הערכת תפקוד הריאות במודל עכברי ex vivo

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה מדורגת לניתוח מכניקת הנשימה של מודל עכברי ex vivo באמצעות טכניקת התנודה הכפויה (FOT).

Abstract

מכניקת הנשימה היא תחום מחקר מרכזי בהגדרה וטיפול בפתולוגיות ריאה על ידי הערכת קיבולת ריאות תפקודית. ניתן להעריך את מכניקת הריאות באמצעות תמרוני ריאות שונים הכוללים צורות גל תנודתיות שונות. כאשר הם מיושמים על הריאות, תמרונים אלה מודדים משתנים מרובים, כגון לחץ, נפח וזרימה, בהתבסס על התגובה לצורות הגל. לאחר מכן אותות אלה מחושבים ומנותחים כדי לקבוע פרמטרים כגון היסטריה, התנגדות, תאימות, שיכוך רקמות וגמישות רקמות, ומספקים הערכה מפורטת של תפקוד הריאות הכולל. ניתוח מכניקת הנשימה חשוב במיוחד בהערכת ריאות התורם להשתלת ריאות. הפרוטוקול הנוכחי הוא הראשון מסוגו, המציע שיטה הדרגתית מקיפה וניתנת לשחזור להערכת מכניקת הנשימה באמצעות מודל עכברים ex vivo . הוא כולל פרטים על מודל בעלי החיים הנבחר, התאוששות ריאות, אחסון ושימור וניסויים באמצעות מערכת מבוססת טכניקת תנודה מאולצת. בנוסף, הוא מתאר ניתוח נתונים, משמעות קלינית והיישומים של טכניקת התנודה הכפויה בחקר מודל ex vivo .

Introduction

השתלת ריאות מייצגת את הטיפול העמיד היחיד למחלות ריאה סופניות. כ-4,600 אנשים עוברים השתלות ריאה מדי שנה ברחבי העולם, אך כמעט 600 חולים מתים ברשימת ההמתנה משנית למחסור בריאות תורם מתאימות ^1,2. במאמצים להגדיל את מאגר הריאות הזמין, מערכות הקצאת התורמים מותאמות ללא הרף, מה שהוביל למנתחים לנסוע למרחקים ארוכים יותר כדי לאבטח את איברי התורם³. המרחקים המוגדלים תמיד מגדילים את הזמן האיסכמי הקר, ומציגים צורך בשיטות נוספות לשימור איברים.

התקן הנוכחי לשימור איברים מתורם של השתלת ריאות הוא שימור סטטי קר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, המגביל את זמן השימור ל-6-8 שעות - חלון כדאיות קטן להשתלה⁴. עם זאת, עם מרחקי נסיעה ארוכים יותר וכתוצאה מכך עלייה בזמנים איסכמיים, הערכת תפקוד הריאות לפני ההשתלה חשובה ביותר⁴. עם התפתחות המדיניות להשתלת ריאות, נערך מחקר חדשני כדי לענות על צורך זה. לאחרונה, מחקרים הציעו כי שימור סטטי קר ב-10 מעלות צלזיוס הוא טמפרטורת אחסון אופטימלית יותר לשימור ריאות עם שיפור כתוצאה מכך בתפקוד הריאות, עמידות בפני פציעות ושיעורים דומים של תפקוד לקוי של השתל ראשוני בעת השתלה 4,5,6,7,8. יתר על כן, מחקר המתמקד בזלוף ריאות ex vivo (EVLP) הראה שיפור משמעותי בניצול הריאות של התורם ובהשתלות מבלי לפגוע בנמענים⁹. בעוד שהשימוש ב-EVLP להרחבת מאגר התורמים להשתלת ריאות והארכת זמן השימור מתועד היטב, טכנולוגיה זו יקרה, עתירת זמן ודורשת הכשרה מיוחדת לביצוע¹⁰. ככזה, יש צורך בשיטות נוספות לחקר תפקוד ריאות ex vivo שהן מקיפות וזולות וניתנות לשחזור.

ניתן לקבוע באופן אמין מדדים מסורתיים של מכניקת ריאות, למשל, תאימות, התנגדות, אלסטנס ועקומות לחץ-נפח, באמצעות פלתיסמוגרפיה של הגוף או עם טכניקות הנשמה באמצעות מודל חד-תא. ניתן להשיג מכניקה מפורטת יותר באמצעות מודל התנודה המאולצת כדי להתאים למודל הפאזה הקבועה, שיכול לחלק את מכניקת דרכי הנשימה לתאים מרכזיים והיקפיים (התנגדות ניוטונית, שיכוך/אלסטנטיות של רקמות, היסטריה)^11. בעוד שהיישום של טכניקות אלה ניתן לשחזור ומקיף, מגבלה עד כה הייתה הדרישה לבצע אמצעים כאלה במודל in-vivo, ככל הנראה מכיוון שהריאה האקסנגווינית מאבדת מבנה בטבעת הכניסה המכתשית¹². מחקר זה השתמש במכונת הנשמה מכרסמים קטנה המבוססת על טכניקת תנודה מאולצת זמינה מסחרית במטרה לפתח מודל ex vivo כדי לאפיין טוב יותר את מכניקת הריאות ליישומי השתלת ריאות.

Protocol

מחקר זה אושר על ידי הוועדה לחקר בעלי חיים בהתאם למדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. נעשה שימוש בעכברים מסוג בר C57Bl/6, בגילאי 6-8 שבועות ובמשקל שבין 18-28 גרם. פרטים על הריאגנטים והציוד מסופקים בטבלת החומרים.

1. הכנה

1. השתמש במיקרוסקופ ניתוח עם הגדלה של עד פי 20 לכל ההליכים הכירורגיים.
2. נקה ועיקר את כל המכשירים הכירורגיים לפני תחילת ההליך. מכשירי חיטוי או השתמש בתמיסת עיקור מתאימה לשמירה על תנאים אספטיים.

2. שאיבת ריאות תורם

1. בצע את כל הפעולות בתנאים סטריליים.
   הערה: שלב זה מבוצע בחלל כירורגי ייעודי ובתנאים סטריליים.
2. הכניסו את העכבר לתא אינדוקציה להרדמה וגרמו להרדמה עם 5% איזופלורן בחמצן ושמרו על הרדמה עם 3.5% איזופלורן בחמצן לאורך כל ההליך (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד).
3. רשום את משקל העכבר לפני החתך הראשון.
4. אבטח את העכבר על שולחן הניתוחים והקפד על עומק הרדמה מתאים על ידי הפעלת לחץ על הבוהן. אם העכבר נסוג מכאב, הגדל את ההרדמה לפי הצורך.
5. הסר את הריאות מהתורם בהתאם להליך סטנדרטי¹³.
   הערה: הריאות והלב חולצו בבלוק כדי לחלחל את הריאות ex vivo, וחלק מקנה הנשימה הוסר לאינטובציה מאוחרת יותר.

3. אחסון ושימור ריאות

1. לאחר הוצאת הריאות מהתורם, יש להחדיר את קנה הנשימה עם צנתר אנגיו-ורידי 18 G על ידי קידום זהיר של הקטטר, כדי לוודא שהוא לא מנקב את קנה הנשימה.
2. אבטח את קנה הנשימה מעל הצינורית באמצעות תפר משי 3-0, והבטיח אטימה הדוקה. קדם את האנגיו-צנתר התוך-ורידי 18 G עד שהוא נמצא בתוך דרכי היציאה של החדר הימני (RVOT), ממש מעבר למסתם הריאתי.
3. רשום את הזמן שבו הריאות הוצאו מהגוף.
4. אחסן את הריאות בצינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל את תמיסת השימור הזמינה מסחרית בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או 10 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

4. הגדרה וכיול

1. התחל בהפעלת המערכת ו/או התוכנה.
2. הפעל את התוכנית, לחץ על כפתור צור מחקר חדש ופעל לפי ההנחיות שעל המסך כדי להגדיר את הפרוטוקול ולהקצות נבדקים.
3. לחץ על מפגש ניסוי והיכנס באמצעות ראשי התיבות הראשון והאחרון של המשתמש.
4. התחל לתייג נושאים לפי מוסכמה עקבית למתן שמות.
5. הזן את פרטי המין, תאריך הלידה והמשקל של כל נושא.
6. בחר והקצה נבדקים לאתר המדידה ואשר משקולות.
7. המשך בהגדרה ובכיול של התוכנה על ידי ביצוע ההנחיות שעל המסך.
   הערה: במהלך כיול הצינור, אותו סוג של צינורית ששימשה באינטובציה של ריאות התורם הוצמד לצינור ה-Y של המערכת כדי להבטיח עקביות.
8. חזור על הכיול אם ערכי הכיול נמצאים מחוץ לטווחים המקובלים.
9. בטל את ההנחיות להתחיל באוורור עד שיהיה מוכן. ניתן להתחיל מפגשים ניסיוניים עם אוורור והקלטת נתונים מאוחר יותר.

5. אוורור ריאות ואיסוף נתונים

1. הסר את הריאות מהצינור החרוטי של 50 מ"ל. שטוף את דרכי היציאה של החדר הימני (RVOT) באמצעות צנתר אנגיו-ורידי 18 גרם שהונח קודם לכן עם תמיסת שימור נוספת במינון של 60 מ"ל/ק"ג כדי לשטוף את נימי הריאות.
   הערה: יש לנקוט בזהירות רבה כדי למנוע התייבשות של ריאות התורם מכיוון שזהו מבלבל ידוע בחקר מכניקת הריאות.
2. אבטח את ריאות התורם למכונת ההנשמה והתחל בניסוי.
3. לחץ על התחל אוורור, וכשמוכן, לחץ על התחל הקלטה כדי להתחיל את ההפעלה הניסיונית.
   הערה: מכונת ההנשמה ששימשה למחקר זה נקבעה להיות בעלת קצב נשימה של 150 נשימות לדקה, נפח גאות של 10 מ"ל/ק"ג ו-PEEP של 3.
4. הפעל כל משימה על ידי לחיצה כפולה על המשימה להערכות מכניקת ריאות מרשימת המשימות בצד ימין של הדף.
5. הפעל את משימת האינפלציה העמוקה הממוקמת ברשימת המשימות כדי להבטיח עוד יותר שאזורים אטלקטיים מגויסים ונפחי הריאות מתוקננים. לפרטים, עיין בסעיף תוצאות.
6. המשך ברצף המשימות.
   הערה: ניתן להעריך את תפקוד הריאות באמצעות משימות מרובות להערכת תכונות מכניות. Deep Inflation מתקנן את נפח הריאות, בעוד Prime-8 מייצב את מכניקת הריאות. PV-P ו-PV-V מודדים תאימות סטטית ודינמית, התנגדות דרכי הנשימה ומוליכות. Snapshot 150 מספק הערכה מהירה של עמידות, תאימות ועמידות, בעוד ש-QuickPrime מעריך את עמידות דרכי הנשימה והרקמות יחד עם צמיגות הריאות. משימות אלה מבטיחות ביחד ניתוח מקיף של תפקוד הריאות. במאמר זה, הנתונים עבור המשימות שבוצעו ב-Deep Inflation, Snapshot 150 ו-QuickPrime (באמצעות ציוד זמין מסחרית) מסופקים כתוצאות מייצגות. נפחי הריאות תוקננו בין הפרעות באמצעות משימת האינפלציה העמוקה על מנת למזער משתנים מבלבלים בעת פירוש הנתונים.
7. הפעל את רצף המשימות הנבחר בשלוש עותקים.
8. לחץ על הפסק הקלטה ולאחר מכן על הפסק אוורור.
9. ייצא נתונים בנפרד או המשך לנושא הבא וחזור על שלבים 5.1-5.9.
   הערה: עבור נתונים הנגזרים מהפרעות Snapshot 150 ו-QuickPrime, נדרש COD של >0.95 לניתוח אמין.

תוצאות

תיאור גרפי של העיצוב הניסיוני מסופק עבור מודל העכבר (איור 1). הריאות נופחו באמצעות מערכת הנשמה של מכרסמים קטנים המבוססת על טכניקת תנודה מאולצת זמינה מסחרית כדי להעריך את מכניקת הנשימה של רקמת התורם בתנאים שונים (איור 2). כאשר משווים את התוצ?...

Discussion

חשיבות ויישומים פוטנציאליים
מכניקת נשימה משמשת באופן שגרתי ביישומים שונים לחקר פתולוגיה של ריאות ופגיעה בריאות. חקר מכניקת הנשימה תואר פעמים רבות להתקדמות מחלות כגון ARDS ובמקרים של הנשמה מסייעת, אך תואר הרבה פחות בספרות בכל הנוגע להשתלת איברים 15,16,17,18,19.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G angio-catheter	B. Braun	4251687-02	Straight hub
24 G angio-catheter	B. Braun	4251601-02	Straight hub
3 mL syringe	Fisher Scientific	14-823-41
3-0 silk suture	Medex	ETH-A304H
50 mL conical tubes	Thermo Fisher	339652
70% EtOH	Fisher Scientific	BP82031GAL
Anesthesia induction chamber	Harvard Apparatus	75-2030	Air-tight induction chamber for rats
Anesthesia machine	Harvard Apparatus	75-0238	Mobile anesthesia system with passive scavenging
Anesthesia mask	Harvard Apparatus	59-8255	Rat anesthesia mask
Blunt micro forceps	World Precision Instruments	501217	Dressing forceps, 12.5 cm, straight, serrated
C57Bl/6 mice	Charles River	Strain Code 027	Wild type, 6-8 weeks, 18-28g
Digital weight scale	Fisher Scientific	S72422
FlexiVent system	Scireq	NC2926059	forced oscillation technique-based small rodent ventilator
Insulin syringe, 1 mL	Fisher Scientific	14-841-33
Isoflurane, USP	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Operating microscope or surgical loupes	AmScope	SM-3BZ-80S	3.5x - 90x Stereo Microscope
Perfadex solution	Xvivo	19811, 19850
Petri dishes	Fisher Scientific	FB0875714
Sterile cotton swabs	Puritan	25-806 1WC
Sterile gauze sponges	Fisher Scientific	22-037-902
Surgical scissors	World Precision Instruments	1962C	Metzenbaum scissors