헤파티카(Fasciola hepatica), 브루지아 말레이(Brugia malayi), E. granulosus와 같은 선충 및 편충충류를 포함한 기생충으로부터 EV의 내재화는 수지상 세포의 성숙 및 활성화를 유도하는 것으로 설명되었다 9,11,12,13,14,15.

기생충 유래 EV의 분리는 면역학적 상호 작용에 대한 연구를 가능하게 하여 잠재적으로 알레르기 또는 자가면역 질환에 대한 보호 백신 또는 면역 치료제의 개발로 이어질 수 있을 뿐만 아니라 다른 생물학적 상호 작용 및 기능의 탐색을 용이하게 합니다 8,16,17. 이러한 맥락에서 기생충 감염의 자연사에서 중요한 역할을 하는 EV는 기생충 발달 및 특정 숙주 세포와의 상호 작용을 조사하는 데 활용될 수 있습니다. 또한, 그들은 기생충 질병의 진단, 치료 반응 모니터링, 기생충 감염의 통제 및 관리에 기여하기 위한 조기 또는 차등 바이오마커로서 잠재적인 응용 분야를 가질 수 있습니다17,18.

또한, 앞서 입증 된 바와 같이, E. granulosus의 유충 단계는 세포질 칼슘 농도의 변화에 민감하며, 이는 기생충 생존력에 중요한 역할을하는 것 외에도 exocytosis rate19 , 20 를 제어합니다. 이러한 맥락에서 세포 내 칼슘 상승이 EV 방출을 향상시킨다는 사실을 알고 있기 때문에 세포 내 칼슘 강화제를 로페라마이드로 사용하는 것은 EV 수를 늘리는 중요한 전략이 될 수 있습니다. 이 접근 방식은 화물 및 기능 분석을 위해 적절한 양의 EV를 생성하기 위해 많은 인구가 필요한 셀룰러 시스템에 특히 흥미롭습니다 11,21,22. 현재 프로토콜(그림 1)은 E. granulosus 유충 단계의 순수 배양을 얻는 방법과 sEV 생산을 향상시키는 조건을 자세히 설명합니다. 또한 이러한 소포의 분리 및 특성화를 위한 작업 흐름과 숙주 면역 체계 조절의 초기 연구에서 필수적인 단계인 쥐 수지상 세포에 의한 흡수에 대해 설명합니다.

프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 Mar del Plata의 정밀 및 자연 과학 학부 동물 실험 위원회에서 평가하고 승인했습니다(허가 번호: RD544-2020; RD624-625-2021; RD80-2022). 이 프로토콜에서 NIH가 발행한 "실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 가이드"와 SENASA(National Health Service and Food Quality)의 지침에 따라 쥐는 안락사되었습니다.

1. 에키노코쿠스 유충 단계 재배

참고: 모든 절차는 무균 조건에서 수행되었습니다.

  1. E. granulosus protoscoleces obtention
    1. 감염된 소의 폐 또는 간에서 추출한 수액 부분 21G과 주사기 10mL를 주사기로 흡인하여 낭종을 줄입니다(그림 2A).
      참고: 감염된 폐와 간은 도살장에서 일상적인 도축을 위해 제공된 소에서 나옵니다. 4°C에서 보관해야 하며 도축 후 24시간 이내에 처리해야 합니다.
    2. 가위로 낭종을 열고 집게를 사용하여 낭종에서 층층과 생식층을 제거합니다. 남아있는 hydatid 액체와 함께 멸균 된 페트리 접시에 놓습니다 (그림 2B, C).
      참고: 이 시점에서는 protoscoleces 및 brood capsules의 품질을 평가하기 위해 도립 현미경으로 페트리 접시를 관찰하는 것이 좋습니다. 프로토스코엘레스의 50% 이상이 붕괴된 낭종의 생물학적 물질을 모으지 마십시오.
    3. 항생제(100μg/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신, 100μg/mL 겐타마이신 100μg/mL)를 보충한 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 층을 세척하여 프로토스코세포를 제거합니다.
      참고: 모든 세척은 항생제가 보충된 PBS로 수행됩니다.
    4. 파스퇴르 피펫을 사용하여 protoscolex 현탁액을 멸균 유리 Khan 튜브로 옮깁니다.
    5. 죽은 기생충을 제거하기 위해 파스퇴르 피펫을 사용하여 4°C에서 보충된 PBS로 프로토스코를 세척합니다. protoscolex 방출을 촉진하는 부화 캡슐을 파괴하기 위해 현탁액을 격렬하게 재현합니다. protoscoleces가 튜브 바닥에 1-2분 동안 정착하도록 합니다. 그런 다음 죽은 protoscoleces를 포함하는 상등액을 버립니다.
      참고: 밀도의 차이로 인해 살아있는 protoscoleces는 죽은 기생충보다 더 빨리 정착합니다.
    6. 모든 죽거나 떠다니는 프로토스코레스가 제거될 때까지 세척 과정을 반복합니다.
      참고: 죽은 기생충은 모두 같은 속도로 정착할 때 제거됩니다.
    7. 메틸렌 배제 테스트를 사용하여 프로토스코이스의 생존 가능성을 측정합니다.
      1. 세척 된 프로토 콜레스를 피펫으로 다시 매달아 슬라이드에 한 방울 떨어뜨립니다. 0.1mg/mL 메틸렌 블루 한 방울을 넣고 커버슬립으로 덮습니다. 2-3분 동안 기다렸다가 현미경으로 관찰하십시오.
      2. 살아있는(염색되지 않은) 프로토스콜레스와 죽은(푸른 염색된) 프로토스콜레스의 총 수를 세고, 생존 가능한 프로토스콜레스의 비율을 계산한다(그림 2D 및 삽입).
        참고: 배양을 확립하기 전에 protoscolece의 생존 가능성은 약 98%가 되어야 합니다. 염색 시간이 길어지면 살아있는 기생충이 염색될 수 있으므로 염색 시간은 10분을 초과해서는 안 됩니다.
  2. E. granulosus metacestodes obtention
    1. 0.5mL의 보충된 PBS에 현탁된 1500개의 프로토스코± 1500개의 프로토스코레스(protocolex 펠릿 10μL에 해당)로 암컷 CF1 마우스(체중 25 5g)를 복강내 감염시켜 실험적인 2차 하이드라이드 질환을 생성합니다(그림 2E).
      참고: 항생제가 보충된 PBS의 프로토스코시스를 4°C에서 24시간 동안 또는 배양에서 감염 전 3-5일 동안 유지하는 것이 좋습니다.
    2. 메타세스토드는 감염 후 4-6개월 이내에 발생합니다(그림 2F). 이 기간 동안 통제된 실험실 조건(온도 20 ± 1 °C, 12시간 명암/어두움 주기, 물과 음식이 임시로 제공됨)에서 동물을 수용합니다. 낭종이 발달하면 케타민-자일라진(50mg/kg/mouse-5mg/kg/mouse)을 사용하여 생쥐를 마취하고 자궁경부 탈구로 안락사시킵니다.
    3. 70% 알코올로 마우스의 복부 표면을 청소하고 가위와 집게를 사용하여 발달된 메타세스토드를 제거하기 위해 복막강을 외과적으로 엽니다.
    4. metacestodes 질량을 멸균 페트리 접시로 옮깁니다.
      참고: metacestode 종괴는 결합 조직으로 둘러싸인 여러 개의 내부 낭종으로 구성됩니다.
    5. 필요한 경우 겸자를 사용하여 메타세스토드를 덮고 있는 결합 조직을 조심스럽게 제거하여 메타세스토드 종괴에서 낭종을 방출합니다.
      참고: 이 단계는 기생충이 숙주 조직에서 자유롭다는 것을 확인합니다.
    6. 얻어진 메타세스토드를 4°C에서 보충된 PBS로 세척합니다(그림 2G).
  3. E. granulosus protoscoleces 및 metacestodes 재배
    1. 배양 배지를 다음과 같이 준비합니다: 100μg/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신, 100μg/mL 겐타마이신, 4mg/mL 포도당, 50mM Hepes 완충액 pH 7.5 및 배지 199를 추가하여 원하는 최종 부피에 도달하고 반전으로 부드럽게 혼합합니다.
    2. 준비된 배양 배지 5mL를 각 레이튼 튜브로 옮깁니다(그림 2H–I).
    3. 배양 배지에 기생충을 첨가하고 배지를 변경하지 않고 37 ° C에서 5 일 동안 배양합니다. Leighton 튜브를 15° 각도로 배양하여 평평한 표면에 생물학적 물질이 고르게 분포되도록 합니다. 이것은 고무 마개와의 접촉을 방지하면서 배양 배지에 대한 기생충 노출을 극대화합니다.
      참고: 9,000–10,000개의 protoscoleces 또는 50개의 metacestodes(5mm에서 15mm 사이의 직경은 튜브당 10개의 낭종으로 분포됨)를 추가합니다.
    4. 선택적으로, 디메틸 설폭사이드에 16-24시간 동안 용해된 20μM 로페라마이드(치사량 이하 농도)를 기생충 배양 배지에 첨가하여 세포질 칼슘 수준을 증가시키고 E. granulosus의 유충 단계에 의한 EV 방출을 향상시킵니다.
      참고: 세포 내 칼슘 농도의 증가가 EV 생산을 향상시킨다는 점을 감안할 때, 칼슘 항상성에 영향을 미치는 화합물로 기생충을 처리하면 EV 방출이 증가할 것입니다.

2. 세포외 소포 정화

  1. 각 Leighton 튜브에서 기생충 배양 배지를 수집하여 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
    참고: 배양 배지는 첫 번째 원심분리 전 24시간 동안 보관할 수 있으며 소포의 농도 또는 크기 분포에 미치는 영향을 최소화할 수 있습니다. Protoscoleses는 PBS 완충액으로 3회 세척하고 수확하여 1.5mL 튜브에 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
  2. 300 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리기를 하고 피펫을 사용하여 상층액을 새로운 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.
    참고: 이 단계는 죽은 프로토스콜레스를 제거합니다. 각 원심분리 단계 후에는 오염을 방지하기 위해 펠릿 위로 최소 0.5cm의 상층액이 남아 있는지 확인하십시오.
  3. 상층액을 2,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하고 피펫을 사용하여 새 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
    참고: 이 단계는 더 큰 세포 파편을 제거합니다.
  4. 10,000 x g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리기를 사용하여 더 작은 세포 파편을 제거합니다.
  5. 피펫을 사용하여 초원심분리기 로터에 적합한 튜브로 상층액을 옮깁니다. 초원심분리기 로터에 넣기 전에 각 튜브의 한쪽 면에 마커를 표시하십시오. 그런 다음 표시된 면이 위를 향하도록 튜브를 로터에 놓습니다.
    참고: 이 표시는 초원심분리 후 펠릿을 찾기 위한 기준점 역할을 합니다. 튜브는 3/4이 채워야 하고 정확하게 균형을 이루어야 합니다. 따라서 필요한 경우 PBS를 추가합니다. 상등액 부피가 단일 튜브의 용량을 초과하는 경우, 샘플을 여러 개의 튜브로 나누고 재현탁 중에 결합하십시오.
  6. 100,000 x g 에서 4°C에서 1시간 동안 원심분리기를 하고 빠른 동작으로 상층액을 붓습니다. 튜브를 1분 동안 거꾸로 놓으십시오. 이 단계에서는 펠릿이 보이지 않을 수 있습니다.
    알림: 사용된 로터의 k-factor는 103입니다.
  7. 오염 단백질을 제거하기 위해 최소 3mL의 PBS로 펠릿을 세척하십시오. 튜브의 위쪽에서 모든 튜브 면의 바닥까지 여러 번 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 다시 부유시키지만 주로 펠릿이 있을 것으로 예상되는 표시된 면에 부유시킵니다.
    참고: 해당되는 경우, 동일한 상등액에서 파생된 재현탁된 펠릿을 단일 튜브에 풀링합니다.
  8. 100,000 x g 에서 4°C에서 1시간 동안 원심분리기를 하고 빠른 동작으로 상층액을 붓습니다. 튜브를 1분 동안 거꾸로 놓으십시오.
    알림: 사용된 로터의 k-factor는 103입니다.
  9. 2.7단계에서 설명한 프로세스에 따라 펠릿을 30μL의 PBS에 재현탁합니다.
    참고: 이 시점에서, 분비된 sEV의 양을 추정하기 위해 재현탁된 펠릿의 총 단백질 농도를 측정하는 것이 좋습니다. 단백질 농도는 미량 분광 광도계를 사용하여 280nm에서 흡광도를 측정하여 측정할 수 있습니다.
  10. 샘플을 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 세포외 소포체를 -80°C에서 동결합니다.
    참고: 다운스트림 응용 분야에서 소포 무결성을 보존하려면 가능한 한 빨리 재현탁된 펠릿을 동결하고 반복적인 동결-해동 주기를 피하십시오.

3. 고립된 소포의 특성화

  1. 동적 광 산란(DLS)을 사용한 EV 크기 측정
    참고: 동적 광 산란은 유형에 관계없이 복잡한 유체에서 나노 입자의 크기(유체역학적 반경, Rh 기준)와 모양을 평가하기 위한 신뢰할 수 있고 민감한 방법입니다. DLS 및 제타 전위 측정은 633nm에서 He-Ne 단색 레이저 빔을 사용하여 수행되었습니다. 샘플링 당일에 분석이 불가능한 경우, 샘플은 보관 전에 사전 여과된 버퍼에서 동결될 수 있습니다.
    1. 샘플을 해동하고 측정이 수행될 때까지 얼음 위에 보관하십시오.
      참고: 샘플을 동결하면 sEV의 입자 분포 및 무결성에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 동결 및 해동 주기는 피크 높이가 감소하여 LS 신호가 감소할 수 있으므로 피하십시오.
    2. 0.2μm 공극 크기 필터를 통해 DLS에 사용되는 수성 샘플을 필터링합니다.
      참고: LS 실험에서는 측정을 방해할 수 있는 큰 입자와 먼지를 제거하기 위해 모든 용액, 완충액 및 수성 샘플을 필터링하는 것이 필수적입니다.
    3. 사전 여과된 PBS에서 샘플을 1:10 - 1:50으로 희석합니다.
    4. 시료 처리 시간이 길어지면 LS 강도가 감소할 수 있으므로 침전을 방지하기 위해 각 측정 전에 부드러운 반전으로 시료를 혼합하십시오.
    5. 샘플 1mL를 깨끗한 큐벳에 추가하고 서리가 발생하지 않은 면을 기기의 왼쪽 레이저 경로에 배치합니다. s를 측정하기 전에 뚜껑을 닫고 평형을 위해 2-3분 정도 기다립니다.amp르.
    6. 제타 전위 측정을 수행하기 전에 유체역학적 반경(Rh)으로 크기를 측정합니다. 25°C ± 1°C에서 단일 산란 각도(θ = 90° - 150°)에서 측정값을 기록합니다.
    7. 제어판을 클릭하여 판독값을 확인하고 데이터 수집을 시작합니다.
      참고: sEV에 대한 평균 Rh 값과 평가된 크기 분포를 기반으로 30nm에서 200nm 사이의 피크를 관찰해야 합니다(그림 3). Rh에서 15nm 미만의 피크는 현탁액의 핵산과 단백질에 기인합니다. 일반적으로 크기 분포는 평균 유체역학적 반경에서 계산됩니다. 그러나 Z-average(샘플의 평균 입자 크기), 다분산 지수(PDI, 샘플의 크기 이질성을 결정함) 및 산란광 강도의 각도 종속성도 보고할 수 있습니다.
  2. 투과전자현미경(TEM)에 의한 구조 및 입자 크기 측정
    참고: 전체 마운트 sEV 준비를 위한 고정, 탈수, 수지 임베딩 및 대조를 포함하는 표준 프로토콜을 사용하여 sEV의 크기, 구조 및 순도를 평가하기 위해 음성 염색 투과 전자 현미경을 수행합니다.
    1. 2.10단계에서 농축된 sEV 샘플을 해동하고 얼음 위에 유지합니다.
    2. 1.5mL 튜브에 sEV를 고정합니다. 0.1M 카코딜레이트 나트륨 완충액(pH 7)에 2.5% 글루타르알데히드 5-10μL를 sEV 샘플 펠릿(필요한 sEV 농도 ≈ 1 x 10,8–1 x 10, 9mL-1)에 조심스럽게 적용하고 4°C에서 2시간 동안 배양합니다.
      참고: sEV는 추가 처리 전에 4°C에서 최대 1주일 동안 0.1M 카코딜레이트 나트륨 완충액에 보관할 수 있습니다. 따라서 TEM 분석을 위해 외부 기술 서비스가 필요한 경우 고정 sEV 샘플을 1.5mL 튜브에 담아 냉장 보관하십시오.
    3. 5μL의 부유 펠릿을 300메시 Formvar-carbon으로 코팅된 EM 구리 그리드에 증착합니다. 각 샘플에 대해 2개 또는 3개의 그리드를 준비합니다.
    4. 샘플이 건조한 환경에서 20분 동안 흡착되도록 하고 여과지를 사용하여 그리드에서 과도한 샘플을 제거합니다.
    5. PBS 100μL 방울을 필름 시트에 떨어뜨립니다. 깨끗한 집게를 사용하여 세척을 위해 그리드(흡착된 샘플 면이 아래를 향함)를 PBS 방울로 옮깁니다.
    6. 흡착된 샘플의 반대쪽을 건조시키고 그리드의 샘플 쪽이 다음 단계 중 하나에서 건조되지 않도록 합니다.
      알림: 모든 후속 단계에서 시약 방울을 평평한 필름에 놓고 집게를 사용하여 그리드를 방울로 옮깁니다.
    7. 그리드를 50μL 드롭의 1% 글루타르알데히드로 5분 동안 이동합니다.
    8. 100μL의 증류수 한 방울로 그리드를 세척하고 3분 동안 그대로 둡니다. 총 10회 세탁하기 위해 9회 반복합니다.
    9. 샘플 그리드를 1분 동안 1% w/v 우라닐-아세테이트 용액, pH 7의 50μL 강하와 대조합니다.
    10. 100 μL의 4% 우라닐 아세테이트와 900 μL의 2% 메틸 셀룰로오스의 혼합물에 그리드를 대조하고 포함합니다.
    11. 그리드가 루프에 남아 있는 동안 5-10분 동안 그리드를 자연 건조하고 0.2nm의 해상도와 100,000배의 배율로 80-100kV에서 전자 현미경으로 관찰합니다.
    12. 장기 보관을 위해 그리드를 건조 보관 상자에 보관하십시오.

4. 골수 유래 수지상 세포 생성

참고: 이 절차는 활성 증식 및 분화 능력을 가진 강력한 조혈 시스템을 특징으로 하는 어린 마우스를 사용하여 수행해야 합니다. 대조적으로, 나이가 많은 마우스는 조혈 기능의 감소, 줄기 세포 예비력 감소, 틈새 상호 작용 변화, 장기 면역 및 병원체 또는 면역 약화와 같은 노화 관련 변화에 대한 반응에 중요한 더 발달된 기억 저장소의 발달을 나타냅니다.

  1. 5-8주 된 암컷 CF-1 쥐를 기관 윤리 지침에 따라 안락사시켜 동물의 고통을 최소화합니다.
  2. 조직 배양 후드에 넣기 전에 마우스에 에탄올을 분사합니다.
    알림: 다음 단계는 멸균 상태에서 수행해야 합니다.
  3. 누운 위치에 있는 해부 보드에 마우스를 놓습니다. 집게와 해부 가위를 사용하여 요도 위쪽을 수직으로 "T"자 모양으로 절개하고 하지 상단까지 수평으로 확장하면서 복막이 부러지거나 장기, 특히 장에 구멍을 뚫지 않도록 주의합니다.
  4. 양쪽 뒷다리를 따라 피부를 분리하여 집게를 사용하여 다리 뼈와 조직을 노출시킵니다. 손으로 발목에서 복부 쪽으로 밀어 올리는 각 다리의 피부를 제거하고 피부를 반대쪽으로 당깁니다. 그러면 양쪽 다리에 피부가 없어집니다.
    알림: 마우스 시체를 병원체 잔류물 백에 버리십시오.
  5. 가위와 집게를 사용하여 대퇴골과 경골을 조심스럽게 제거하여 파손되지 않도록 합니다. 각 뼈의 끝을 집게로 고정하고 힘줄을 잘라 뼈 주위의 근막을 제거합니다. 종이 냅킨으로 근육 조직을 완전히 청소하십시오.
  6. 각 뼈가 제거되면 5% FBS, 100U/ml 페니실린, 100U/mL 스트렙토마이신 및 10μg/mL 겐타마이신이 보충된 RPMI 배지로 준비된 완전한 배지 2mL가 들어 있는 멸균 50mL 튜브에 넣어 파편을 제거합니다. 그런 다음 배양 배지를 흡인 및 버리고 70% 에탄올로 5분 동안 뼈를 두 번 씻습니다.
  7. 뼈를 멸균된 페트리 접시에 옮깁니다.
  8. 골수 세포에 접근하기 위해 날카로운 해부 가위를 사용하여 두 개의 뼈 골단을 잘라냅니다.
  9. 완전한 배지가 들어 있는 20mL 주사기에 부착된 25G 바늘을 사용하여 4개의 뼈 각각에서 골수 세포를 멸균 페트리 접시에 조심스럽게 세척합니다. 뼈는 골수가 추출됨에 따라 더 투명해집니다.
    참고: 전체 배지 20mL의 부피는 두 개의 대퇴골과 경골에서 골수 세포를 용출하기에 충분해야 합니다.
  10. 뼈 결합 조직과 세포 덩어리를 제거하기 위해 피펫팅을 통해 용출된 골수로 배지를 부드럽게 균질화합니다. 그런 다음 샘플을 멸균 50mL 원뿔형 튜브로 옮기고 멸균 70μm 폴리프로필렌 세포 여과기에 세포를 통과시켜 결합 조직과 뼈 파편을 제거합니다.
  11. 450 x g 에서 4°C에서 7분 동안 셀을 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 폐기하여 펠릿이 튜브 벽에 부착된 상태로 유지되도록 합니다.
  12. 세포를 실온(RT)에서 1분 동안 배양한 다음 500μL의 적혈구(RBC) 용해 완충액에 재현탁합니다. 3mL의 완전한 배지를 추가하여 용해 완충액을 중화합니다.
  13. 450 x g 에서 4°C에서 7분 동안 셀을 원심분리합니다. 상등액을 버리고 펠렛을 완전한 배지 5mL에 재현탁합니다.
  14. 멸균 70μm 폴리프로필렌 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 멸균 50mL 원뿔형 튜브에 통과시켜 용해된 적혈구에서 세포 응집체를 제거합니다.
  15. 혈구계를 사용하여 세포를 세십시오.
  16. 배양 배지에 300ng/mL의 재조합 쥐 Fms 관련 티로신 키나아제 3 리간드(Flt3L)를 첨가합니다.
  17. 멀티웰 플레이트에서 1 x 106 cells/mL의 농도로 세포를 플레이트링합니다.
  18. 5%CO2로 가습된 분위기에서 37°C에서 7일 동안 세포를 배양합니다.
    참고: 세포가 분화하고 성장하는 동안 세포를 흔들어 자연 성숙을 방지하지 마십시오.
  19. 3일차에 각 웰에서 배지 1mL를 제거하고(세포의 교란 방지) 150ng/mL 재조합 쥐 Flt3L이 보충된 예열 된 신선한 완전 배지 1mL로 교체합니다.

5. 골수 유래 수지상 세포와 E. granulosus의 세포 외 소포 사이의 상호 작용

  1. 세포외 소포막 염색
    1. 2.10단계에서 보관된 sEV를 해동하고 얼음 위에서 유지하십시오.
    2. 10μL의 라벨링 비히클(희석 C)에 10μL의 정제된 sEV를 재현탁합니다.
    3. 20μL의 2x PKH26 염료 용액을 첨가하여 최종 농도 2μM를 달성합니다. 피펫을 사용하여 부드럽게 섞고 어둠 속에서 37°C에서 35분 동안 배양합니다.
      주: 2x PKH26 염료 해결책 (4 μM)는 희석액 C의 125 μL에 PKH26 에탄올 염료 해결책의 0.5 μL를 추가해서 염색하기 직전에 준비되어야 합니다.
    4. 균일한 염색을 보장하기 위해 배양 중 3-5분마다 부드럽게 혼합합니다.
    5. BSA 1% 40μL를 첨가하고 RT에서 10분 동안 배양하여 염색 과정을 중단합니다.
    6. 1mL의 PBS와 100,000 x g 에서 4°C에서 1시간 동안 원심분리하여 SEV를 세척하여 과도한 염료를 제거합니다.
      알림: 로터의 k-factor는 103입니다.
    7. 2.7단계에서 설명한 프로토콜에 따라 펠릿을 90μL의 PBS에 재현탁합니다.
  2. E. granulosus의 세포외 소포를 가진 쥐 골수 유래 수지상 세포의 자극
    1. 배양 플레이트에서 골수 유래 수지상 세포(BMDC)를 잘 채취하여 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
      참고: 자연 세포 성숙을 피하기 위해 조심스럽게 다루십시오.
    2. 배지를 450 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.
      참고: 후속 유세포 분석 단계에서 세포를 재플레이팅하기 위해 원심분리에서 상등액을 예약합니다.
    3. 유세포 분석을 위해 2.10단계에서 30μL의 염색되지 않은 sEV 또는 5.1.7단계에서 90μL의 PBS 함유 염색된 sEV에 BMDC를 재현탁합니다. 컨포칼 현미경 검사용. 37 ° C에서 30 % CO2의 가습 된 분위기에서 2 분 동안 배양합니다. 10분마다 샘플을 부드럽게 혼합합니다.
      참고: BMDC와 sEV 간의 효과적인 접촉을 보장하기 위해 배양의 처음 30분 동안은 1.5mL 튜브를 사용하여 최소한의 부피로 수행해야 합니다.
    4. 컨포칼 현미경 검사의 경우, 24웰 플레이트에 배치된 Alcian 블루 처리된 유리 커버슬립(직경 12mm)으로 세포를 옮깁니다. 37 ° C에서 30 % CO2의 가습 챔버에서 추가로 30 분 동안 배양합니다.
      참고: 알시안 블루 처리는 커버슬립에 양전하를 띠어 BMDC의 음전하를 띤 원형질막의 부착을 촉진합니다.
      1. 커버슬립을 준비하려면 여과된 1% Alcian blue 8 GX 염료에 담그고 끓이지 않고 전자레인지에 1-2분 동안 가열합니다. 뜨거운 용액에서 10분 동안 배양하고 2-3분마다 소용돌이치며 배양합니다.
      2. 그런 다음 커버 슬립을 탈이온수 증류수로 씻어 여분의 알시안 블루를 제거하고 종이 타월로 말리십시오. 마지막으로 커버슬립을 고압증기멸균하고 사용할 때까지 멸균 상태로 보관하십시오.
    5. 유세포 분석을 위해 BMDC-sEV를 수확한 것과 동일한 웰로 다시 옮기고(5.2.1단계 참조), 5.2.2단계에서 예약된 상등액을 추가한 다음 5%CO2의 가습 분위기에서 37°C에서 18시간 동안 배양합니다.
      참고: 수집 후 남아 있는 세포의 건조를 방지하기 위해 웰에 약 500μL의 배지를 남겨 둡니다.
    6. 양성 및 음성 대조군을 사용하여 BMDC 성숙도를 평가합니다. 100ng/mL의 지질다당류(LPS)를 양성 대조군으로 18시간 동안 세포를 자극합니다. 세포내이입(endocytosis)을 음성으로 조절하려면 4°C에서 sEV와 함께 BMDC를 배양합니다. 또한 자극되지 않은 수지상 세포 제어를 포함합니다.
  3. 골수 유래 수지상 세포에 의해 포획되고 내재화된 E. granulosus 의 세포외 소포에 대한 컨포칼 현미경 검사.
    1. 5.2.4단계에서 설명한 배양 기간이 완료되면 흡인하고 커버슬립에서 PBS를 버립니다.
    2. 커버슬립 위에 100μL의 4% 파라포름알데히드(PFA)를 첨가하여 BMDC를 고정하고 RT에서 10분 동안 배양합니다.
      알림: 볼륨이 커버슬립의 표면 장력을 유지하는지 확인하십시오.
    3. PFA를 흡인하여 버린 다음 PBS-BSA 2%로 커버슬립을 세 번 세척합니다.
    4. 1/100으로 희석된 anti-MHC class II-FITC 항체를 함유한 PBS 100μL를 첨가하고 어둠 속에서 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
    5. 항체 용액을 흡인 및 폐기하고 PBS-BSA 2%로 커버슬립을 3회 세척합니다.
    6. 100μL의 50ng/mL DAPI를 첨가하고 습식 챔버에서 실온에서 30분 동안 배양하여 핵을 역염색합니다.
    7. 염료 용액을 흡입하여 버리고 PBS-BSA 2%로 커버슬립을 3회 세척합니다.
    8. 구부러진 가는 집게를 사용하여 커버슬립을 제거하고 종이 타월로 건조시켜 과도한 액체를 제거합니다.
    9. 폴리비닐 알코올과 글리세롤로 구성된 장착 매체를 사용하여 커버슬립을 아래를 향하게 하여 유리 슬라이드에 장착합니다. 37°C에서 2시간 동안 건조하거나 어둠 속에서 4°C에서 밤새 건조시킵니다.
    10. 집게로 커버슬립을 부드럽게 눌러 커버슬립과 유리 슬라이드 사이의 기포를 제거합니다.
    11. 여기/방출 파장이 FITC의 경우 485/538nm, DAPI의 경우 358/461nm, PKH26의 경우 551/567nm인 60x 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 컨포칼 현미경으로 장착된 샘플을 관찰합니다.
  4. 유세포 분석에 의한 세포외 소포 자극 골수 유래 수지상 세포의 표현형 평가
    1. 5.2.5단계에서 설명한 배양 기간이 지난 후 피펫으로 배지를 위아래로 여러 번 플러시하여 BMDC를 수확합니다.
    2. 배지가 포함된 BMDC를 수집하여 1.5mL 튜브에 넣습니다.
    3. 450 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기를 하여 세포를 펠릿화합니다.
      참고: 선택적으로 사이토카인 분비를 분석하려면 피펫으로 상층액을 제거하고 새로운 1.5mL 튜브로 옮긴 다음 추가 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 검사를 위해 -20°C에서 보관합니다.
    4. CD11c, CD40, CD80, CD86, MHC class I 및 MHC class II로 향하는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 알로피코시아닌(APC) 또는 피코에리트린 접합 mAb를 함유한 100μL의 PBS에 BMDC를 재현탁시키고 어두운 곳에서 4°C에서 15분 동안 배양합니다.
    5. PBS와 원심분리기로 BMDC를 450 × g 에서 4 °C에서 5분 동안 세척합니다.
    6. BMDC를 500 μL의 1% PFA에 재현탁시켜 고정하고 유세포 분석기에서 획득할 때까지 4 °C에서 보관합니다.

결과

그림 1에는 E. granulosus 유충 단계의 순수 배양을 유지하기 위한 주요 단계, sEV의 분리 및 특성화, 쥐 수지상 세포에 의한 흡수를 요약한 순서도가 나와 있습니다. E. granulosus protoscoleces 및 metacestodes에서 높은 sEV 생산을 달성하기 위해 이전에 실험실에서 개발된 체외 배양 방법을 사용하여 연구된 기생충의 생존 및 대사 항상성을 극?...

토론

기생충 배양, 기생충 유래 sEV를 분리, 골수에서 수지상 세포를 분화하고, 이러한 세포의 sEV 흡수를 분석하기 위한 프로토콜 워크플로우는 그림 1에 요약되어 있습니다. 목표는 전체 또는 개별적으로 수행될 수 있는 각 프로토콜 섹션을 자세히 설명하고 방법론의 구현을 보장하기 위한 주요 고려 사항을 강조하는 것이었습니다. 완전한 기생 유기체에...

공개

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

저자는 Lic. Cecilia Gutiérrez Ayesta (Servicio de Microscopía Electrónica, CONICET, Bahía Blanca, 아르헨티나) 및 Lic. 레오나르도 세치와 리치. Eliana Maza (INIFTA, Universidad Nacional de La Plata, 아르헨티나), 투과 전자 현미경 및 동적 광 산란에 대한 기술 지원. 우리는 또한 Dra에게 감사드립니다. Graciela Salerno, 드라. Corina Berón과 Dr. Gonzalo Caló는 아르헨티나 INBIOTEC-CONICET-FIBA에서 초원심분리기를 사용했습니다. 저자는 Lic을 감사하게 인정합니다. Kelly (SENASA, Mar del Plata, 아르헨티나) 및 Lic. 생쥐의 복지 평가에 협력한 H. Núnez García (CONICET, Universidad Nacional de Mar del Plata, 아르헨티나), 기생충 물질 획득에 기여한 Med. Vet. J. Reyno, Med. Vet. S. Gonzalez, Med. Vet L. Netti. 실험, 시약 및 장비 비용을 포함한 이 작업은 ANPCyT가 자금을 지원한 PICT 2020 No. 1651의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL tubesHensoN14059
24-well plate JetBiofilCAP011024Polystyrene, flat bottom, Sterile
6-well plate  Henso Medical Co. Ltd.N14221Flat-shape bottom, PS material, Sterile
70 mm polypropylene cell strainerBiologix Group Limited15-1070Sterile
Alcian blue 8 GX dye Santa Cruzsc-214517B
Automatic CO2 incubatorNuarireUN-5100E/G DH
Bovine Serum AlbuminWiener lab1443151
CD11c Monoclonal antibody-PECy5   100 µgeBioscience15-0114-82clone (N418)
CD40 Monoclonal antibody-FITC 100 µgeBioscience11-0402-82clone (HM40-3)
CD80 Monoclonal antibody-APC 100 µgeBioscience17-0801-82clone (16-10A-1)
CD86 Monoclonal antibody-FITC  100 µgeBioscience11-0862-82clone (GL-1)
CentrifugeThermo ScientificIEC CL31R Multispeed
Confocal MicroscopeNikonNikon Confocal Microscope C1
Conical tubes 15 mL dia.17 x 120 mmCitotest4610-1865
DAPISigma107K4034
D-GlucoseMerk1.78343
Dimethyl Sulfoxide Anedra6646
Fetal Bovine Serum 500 mLSigma-Aldrich  12352207
Flow Cytometry SystemBD BiosciencesBD FACSCanto™ II
Folded Capillary Zeta Cell Malvern PanalyticalDTS1070
Gentamicin sulfate saltSigmaG1264
Glutaraldehyde solutionFluka49630
HepesGibco11344041
Hypodermic  needle 21 G x 1"25/8WeigaoSterile
Hypodermic  needle 25 G x 5/8"WeigaoSterile
Inverted microscope LeicaDMIL LED Fluo 
KetamineHolliday
Lipopolysaccharide  5 mgInvitrogentlrl-rslpsLPS from the Gram-negative bacteria E. coli K12 . TLR2/4 Agonists
Loperamide hydrochlorideSigma-Aldrich5.08162
Medium 199 Gibco11150059
Methylene BlueAnedra6337
MHC class I (H2kb) Monoclonal antibody-PE 100 µgeBioscience12-5958-82clone (AF6-88.5.5.3)
MHC class II (IA/IE) Monoclonal antibody-FITC  100 µgeBioscience11-5321-82clone (M5/114.15.2)
MicroscopeOlympusCX31
Mouse recombinant murine Flt3L.PrepoTech250-31L-10UG
NanodropThermo ScientificND-One
ParaformaldehydeAgar ScientificR1018
Penicillin G sodium saltSigmaP3032-10MU
PKH26Sigma-AldrichMINI26
Potassium Phosphate MonobasicTimperFor Phosphate Buffered Saline (PBS)
RBC lysis buffer 100 mLRoche11814389001
RPMI medium  1640 1x 500 mLSigma-Aldrich (Gibco)11875093
Sodium Cacodylate  Sigma-AldrichC0250
Sodium ChlorideAnedra7647-14-5For Phosphate Buffered Saline (PBS)
Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) p. a.Biopack1639.07For Phosphate Buffered Saline (PBS)
Streptomycin sulfate saltSigmaS9137
Syringe 10 mLBremenSterile
Thickwall polycarbonate tubesBeckman Coulter13 x 55 mm , nominal capacity 4 mL
Transmission Electron MicroscopeJeolJEOL JSM 100CX II
UltracentrifugeBeckmanOptima LE-80k 90 Ti rotor
XylazineRichmond
Zetasizer Nano Malvern Nano ZSizer-ZEN3600To perform Dynamic Light scattering and zeta potential measurements

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