JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной работе мы описываем условия культивирования in vitro , выделение и увеличение генерации внеклеточных везикул (ВВ) из Echinococcus granulosus. Малые электромобили характеризовались динамическим рассеянием света и просвечивающей электронной микроскопией. Поглощение дендритными клетками, происходящими из костного мозга, и их фенотипическую модуляцию изучали с помощью конфокальной микроскопии и проточной цитометрии.

Аннотация

Секреция внеклеточных везикул цестодами имеет решающее значение для обеспечения клеточной коммуникации не только между паразитами, но и с тканями хозяина. В частности, малые внеклеточные везикулы (sEVs) действуют как нанопереносчики, перенося природные антигены, которые имеют решающее значение для иммуномодуляции хозяина и выживания паразитов. В данной статье представлен пошаговый протокол выделения sEV из культур личиночной стадии Echinococcus granulosus и проанализирован их поглощение дендритными клетками, полученными из костного мозга мышей, которые приобретают адгезию и презентационную способность антигена в процессе созревания после одной недели культивирования in vitro . В этой статье представлена исчерпывающая информация о получении, очистке и количественном определении sEV с использованием ультрацентрифугирования, а также параллельный анализ динамического рассеяния света и просвечивающей электронной микроскопии. Кроме того, описан подробный экспериментальный протокол для выделения и культивирования клеток костного мозга мышей и их дифференцировки в дендритные клетки с использованием Flt3L. Эти дендритные клетки могут представлять антигены наивным Т-клеткам, тем самым модулируя тип иммунного ответа in vivo. Таким образом, предложены альтернативные протоколы, включающие конфокальную микроскопию и анализ проточной цитометрии, для проверки приобретенного фенотипа созревания дендритных клеток, ранее подвергшихся воздействию паразитических sEVs. Наконец, стоит отметить, что описанный протокол может быть применен в целом или по отдельности для проведения культивирования паразитов in vitro , выделения внеклеточных везикул, получения культур дендритных клеток, полученных из костного мозга, и выполнения анализов поглощения с этими клетками.

Введение

Echinococcus granulosus — зоонозный паразитический гельминт, ответственный за долгосрочную инфекцию, известную как кистозный эхинококкоз1. У промежуточных хозяев, таких как домашний скот и люди, паразитарная инфекция в первую очередь поражает печень и легкие, где личиночная стадия развивается в виде заполненных жидкостью цист или метацестод, содержащих протосколесы (саму личинку). Как и у всех цестод, у этого паразита отсутствует пищеварительная и выделительная системы и, следовательно, развились активные эндоцитарные и экзоцитарные клеточные процессы, регулирующие поглощение и выведение метаболитов, а также высвобождение внеклеточных везикул2,3. Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой частицы, окруженные липидным бислоем, секретируемые, по-видимому, всеми типами клеток. В частности, малые внеклеточные везикулы (sEVs), определяемые как EV размером менее 200 нм независимо отих биогенезного происхождения4, могут выступать в качестве межклеточных иммунных медиаторов. Эта функция особенно важна для паразитов, которые полагаются на иммуномодуляцию хозяина для обеспечения своей выживаемости3. Иммунные манипуляции достигаются путем поглощения sEV дендритными клетками хозяина, единственными клетками, способными активировать наивные Т-клетки in vivo и инициировать адаптивный иммунный ответ, который приведет к хроническому заражению этими паразитическими червями. Дендритные клетки, профессиональные антигенпрезентирующие клетки врожденной иммунной системы, обрабатывают и загружают антигенные пептиды в главный комплекс гистосовместимости класса I и класса II (МНС I и МНС II) и демонстрируют их на своих мембранах для эксклюзивного прайминга наивных Т-клеток (CD8+ и CD4+ Т-клеток соответственно)5. Последующие дендритные клетки индуцируют свое созревание путем индукции экспрессии ко-стимулирующих маркеров CD80/CD86 и CD40 и MHC-II и мигрируют из периферических тканей во вторичные лимфоидные органы, узнавая чужеродные антигены, загружая их для эксклюзивного наивного прайминга Т-клеток6. Таким образом, общая цель данного протокола заключается в том, чтобы реалистично изучить коммуникацию паразита гельминта с хозяином, анализируя упаковку и доставку паразитарных компонентов в виде sEVs, которые, достигая иммунных клеток хозяина, влияют на развитие инфекции и прогрессирование хронического паразитарного заболевания.

Подход к анализу интерфейса гельминт-хозяин через изучение sEVs имеет ряд преимуществ. Во-первых, оболочка, внешняя оболочка плоских червей, представляет собой двойную мембранную структуру, которая представляет собой основную точку пересечения между паразитом и его хозяином, что позволяет легко генерировать или проникать через эту структуруsEV. Во-вторых, sEV сильно нагружены белковыми антигенами со всех стадий жизненного цикла паразита, представляя собой естественный способ, с помощью которого иммунная система хозяина отбирает антигены вовремя заражения червями. Благодаря своей биологической продукции, простоте очистки (не требуя разрушения тканей или фракционирования белка) и прямому взаимодействию с клетками хозяина, гельминты sEV позволяют проводить эксперименты in vitro для моделирования условий взаимодействия паразита и хозяина in vivo. Наконец, sEVs представляют собой возможность наличия паразитарных структур, которые могут быть фагоцитозированы или интернализованы клетками-хозяевами, преодолевая невозможность сделать это с целыми паразитами, особенно в случаях энцистированных червей.

Учитывая упомянутые преимущества и тот факт, что гельминтозы являются распространенными и, как правило, хроническими заболеваниями, при которых паразиты, по-видимому, манипулируют иммунной системой хозяина в качестве стратегии выживания, выделение полученных от паразитов ВВ и их изучение во взаимодействии с дендритными клетками обеспечивает ценную основу для изучения этой иммуномодуляции. В этом смысле было описано, что интернализация ВВ от гельминтов, включая нематод и платигельминтов, таких как Schistosoma mansoni, Fasciola hepatica, Brugia malayi и E. granulosus, индуцирует созревание и активацию дендритных клеток 9,11,12,13,14,15.

Выделение ВВ, полученных от гельминтов, не только позволяет изучать иммунологические взаимодействия, потенциально приводящие к разработке защитных вакцин или иммунотерапевтических агентов для аллергических или аутоиммунных заболеваний, но и способствует исследованию других биологических взаимодействий и функций 8,16,17. В этом контексте ВВ, которые играют роль в естественной истории паразитарных инфекций, могут быть использованы для исследования развития паразитов и взаимодействия с конкретными клетками-хозяевами. Кроме того, они могут иметь потенциальное применение в качестве ранних или дифференциальных биомаркеров для диагностики паразитарных заболеваний, мониторинга терапевтических реакций и внесения вклада в контроль и лечение паразитарных инфекций17,18.

Кроме того, как было продемонстрировано ранее, личиночная стадия E. granulosus восприимчива к изменениям концентрации цитозольного кальция, который, помимо того, что играет роль в жизнеспособности паразита, также контролирует скорость экзоцитоза 19,20. В этом контексте, а также зная, что внутриклеточное повышение уровня кальция усиливает высвобождение ВВ, использование внутриклеточного усилителя кальция в качестве лоперамида может стать решающей стратегией для увеличения количества ВВ. Этот подход особенно интересен для клеточных систем, которые требуют больших популяций для генерации достаточного количества электромобилей для грузового и функционального анализа 11,21,22. В действующем протоколе (рис. 1) подробно описаны методы получения чистых культур личинковой стадии E. granulosus и условия, которые увеличивают производство sEV. В ней также описывается рабочий процесс выделения и определения характеристик этих везикул, а также их поглощение дендритными клетками мышей, что является важным шагом в первоначальном изучении модуляции иммунной системы хозяина.

протокол

Все процедуры с участием животных были оценены и одобрены Комитетом по экспериментам на животных факультета точных и естественных наук, Мар-дель-Плата (номера разрешений: RD544-2020; РД624-625-2021; РД80-2022). В соответствии с этим протоколом мыши были усыплены, в соответствии с «Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию», опубликованным NIH, и рекомендациями Национальной службы здравоохранения и качества пищевых продуктов (SENASA).

1. Выращивание личинок эхинококка

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры проводились в асептических условиях.

  1. E. granulosus protoscoleces obtention
    1. Аспирируйте с помощью иглы 21 G и шприца 10 мл часть эхинококковой жидкости из легких или печени инфицированного крупного рогатого скота для снижения тургора кисты (рисунок 2A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инфицированные легкие и печень поступают от крупного рогатого скота, представленного на обычный убой на скотобойне. Они должны содержаться при температуре 4 °C и обрабатываться в течение 24 часов после убоя.
    2. Вскройте кисту ножницами и удалите ламинарный и зародышевый слои из кисты с помощью щипцов. Поместите их в стерильную чашку Петри вместе с остатками жидкости для эхинококка (рис. 2B, C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе рекомендуется наблюдать за чашкой Петри под перевернутым микроскопом, чтобы оценить качество протосколек и выводковых капсул. Избегайте объединения биологического материала из кист с коллапсом более 50% протосколек, которые идентифицируются по их суженной соме, более темному цвету и дезорганизованному ростеллуму с потерей крючков.
    3. Промыть слои стерильным фосфатным буферным раствором (PBS) с добавлением антибиотиков (100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл) для удаления протосколев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все промывания будут проводиться с PBS с добавлением антибиотиков.
    4. Перенесите суспензию протоскоплекса в стерильную стеклянную пробирку Хана с помощью пипетки Пастера.
    5. Промойте протосколески добавкой PBS при температуре 4 °C с помощью пастеровской пипетки для удаления мертвых паразитов. Энергично суспендируйте суспензию, чтобы разорвать капсулы с расплодом, способствуя высвобождению протоскоплекса. Дайте протосколескам осесть на дно пробирки в течение 1–2 минут; Затем выбросьте надосадочную жидкость, содержащую мертвые протосколепы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за разницы в плотности живые протосколесы расселяются быстрее, чем мертвые паразиты.
    6. Повторяйте процесс промывки до тех пор, пока не будут удалены все мертвые и плавающие протосколепы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мертвые паразиты удаляются, когда все они оседают с одинаковой скоростью.
    7. Определите жизнеспособность протосколев с помощью теста на исключение метилена.
      1. Снова суспензируйте промытые протосколески с помощью пипетки и поместите каплю на предметное стекло. Добавьте каплю 0,1 мг/мл метиленового синего и накройте покровным стеклом. Подождите 2–3 минуты и понаблюдайте под микроскопом.
      2. Подсчитайте общее количество живых (неокрашенных) и мертвых (окрашенных в синий цвет) протосколес и рассчитайте процент жизнеспособных протосколесков (рисунок 2D и врезка).
        Примечание: Жизнеспособность протосколесов должна составлять около 98% до создания культур. Время окрашивания не должно превышать 10 минут, так как более длительная продолжительность может привести к окрашиванию живых паразитов.
  2. E. granulosus metacestodes obtention
    1. Получить экспериментальную вторичную эхинококковую болезнь путем внутрибрюшинного инфицирования самок мышей CF1 (масса тела 25 ± 5 г) 1500 протосколев (эквивалентно 10 мкл гранулы protocolex), взвешенных в 0,5 мл добавки PBS (рис. 2E).
      Примечание: Рекомендуется поддерживать протосколепы при PBS с добавлением антибиотиков при температуре 4 °C в течение 24 ч или в культуре в течение 3–5 дней до инфекции.
    2. Метацестоды развиваются в течение 4-6 месяцев после инфицирования (рисунок 2F). В течение этого периода животные должны содержаться в контролируемых лабораторных условиях (температура 20 ± 1 °C, 12-часовой цикл света/темноты, вода и корм должны предоставляться в неограниченном количестве). После того, как цисты разовьются, обезболите мышей кетамин-ксилазином (50 мг/кг/мышь-5 мг/кг/мышь) и усыпьте их путем вывиха шейки матки.
    3. Очистите брюшную поверхность мыши 70% спиртом и хирургическим путем вскройте брюшную полость для удаления развившихся метацестод с помощью ножниц и щипцов.
    4. Переложите метацестоды массы в стерильную чашку Петри.
      Примечание: Метацестодальные массы состоят из множественных внутренних кист, окруженных соединительной тканью.
    5. Освободите кисты из метацестодных масс, при необходимости аккуратно удалив соединительную ткань, покрывающую метацестоды, с помощью щипцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг гарантирует, что паразиты свободны от тканей хозяина.
    6. Полученные метацестоды промыть дополненным PBS при 4 °C (рисунок 2G).
  3. Культивирование E. granulosus protoscoleces и метацестод
    1. Приготовьте питательную среду следующим образом: добавьте 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 мкг/мл гентамицина, 4 мг/мл глюкозы, 50 мМ буфера Hepes pH 7,5 и среду 199 до достижения желаемого конечного объема и аккуратно перемешайте путем инверсии.
    2. Перенесите по 5 мл приготовленной питательной среды в каждую пробирку Leighton (рис. 2H–I).
    3. Добавьте паразитов в питательную среду и инкубируйте при 37 °С в течение 5 дней, не меняя среду. Инкубируйте пробирки Leighton под углом 15°, чтобы обеспечить равномерное распределение биологического материала по плоской поверхности. Это максимизирует воздействие паразитов на питательную среду, предотвращая контакт с резиновой пробкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 9 000–10 000 протосколек или 50 метацестод (с диаметром от 5 мм до 15 мм, распределенных как 10 цист на трубку).
    4. При необходимости добавляют 20 мкМ лоперамид (сублетальная концентрация), растворенный в диметилсульфоксиде в течение 16–24 ч, в культуральную среду паразита для повышения уровня цитозольного кальция и усиления высвобождения EV на личиночной стадии E. granulosus.
      Учитывая, что увеличение внутриклеточной концентрации кальция усиливает выработку EV, обработка паразита соединениями, влияющими на гомеостаз кальция, повысит высвобождение EV.

2. Очищение внеклеточных везикул

  1. Соберите питательную среду для паразитов из каждой пробирки Лейтона и переложите ее в коническую пробирку объемом 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Питательная среда может храниться в течение 24 часов перед первым центрифугированием с минимальным влиянием на концентрацию или распределение везикул по размерам. Протосколесы можно трижды промыть буфером PBS, собрать и хранить при температуре -20 °C в пробирках объемом 1,5 мл.
  2. Центрифугируйте при 300 x g в течение 10 мин при 4 °C и перенесите надосадочную жидкость в новую коническую пробирку объемом 15 мл с помощью пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе удаляются мертвые протосколеки. После каждого этапа центрифугирования следите за тем, чтобы над гранулой оставалось не менее 0,5 см надосадочной жидкости, чтобы избежать загрязнения.
  3. Центрифугируйте надосадочную жидкость при температуре 2 000 x g в течение 10 минут при 4 °C и перенесите его в новые пробирки объемом 1,5 мл с помощью пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе удаляются более крупные клеточные остатки.
  4. Центрифугируйте при давлении 10 000 x g в течение 30 минут при 4 °C для удаления более мелких клеточных остатков.
  5. Перенесите надосадочную жидкость в пробирку, подходящую для ротора ультрацентрифуги, с помощью пипетки. Отметьте маркером одну сторону каждой пробирки перед тем, как поместить ее в ротор ультрацентрифуги. Затем поместите трубку в ротор отмеченной стороной вверх.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Метка служит ориентиром для определения местоположения гранулы после ультрацентрифугирования. Трубки должны быть заполнены на три четверти и точно сбалансированы; поэтому, если нужно, добавьте PBS. Если объем надосадочной жидкости превышает емкость одной пробирки, разделите образцы на несколько пробирок и объедините их при ресуспензии.
  6. Центрифугируйте при 100 000 x g в течение 1 ч при 4 °C и быстро слейте надосадочную жидкость. Дайте трубке постоять вверх дном в течение 1 минуты. На этом этапе гранула может быть не видна.
    ПРИМЕЧАНИЕ: К-фактор для используемого ротора составляет 103.
  7. Промойте гранулу не менее чем 3 мл PBS, чтобы удалить загрязняющие белки. Повторно суспендируйте гранулу путем многократного пипетирования вверх и вниз от верхней стороны трубки к нижней на всех поверхностях трубки, но в основном на отмеченной стороне, где ожидается нахождение гранулы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если применимо, объедините ресуспендированную гранулу, полученную из той же надосадочной жидкости, в одну пробирку.
  8. Центрифугируйте при 100 000 x g в течение 1 ч при 4 °C и быстро слейте надосадочную жидкость. Дайте трубке постоять вверх дном в течение 1 минуты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: К-фактор для используемого ротора составляет 103.
  9. Повторно суспендируйте гранулу в 30 мкл PBS в соответствии с процессом, описанным на шаге 2.7.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе рекомендуется измерить общую концентрацию белка в ресуспендированной грануле, чтобы оценить количество секретируемых sEVs. Концентрацию белка можно определить, измерив поглощение на длине волны 280 нм с помощью микрообъемного спектрофотометра.
  10. Переложите образец в пробирку объемом 1,5 мл. Заморозьте внеклеточные пузырьки при температуре -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сохранить целостность везикулы для последующих применений, замораживайте ресуспендированную гранулу как можно быстрее и избегайте повторных циклов замораживания-размораживания.

3. Характеристика изолированных везикул

  1. Определение размера EV с помощью динамического рассеяния света (DLS)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Динамическое рассеяние света является надежным и чувствительным методом оценки размера (на основе гидродинамического радиуса, относительной влажности) и формы наночастиц в сложных жидкостях, независимо от их типа. Измерения DLS и дзета-потенциала проводились с использованием монохроматического лазерного луча He-Ne с длиной волны 633 нм. Если анализ невозможен в день отбора проб, образцы могут быть заморожены в предварительно отфильтрованном буфере перед хранением.
    1. Разморозьте образцы и выдержите их на льду до проведения измерений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Замораживание образцов может повлиять на распределение частиц и целостность sEV. Поэтому избегайте циклов замерзания и оттаивания, так как они могут привести к снижению сигнала LS при уменьшении пиковых высот.
    2. Отфильтруйте водные образцы, используемые для DLS, через фильтр размером пор 0,2 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В экспериментах с LS важно отфильтровать все растворы, буферы и водные образцы для удаления крупных частиц и пыли, которые могут помешать измерениям.
    3. Разбавьте образцы в соотношении от 1:10 до 1:50 в предварительно отфильтрованном PBS.
    4. Перемешивайте образцы путем мягкой инверсии перед каждым измерением, чтобы предотвратить осаждение, так как интенсивность LS может снизиться из-за более длительного времени обработки образцов.
    5. Добавьте 1 мл образца в чистую кювету, расположив нематовую сторону в лазерном тракте слева в приборе. Закройте крышку и дайте 2–3 минуты для уравновешивания перед измерением образца.
    6. Измерьте размер в терминах гидродинамического радиуса (Rh) перед выполнением измерения дзета-потенциала. Запись измерений при одном угле рассеяния (θ = от 90° до 150°) при 25 °C ± 1 °C.
    7. Нажмите на «Панель управления », чтобы проверить показания и начать сбор данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Основываясь на средних значениях резус-фактора и оцененных распределениях по размерам для sEV, следует наблюдать пик между 30 нм и 200 нм (Рисунок 3). Пики ниже 15 нм резус-фактора связаны с нуклеиновыми кислотами и белками в суспензии. Как правило, распределения по размерам рассчитываются на основе среднего гидродинамического радиуса. Тем не менее, можно также сообщить Z-среднее (средний размер частиц в образце), индекс полидисперсии (PDI, определяющий размерную неоднородность образца) и угловую зависимость интенсивности рассеянного света.
  2. Определение структуры и размера частиц с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите просвечивающую электронную микроскопию с отрицательным окрашиванием для оценки размера, структуры и чистоты sEV с использованием стандартного протокола, который включает фиксацию, обезвоживание, заделку смолы и контрастирование для препаратов sEV цельного крепления.
    1. Разморозьте концентрированные образцы sEV на шаге 2.10 и держите их на льду.
    2. Зафиксируйте sEV в пробирках объемом 1,5 мл. Осторожно внесите 5–10 мкл 2,5% глутаральдегида в 0,1 М буфер какодилата натрия (pH 7) на ~5 мкл образца sEV (требуемая концентрация sEV ≈ 1 x 108–1 x 109 мл-1) и инкубируйте в течение 2 ч при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: sEV можно хранить до 1 недели при 4 °C в 0,1 М буфере из какодилата натрия перед дальнейшей обработкой. Поэтому, если для проведения анализа методом ПЭМ требуются внешние технические услуги, отправьте неподвижные образцы sEV в охлажденном виде в пробирках объемом 1,5 мл.
    3. Внесите 5 μл ресуспендированных гранул на медные сетки EM с углеродным покрытием Formvar 300 меш. Подготовьте две-три сетки для каждого образца.
    4. Дайте образцу погореть в течение 20 минут в сухом месте и удалите излишки образца из сетки с помощью фильтровальной бумаги.
    5. Нанесите 100 μл капель PBS на лист пленки. С помощью чистых щипцов перенесите сетки (адсорбированной стороной вниз) в капли PBS для промывания.
    6. Высушите противоположную сторону адсорбированного образца, следя за тем, чтобы сторона образца решетки не высыхала во время любого из следующих этапов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На всех последующих этапах наносите капли реагентов на плоскую пленку и переносите сетки на капли с помощью щипцов.
    7. Перенесите в решетки каплю объемом 50 мкл 1% глутаральдегида на 5 минут.
    8. Промойте решетки каплей дистиллированной воды объемом 100 μл и дайте им постоять 3 минуты. Повторите девять раз, всего десять стирок.
    9. Сравните сетки образцов с каплей 50 мкл 1% w/v раствора уранилацетата pH 7 в течение 1 мин.
    10. Сравните и встройте сетки в смесь 100 мкл 4% уранилацетата и 900 мкл 2% метилцеллюлозы.
    11. Сушите решетки на воздухе в течение 5–10 минут, пока они остаются на контуре, и наблюдайте их с помощью электронного микроскопа на 80–100 кВ с разрешением 0,2 нм и увеличением 100 000 раз.
    12. Храните сетки в сухих ящиках для длительного хранения.

4. Образование дендритных клеток, полученных из костного мозга

Примечание: Эту процедуру следует проводить с использованием молодых мышей, которые характеризуются крепкими кроветворными системами с активными пролиферационными и дифференцировочными способностями. Напротив, у старых мышей наблюдается снижение гемопоэтической функции, снижение резервов стволовых клеток, изменение взаимодействий в нишах и более развитый резервуар памяти, который имеет решающее значение для долгосрочного иммунитета и реакции на патогены или возрастные изменения, такие как старение иммунитета.

  1. Усыпьте 5–8-недельную самку мыши CF-1 в соответствии с этическими рекомендациями учреждения, минимизируя страдания животных.
  2. Распылите на мышь этанол перед тем, как поместить ее в капюшон для культуры тканей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги должны быть выполнены в стерильных условиях.
  3. Поместите мышь на доску для препарирования в положении лежа на спине. С помощью щипцов и препарирующих ножниц сделайте вертикальный Т-образный разрез над мочеиспускательным каналом и продлите его горизонтально до верхней части нижних конечностей, стараясь не сломать брюшину и не проколоть какие-либо органы, особенно кишечник.
  4. Отделите кожу вдоль обеих задних конечностей, чтобы обнажить кости и ткани ног с помощью щипцов. Руками снимите кожу с каждой ноги, надавливая от лодыжки к животу, подтягивая кожу в противоположную сторону. После этого обе ноги будут свободны от кожи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбросьте тело мыши в пакет с остатками патогена.
  5. С помощью ножниц и щипцов аккуратно удалите бедренную и большеберцовую кости, не допуская поломки. Закрепите кончик каждой кости щипцами и разрежьте сухожилия, чтобы удалить мышечные фасции вокруг костей. Завершите очистку мышечной ткани бумажными салфетками.
  6. После удаления каждой кости поместите ее в стерильную пробирку объемом 50 мл, содержащую 2 мл полной среды, приготовленной из среды RPMI с добавлением 5% FBS, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 ЕД/мл стрептомицина и 10 мкг/мл гентамицина для удаления остатков. Затем отсадите и выбросьте питательную среду и дважды промойте кости 70% этанолом в течение 5 минут.
  7. Переложите косточки в стерильную чашку Петри.
  8. Отрежьте два эпифиза кости с помощью острых ножниц, чтобы получить доступ к клеткам костного мозга.
  9. Осторожно промойте клетки костного мозга из каждой из четырех костей в стерильную чашку Петри с помощью иглы 25 G, прикрепленной к шприцу объемом 20 мл с полной средой. Кости станут более прозрачными по мере извлечения костного мозга.
    Примечание: Объем 20 мл полной среды должен быть достаточным для элюирования клеток костного мозга из двух бедренных и большеберцовых костей.
  10. Аккуратно гомогенизируйте среду с помощью элюированного костного мозга с помощью пипетирования, чтобы удалить костную соединительную ткань и клеточные комки. После этого переложите образец в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл, пропустив клетки через стерильное полипропиленовое сетчатое фильтр для клеток размером 70 мкм для удаления соединительной ткани и костных остатков.
  11. Центрифугируйте ячейки при 450 x g в течение 7 мин при 4 °C. Осторожно извлеките и выбросьте надосадочную жидкость, следя за тем, чтобы гранула оставалась прилипшей к стенке трубки.
  12. Инкубируйте клетки в течение 1 минуты при комнатной температуре (RT), затем повторно суспендируйте их в 500 мкл буфера для лизиса эритроцитов (RBC). Нейтрализуйте буфер для лизиса, добавив 3 мл готовой среды.
  13. Центрифугируйте ячейки при 450 x g в течение 7 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 5 мл готовой среды.
  14. Пропустите клеточную суспензию через стерильный полипропиленовый клеточный фильтр 70 мкм в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл для удаления клеточных агрегатов из лизированных эритроцитов.
  15. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
  16. Добавьте в питательную среду 300 нг/мл рекомбинантной тирозинкиназы 3, связанной с мышиной Fms (Flt3L).
  17. Поместите клетки в концентрацию 1 x 106 клеток/мл в многолуночный планшет.
  18. Инкубируйте клетки в течение 7 дней при 37 °C во влажной атмосфере с 5%CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте встряхивания клеток во время их дифференцировки и роста, чтобы предотвратить спонтанное созревание.
  19. На 3-й день удалите по 1 мл среды из каждой лунки (избегая нарушения работы клеток) и замените ее 1 мл предварительно подогретой свежей полной среды с добавлением 150 нг/мл рекомбинантной мышиной Flt3L.

5. Взаимодействие дендритных клеток, полученных из костного мозга, и внеклеточными везикулами E. granulosus

  1. Окрашивание мембраны внеклеточного везикулы
    1. Разморозьте sEV, хранящиеся на шаге 2.10, и держите их на льду.
    2. Ресуспендируйте 10 мкл очищенных sEV в 10 мкл маркировочного носителя (разбавитель C).
    3. Добавьте 20 μL 2x раствора красителя PKH26 для достижения конечной концентрации 2 μM. Аккуратно перемешайте с помощью пипетки и инкубируйте в течение 35 минут при температуре 37°C в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 2x раствор красителя PKH26 (4 мкМ) необходимо готовить непосредственно перед окрашиванием путем добавления 0,5 мкл раствора этанолового красителя PKH26 к 125 мкл разбавителя С.
    4. Аккуратно перемешивайте каждые 3–5 минут во время инкубации, чтобы обеспечить однородное окрашивание.
    5. Добавьте 40 мкл BSA 1% и инкубируйте в течение 10 минут при RT, чтобы остановить процесс окрашивания.
    6. Промойте sEV 1 мл PBS и центрифугируйте при 100 000 x g в течение 1 часа при 4 °C, чтобы удалить излишки красителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: К-фактор для ротора равен 103.
    7. Повторно суспендируйте гранулу в 90 мкл PBS в соответствии с протоколом, описанным в шаге 2.7.
  2. Стимуляция дендритных клеток, полученных из костного мозга мышей, внеклеточными везикулами E. granulosus
    1. Хорошо соберите дендритные клетки, полученные из костного мозга (BMDC) из культурального планшета и перенесите их в пробирки объемом 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обращайтесь осторожно, чтобы избежать самопроизвольного созревания клеток.
    2. Центрифугируйте среду при давлении 450 x g в течение 5 минут для гранулирования клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Резервируйте надосадочную жидкость из центрифугирования для повторного заполнения клеток на последующих этапах анализа проточной цитометрии.
    3. Ресуспендируйте BMDC в 30 мкл неокрашенных sEV с этапа 2.10 для анализа проточной цитометрии или в 90 μл PBS-содержащих окрашенных sEV с шага 5.1.7. для конфокальной микроскопии. Инкубировать в течение 30 минут при 37 °C во влажной атмосфере с 5%CO2. Аккуратно перемешивайте образец каждые 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения эффективного контакта между BMDC и sEV первые 30 минут инкубации следует проводить в минимальном объеме с использованием пробирок объемом 1,5 мл.
    4. Для конфокальной микроскопии переносите клетки на покровное стекло, обработанное алцианским синим (диаметром 12 мм), помещенное в 24-луночный планшет. Инкубировать еще 30 минут при 37 °C в увлажненной камере с 5 %CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка Alcian-blue придает положительный заряд покровному стеклу, облегчая адгезию отрицательно заряженных плазматических мембран BMDC.
      1. Чтобы приготовить покровные листы, погрузите их в фильтрованный 1% краситель Alcian Blue 8 GX и нагрейте в микроволновой печи в течение 1–2 минут, не доводя до кипения. Инкубируйте их в горячем растворе в течение 10 минут, перемешивая каждые 2-3 минуты.
      2. Затем промойте покровные стекла деионизированной дистиллированной водой, чтобы удалить излишки альцианского синего, и высушите их на бумажных полотенцах. Наконец, автоклавируйте покровные стекла и храните их в стерильных условиях до использования.
    5. Для анализа проточной цитометрии перенесите BMDCs-sEVs обратно в ту же лунку, из которой они были собраны (см. шаг 5.2.1), добавьте зарезервированные надосадочные жидкости из шага 5.2.2 и инкубируйте в течение 18 ч при 37 °C во влажной атмосфере с 5%CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте в лунке примерно 500 мкл среды, чтобы предотвратить высыхание оставшихся клеток после сбора.
    6. Используйте положительный и отрицательный контроль для оценки созревания BMDC. Стимулируйте клетки 100 нг/мл липополисахарида (ЛПС) в течение 18 ч в качестве положительного контроля. Для отрицательного контроля эндоцитоза инкубируйте BMDC с sEVs при 4 °C. Кроме того, включите контроль дендритных клеток без стимуляции.
  3. Конфокальная микроскопия внеклеточных везикул E. granulosus, захваченных и интернализованных дендритными клетками, полученными из костного мозга.
    1. После завершения инкубационного периода, описанного в шаге 5.2.4, отсадите PBS и выбросьте его из покровного стекла.
    2. Зафиксируйте BMDC, добавив 100 мкл 4% параформальдегида (PFA) на покровное стекло, и инкубируйте в течение 10 минут при RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что объем поддерживает поверхностное натяжение покровного стекла.
    3. Отсадите и выбросьте PFA, затем трижды промойте покровную крышку PBS-BSA 2%.
    4. Добавьте 100 мкл PBS, содержащего антитела против MHC класса II-FITC, разведенные в 1/100, и инкубируйте в течение 1 ч при RT в темноте.
    5. Отсадите и выбросьте раствор антитела, а покровное стекло трижды промойте с PBS-BSA 2%.
    6. Добавьте 100 мкл 50 нг/мл DAPI и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре во влажной камере для противостояния ядрам.
    7. Отсадите и слейте раствор красителя и промойте покровную крышку три раза PBS-BSA 2 %.
    8. Снимите покровный лист с помощью изогнутых тонконаправленных щипцов и высушите его на бумажном полотенце, чтобы удалить лишнюю жидкость.
    9. Установите покровное стекло лицевой стороной вниз на предметное стекло с помощью монтажного материала, состоящего из поливинилового спирта и глицерина. Дайте высохнуть в течение 2 часов при 37 °C или в течение ночи при 4 °C в темноте.
    10. Удалите пузырьки воздуха между покровным стеклом и предметным стеклом, осторожно надавливая на покровный лист щипцами.
    11. Наблюдайте за смонтированными образцами под конфокальным микроскопом с помощью 60-кратного масляного иммерсионного объектива с длиной волны возбуждения/излучения 485/538 нм для FITC, 358/461 нм для DAPI и 551/567 нм для PKH26.
  4. Фенотипическая оценка внеклеточных дендритных клеток, стимулированных костным мозгом, методом проточной цитометрии
    1. После инкубационного периода, описанного в шаге 5.2.5, соберите BMDC, промывая среду несколько раз вверх и вниз с помощью пипетки.
    2. Соберите среду, содержащую BMDC, и поместите ее в пробирки объемом 1,5 мл.
    3. Центрифугируйте при 450 x g в течение 5 минут при 4 °C для гранулирования клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: По желанию, чтобы проанализировать секрецию цитокинов, удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки, перенесите их в новые пробирки объемом 1,5 мл и храните при температуре -20 °C для дальнейших тестов иммуноферментного анализа (ИФА).
    4. Ресуспендируйте BMDC в 100 мкл PBS, содержащего флуоресцеин изотиоцианат (FITC), аллофикоцианин (APC) или миАТ, конъюгированные с фикоэритрином, направленными на CD11c, CD40, CD80, CD86, MHC класса I и MHC класса II, и инкубируйте в течение 15 мин при 4 °C в темноте.
    5. Промойте BMDC PBS и центрифугируйте при 450 × г в течение 5 минут при 4 °C.
    6. Ресуспендируйте BMDC в 500 мкл 1% PFA для фиксации и храните при 4 °C до получения в проточном цитометре.

Результаты

Блок-схема, обобщающая основные этапы поддержания чистых культур личинковой стадии E. granulosus , выделения и характеристики sEVs, а также их поглощения мышиными дендритными клетками, показана на рисунке 1. Для достижения высокой продукции sEV из E. granulosu...

Обсуждение

Протокольный процесс культивирования паразитов, выделения sEV, полученных от паразитов, дифференцировки дендритных клеток из костного мозга и анализа поглощения sEV этими клетками представлен на рисунке 1. Цель состояла в том, чтобы подробно описать каж...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Авторы признают Lic. Cecilia Gutiérrez Ayesta (Servicio de Microscopía Electrónica, CONICET, Bahía Blanca, Argentina) и Lic. Леонардо Сечи и Лик. Элиана Маза (INIFTA, Национальный университет Ла-Платы, Аргентина) за техническую помощь в области просвечивающей электронной микроскопии и динамического рассеяния света соответственно. Мы также благодарим Дру. Graciela Salerno, Dra. Корина Берон и д-р Гонсало Кало за использование ультрацентрифуги в INBIOTEC-CONICET-FIBA, Аргентина. Авторы выражают благодарность Lic. Kelly (SENASA, Мар-дель-Плата, Аргентина) и Lic. H. Núnez García (CONICET, Universidad Nacional de Mar del Plata, Argentina) за сотрудничество в оценке благополучия мышей, а также Med. Vet. J. Reyno, Med. Vet. S. Gonzalez, and Med. Vet L. Netti за их вклад в получение материала паразитов. Эта работа, включая затраты на эксперименты, реагенты и оборудование, была поддержана PICT 2020 No 1651, финансируемым ANPCyT.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL tubesHensoN14059
24-well plate JetBiofilCAP011024Polystyrene, flat bottom, Sterile
6-well plate  Henso Medical Co. Ltd.N14221Flat-shape bottom, PS material, Sterile
70 mm polypropylene cell strainerBiologix Group Limited15-1070Sterile
Alcian blue 8 GX dye Santa Cruzsc-214517B
Automatic CO2 incubatorNuarireUN-5100E/G DH
Bovine Serum AlbuminWiener lab1443151
CD11c Monoclonal antibody-PECy5   100 µgeBioscience15-0114-82clone (N418)
CD40 Monoclonal antibody-FITC 100 µgeBioscience11-0402-82clone (HM40-3)
CD80 Monoclonal antibody-APC 100 µgeBioscience17-0801-82clone (16-10A-1)
CD86 Monoclonal antibody-FITC  100 µgeBioscience11-0862-82clone (GL-1)
CentrifugeThermo ScientificIEC CL31R Multispeed
Confocal MicroscopeNikonNikon Confocal Microscope C1
Conical tubes 15 mL dia.17 x 120 mmCitotest4610-1865
DAPISigma107K4034
D-GlucoseMerk1.78343
Dimethyl Sulfoxide Anedra6646
Fetal Bovine Serum 500 mLSigma-Aldrich  12352207
Flow Cytometry SystemBD BiosciencesBD FACSCanto™ II
Folded Capillary Zeta Cell Malvern PanalyticalDTS1070
Gentamicin sulfate saltSigmaG1264
Glutaraldehyde solutionFluka49630
HepesGibco11344041
Hypodermic  needle 21 G x 1"25/8WeigaoSterile
Hypodermic  needle 25 G x 5/8"WeigaoSterile
Inverted microscope LeicaDMIL LED Fluo 
KetamineHolliday
Lipopolysaccharide  5 mgInvitrogentlrl-rslpsLPS from the Gram-negative bacteria E. coli K12 . TLR2/4 Agonists
Loperamide hydrochlorideSigma-Aldrich5.08162
Medium 199 Gibco11150059
Methylene BlueAnedra6337
MHC class I (H2kb) Monoclonal antibody-PE 100 µgeBioscience12-5958-82clone (AF6-88.5.5.3)
MHC class II (IA/IE) Monoclonal antibody-FITC  100 µgeBioscience11-5321-82clone (M5/114.15.2)
MicroscopeOlympusCX31
Mouse recombinant murine Flt3L.PrepoTech250-31L-10UG
NanodropThermo ScientificND-One
ParaformaldehydeAgar ScientificR1018
Penicillin G sodium saltSigmaP3032-10MU
PKH26Sigma-AldrichMINI26
Potassium Phosphate MonobasicTimperFor Phosphate Buffered Saline (PBS)
RBC lysis buffer 100 mLRoche11814389001
RPMI medium  1640 1x 500 mLSigma-Aldrich (Gibco)11875093
Sodium Cacodylate  Sigma-AldrichC0250
Sodium ChlorideAnedra7647-14-5For Phosphate Buffered Saline (PBS)
Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) p. a.Biopack1639.07For Phosphate Buffered Saline (PBS)
Streptomycin sulfate saltSigmaS9137
Syringe 10 mLBremenSterile
Thickwall polycarbonate tubesBeckman Coulter13 x 55 mm , nominal capacity 4 mL
Transmission Electron MicroscopeJeolJEOL JSM 100CX II
UltracentrifugeBeckmanOptima LE-80k 90 Ti rotor
XylazineRichmond
Zetasizer Nano Malvern Nano ZSizer-ZEN3600To perform Dynamic Light scattering and zeta potential measurements

Ссылки

  1. Wen, H., et al. Echinococcosis: advances in the 21st century. Clin Microbiol Rev. 32 (2), e00075-e00118 (2019).
  2. Geary, T. G., Thompson, D. P. Development of antiparasitic drugs in the 21st century. Vet Parasitol. 115 (2), 167-184 (2003).
  3. Drurey, C., Maizels, R. M. Helminth extracellular vesicles: Interactions with the host immune system. Mol Immunol. 137, 124-133 (2021).
  4. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J. Extracell Vesicles. 13 (2), e12404 (2024).
  5. Cresswell, P. Antigen processing and presentation. Immunol Rev. 207, 5-7 (2005).
  6. Buzas, E. I. The roles of extracellular vesicles in the immune system. Nat Rev Immunol. 23 (4), 236-250 (2023).
  7. Bennett, A. P. S., de la Torre-Escudero, E., Oliver, N. A. M., Huson, K. M., Robinson, M. W. The cellular and molecular origins of extracellular vesicles released by the helminth pathogen Fasciola hepatica. Int J Parasitol. 50 (9), 671-683 (2020).
  8. Drurey, C., Coakley, G., Maizels, R. M. Extracellular vesicles: new targets for vaccines against helminth parasites. Int J Parasitol. 50 (9), 623-633 (2020).
  9. Nicolao, M. C., et al. Characterization of protein cargo of Echinococcus granulosus extracellular vesicles in drug response and its influence on immune response. Parasit Vectors. 16 (1), 255 (2023).
  10. Sánchez-López, C. M., Trelis, M., Bernal, D., Marcilla, A. Overview of the interaction of helminth extracellular vesicles with the host and their potential functions and biological applications. Mol Immunol. 134, 228-235 (2021).
  11. Nicolao, M. C., Rodriguez, R. C., Cumino, A. C. Extracellular vesicles from Echinococcus granulosus larval stage: Isolation, characterization and uptake by dendritic cells. PLoS Negl Trop Dis. 13 (1), e0007032 (2019).
  12. Kuipers, M. E., et al. DC-SIGN mediated internalisation of glycosylated extracellular vesicles from Schistosoma mansoni increases activation of monocyte-derived dendritic cells. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1753420 (2020).
  13. Murphy, A., et al. Fasciola hepatica extracellular vesicles isolated from excretory-secretory products using a gravity flow method modulate dendritic cell phenotype and activity. PLoS Negl Trop Dis. 14 (9), e0008626 (2020).
  14. Ricciardi, A., et al. Extracellular vesicles released from the filarial parasite Brugia malayi downregulate the host mTOR pathway. PLoS Negl Trop Dis. 15 (1), e0008884 (2021).
  15. Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nat Protoc. 18 (5), 1462-1487 (2023).
  16. Brezgin, S., et al. Basic guide for approaching drug delivery with extracellular vesicles. Int J Mol Sci. 25 (19), 10401 (2024).
  17. Pinheiro, A. A., et al. Potential of extracellular vesicles in the pathogenesis, diagnosis, and therapy for parasitic diseases. J Extracell Vesicles. 13 (8), e12496 (2024).
  18. Barnadas-Carceller, B., Del Portillo, H. A., Fernandez-Becerra, C. Extracellular vesicles as biomarkers in parasitic disease diagnosis. Curr Top Membr. 94, 187-223 (2024).
  19. Nicolao, M. C., Denegri, G. M., Carcamo, J. G., Cumino, A. C. P-glycoprotein expression and pharmacological modulation in larval stages of Echinococcus granulosus. Parasitol Int. 63 (1), 1-8 (2014).
  20. Nicolao, M. C., Cumino, A. C. Biochemical and molecular characterization of the calcineurin in Echinococcus granulosus larval stages. Acta Trop. 146, 141-151 (2015).
  21. Savina, A., Furlan, M., Vidal, M., Colombo, M. I. Exosome release is regulated by a calcium-dependent mechanism in K562 cells. J Biol Chem. 278 (22), 20083-20090 (2003).
  22. Ambattu, L. A., et al. High frequency acoustic cell stimulation promotes exosome generation regulated by a calcium-dependent mechanism. Commun Biol. 3 (1), 553 (2020).
  23. White, R., et al. Special considerations for studies of extracellular vesicles from parasitic helminths: A community-led roadmap to increase rigour and reproducibility. J Extracell Vesicles. 12 (1), e12298 (2023).
  24. Casado, N., Rodriguez-Caabeiro, F., Hernandez, S. In vitro survival of Echinococcus granulosus protoscolices in several media, at +4 degrees C and +37 degrees C. Z Parasitenkd. 72 (2), 273-278 (1986).
  25. Casado, N., Rodriguez-Caabeiro, F., Jiménez, A., Criado, A., de Armas, C. In vitro effects of levamisole and ivermectin against Echinococcus granulosus protoscoleces. Int J Parasitol. 19 (8), 945-947 (1989).
  26. Al-Lamki, R. S., Bradley, J. R., Pober, J. S. Human organ culture: updating the approach to bridge the gap from in vitro to in vivo in inflammation, cancer, and stem cell biology. Front Med. 4, 148 (2017).
  27. Rodriguez-Caabeiro, F., Casado, N. Evidence of in vitro germinal layer development in Echinococcus granulosus cysts. Parasitol Res. 74 (6), 558-562 (1988).
  28. Loos, J. A., Cumino, A. C. In vitro anti-echinococcal and metabolic effects of metformin involve activation of AMP-activated protein kinase in larval stages of Echinococcus granulosus. PLoS One. 10 (5), e0126009 (2015).
  29. Erwin, N., Serafim, M. F., He, M. Enhancing the cellular production of extracellular vesicles for developing therapeutic applications. Phar. Res. 40 (4), 833-853 (2023).
  30. Sako, Y., et al. Identification of a novel small molecule that enhances the release of extracellular vesicles with immunostimulatory potency via induction of calcium influx. ACS Chem Biol. 18 (4), 982-993 (2023).
  31. He, L. P., Mears, D., Atwater, I., Rojas, E., Cleemann, L. Loperamide mobilizes intracellular Ca2+ stores in insulin-secreting HIT-T15 cells. Br J Pharmacol. 139 (2), 351-361 (2003).
  32. Dalton, J. P., Skelly, P., Halton, D. W. Role of the tegument and gut in nutrient uptake by parasitic platyhelminths. Can J Zool. 82 (2), 211-232 (2004).
  33. Dos Santos, G. B., et al. Excretory/secretory products in the Echinococcus granulosus metacestode: is the intermediate host complacent with infection caused by the larval form of the parasite. Int J Parasitol. 46 (13-14), 843-856 (2016).
  34. Siles-Lucas, M., et al. Isolation and characterization of exosomes derived from fertile sheep hydatid cysts. Vet Parasitol. 236, 22-22 (2017).
  35. Yang, J., et al. Identification of different extracellular vesicles in the hydatid fluid of Echinococcus granulosus and immunomodulatory effects of 110 K EVs on sheep PBMCs. Front Immunol. 12, 602717 (2021).
  36. Khosravi, M., et al. Characterisation of extracellular vesicles isolated from hydatid cyst fluid and evaluation of immunomodulatory effects on human monocytes. J Cell Mol Med. 27 (17), 2614-2625 (2023).
  37. Sotillo, J., et al. The protein and microRNA cargo of extracellular vesicles from parasitic helminths–current status and research priorities. Int J Parasitol. 50 (9), 635-645 (2020).
  38. Kuipers, M. E., et al. Optimized protocol for the isolation of extracellular vesicles from the parasitic worm Schistosoma mansoni with improved purity, concentration, and yield. J Immunol Res. 2022 (1), 5473763 (2022).
  39. Fernandez-Becerra, C., et al. Guidelines for the purification and characterization of extracellular vesicles of parasites. J Extracell Biol. 2 (10), e117 (2023).
  40. Chaiyadet, S., et al. Silencing of Opisthorchis viverrini tetraspanin gene expression results in reduced secretion of extracellular vesicles. Front Cell Infect Microbiol. 12, 827521 (2022).
  41. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  42. Szatanek, R., et al. The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization. Int J Mol Sci. 18 (6), 1153 (2017).
  43. Blundell, E. L. C. J., Mayne, L. J., Billinge, E. R., Platt, M. Emergence of tunable resistive pulse sensing as a biosensor. Anal Methods. 7 (17), 7055-7066 (2015).
  44. Vucetic, A., Filho, A., Dong, G., Olivier, M. Isolation of extracellular vesicles from Leishmania spp. Methods Mol Biol. , 555-574 (2020).
  45. Caputo, F., et al. Measuring particle size distribution and mass concentration of nanoplastics and microplastics: Addressing some analytical challenges in the submicron size range. J Colloid Interface Sci. 588, 401-417 (2021).
  46. Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nat Protoc. 16 (3), 1548-1580 (2021).
  47. Trombetta, E. S., Mellman, I. The cell biological basis of antigen presentation in vitro and in vivo. Ann Rev Immunol. 23 (1), 975-1028 (2005).
  48. Hammer, G. E., Ma, A. Molecular control of state dendritic cell maturation and immuno homeostasis. Ann Rev Immunol. 31 (1), 743-791 (2013).
  49. Weigel, B. J., et al. Comparative analysis of murine marrow–derived dendritic cells generated by Flt3L or GM-CSF/IL-4 and matured with immune stimulatory agents on the in vivo induction of antileukemia responses. Blood. 100 (12), 4169-4176 (2002).
  50. March, N., et al. Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand. Cancer Res. 60, 3239-3246 (2000).
  51. Heath, W. R., et al. Cross-presentation, dendritic cell subsets, and the generation of immunity to cellular antigens. Immunol Rev. 199 (1), 9-26 (2004).
  52. Naik, S., et al. Cutting edge: generation of splenic CD8+ and CD8− dendritic cell equivalents in Fms-like tyrosine kinase 3 ligand bone marrow cultures. J Immunol. 174 (11), 6592-6597 (2005).
  53. Sauter, M., et al. Protocol to isolate and analyze mouse bone marrow derived dendritic cells (BMDC). STAR Protoc. 3 (3), 101664 (2022).
  54. Helft, J., et al. GM-CSF mouse bone marrow cultures comprise a heterogeneous population of CD11c(+) MHCII(+) macrophages and dendritic cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
  55. Borup, A., et al. Comparison of separation methods for immunomodulatory extracellular vesicles from helminths. J Extracell Biol. 1 (5), e41 (2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

217Echinococcus granulosusEV

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены