Avaliação da Função Pulmonar em um Modelo Murino Ex vivo

Resumo

O presente protocolo descreve um método passo a passo para analisar a mecânica respiratória de um modelo murino ex vivo usando a técnica de oscilação forçada (FOT).

Resumo

A mecânica respiratória é uma área chave de estudo na definição e tratamento de patologias pulmonares, avaliando a capacidade pulmonar funcional. A mecânica pulmonar pode ser avaliada por meio de várias manobras pulmonares que envolvem diferentes formas de onda oscilatórias. Quando aplicadas aos pulmões, essas manobras medem múltiplas variáveis, como pressão, volume e fluxo, com base na resposta às formas de onda. Esses sinais são então calculados e analisados para determinar parâmetros como histerose, resistência, complacência, amortecimento do tecido e elastância do tecido, fornecendo uma avaliação detalhada da função pulmonar geral. A análise da mecânica respiratória é particularmente importante na avaliação de pulmões de doadores para transplante pulmonar. O presente protocolo é o primeiro de seu tipo, oferecendo um método passo a passo abrangente e reprodutível para avaliar a mecânica respiratória usando um modelo murino ex vivo . Inclui detalhes sobre o modelo animal selecionado, recuperação, armazenamento e preservação pulmonar e experimentação usando um sistema baseado na técnica de oscilação forçada. Além disso, descreve a análise de dados, o significado clínico e as aplicações da técnica de oscilação forçada no estudo de um modelo ex vivo .

Introdução

O transplante de pulmão representa o único tratamento durável para doenças pulmonares em estágio terminal. Aproximadamente 4.600 pessoas recebem transplantes de pulmão a cada ano em todo o mundo, mas quase 600 pacientes morrem na lista de espera devido à escassez de pulmões de doadores adequados ^1,2. Nos esforços para aumentar o pool de pulmões disponíveis, os sistemas de alocação de doadores são continuamente ajustados, o que levou os cirurgiões a percorrer distâncias maiores para garantir os órgãos dos doadores³. O aumento das distâncias invariavelmente aumenta o tempo de isquemia fria, apresentando a necessidade de métodos adicionais de preservação de órgãos.

O padrão atual para preservação de órgãos de doadores de transplante pulmonar é a preservação estática a frio a 4 °C, limitando o tempo de preservação a 6-8 h - uma pequena janela de viabilidade para o transplante⁴. No entanto, com distâncias de viagem mais longas e aumento dos tempos de isquemia resultantes, a avaliação da função pulmonar antes do transplante é extremamente importante⁴. Com a evolução das políticas de transplante de pulmão, novas pesquisas foram realizadas para atender a essa necessidade. Recentemente, estudos sugeriram que a preservação estática fria a 10 °C é uma temperatura de armazenamento mais ideal para preservação pulmonar, com consequente melhora na função pulmonar, resistência a lesões e taxas comparáveis de disfunção primária do enxerto quando implantado 4,5,6,7,8. Além disso, pesquisas centradas na perfusão pulmonar ex vivo (PPEV) mostraram melhora significativa na utilização do pulmão do doador e nos transplantes sem prejuízo para os receptores⁹. Embora o uso da PPEV para expandir o pool de doadores para transplante de pulmão e estender o tempo de preservação esteja bem documentado, essa tecnologia é cara, demorada e requer treinamento especializado para ser realizada¹⁰. Como tal, há necessidade de métodos adicionais para estudar a função pulmonar ex vivo que sejam abrangentes, baratos e reprodutíveis.

As medidas tradicionais da mecânica pulmonar, por exemplo, complacência, resistência, elastância e curvas de pressão-volume, podem ser determinadas de forma confiável usando pletismografia corporal ou com técnicas de ventilação usando um modelo de compartimento único. Uma mecânica mais detalhada pode ser obtida usando o modelo de oscilação forçada para ajustar o modelo de fase constante, que pode dividir a mecânica das vias aéreas em compartimentos centrais e periféricos (resistência newtoniana, amortecimento/elastância tecidual, histeresividade)^11. Embora a aplicação dessas técnicas seja reprodutível e abrangente, uma limitação até o momento tem sido a exigência de realizar tais medidas em um modelo in vivo, presumivelmente porque o pulmão exsanguinado perde estrutura no anel de entrada alveolar¹². Este estudo utilizou um ventilador de pequenos roedores baseado em técnica de oscilação forçada disponível comercialmente com o objetivo de desenvolver um modelo ex vivo para melhor caracterizar a mecânica pulmonar para aplicações de transplante de pulmão.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Pesquisa Animal de acordo com o Guia do National Institutes of Health para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Foram utilizados camundongos C57Bl/6 do tipo selvagem, com idade entre 6-8 semanas e pesando entre 18-28 g. Detalhes dos reagentes e equipamentos são fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Preparação

1. Use um microscópio cirúrgico com ampliação de até 20x para todos os procedimentos cirúrgicos.
2. Limpe e esterilize todos os instrumentos cirúrgicos antes de iniciar o procedimento. Autoclave instrumentos ou use uma solução esterilizante adequada para manter as condições assépticas.

2. Extração de pulmões de doadores

1. Execute todas as operações em condições estéreis.
   NOTA: Esta etapa é realizada em um espaço cirúrgico dedicado e em condições estéreis.
2. Coloque o camundongo em uma câmara de indução anestésica e induza a anestesia com isoflurano a 5% em oxigênio e mantenha a anestesia com isoflurano a 3,5% em oxigênio durante todo o procedimento (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
3. Registre o peso do mouse antes da primeira incisão.
4. Prenda o mouse na mesa de operação e garanta a profundidade adequada da anestesia aplicando pressão no dedo do pé. Se o camundongo se retirar com dor, aumente a anestesia conforme necessário.
5. Remover os pulmões do doador seguindo o procedimento padrão¹³.
   NOTA: Os pulmões e o coração foram extraídos em bloco para perfundir os pulmões ex vivo, e uma parte da traqueia foi removida para posterior intubação.

3. Armazenamento e preservação pulmonar

1. Uma vez que os pulmões são removidos do doador, intubar a traqueia com um angiocateter intravenoso 18 G, avançando cuidadosamente o cateter, garantindo que ele não perfure a traqueia.
2. Prenda a traqueia sobre a cânula usando uma sutura de seda 3-0, garantindo uma vedação hermética. Avance o angiocateter intravenoso 18 G até que esteja dentro da via de saída do ventrículo direito (VSVD), logo após a válvula pulmonar.
3. Registre o tempo em que os pulmões foram removidos do corpo.
4. Conservar os pulmões num tubo cónico de 50 ml contendo a solução de conservação comercialmente disponível a 4 °C ou 10 °C durante a noite.

4. Configuração e calibração

1. Comece ligando o sistema e/ou software.
2. Inicie o programa, clique no botão Criar um novo estudo e siga as instruções na tela para definir o protocolo e atribuir assuntos.
3. Clique em Sessão de Experimentação e faça login usando a primeira e a última iniciais do usuário.
4. Comece a rotular os assuntos por uma convenção de nomenclatura consistente.
5. Insira as informações de sexo, data de nascimento e peso de cada sujeito.
6. Selecione e atribua assuntos ao local de medição e confirme os pesos.
7. Continue a configuração e a calibração do software seguindo as instruções na tela.
   NOTA: Durante a calibração do tubo, o mesmo tipo de cânula usada na intubação dos pulmões doadores foi acoplada ao tubo em Y do sistema para garantir a consistência.
8. Repita a calibração se os valores de calibração estiverem fora dos intervalos aceitos.
9. Cancele os prompts para iniciar a ventilação até que esteja pronto. Sessões experimentais com ventilação e registro de dados podem ser iniciadas posteriormente.

5. Ventilação pulmonar e aquisição de dados

1. Remova os pulmões do tubo cônico de 50 mL. Lave a via de saída do ventrículo direito (VSVD) usando o angiocateter intravenoso 18 G previamente colocado com solução de preservação adicional na dose de 60 mL / kg para lavar os capilares pulmonares.
   NOTA: Deve-se tomar muito cuidado para evitar a desidratação dos pulmões do doador, pois este é um fator de confusão conhecido no estudo da mecânica pulmonar.
2. Prenda os pulmões do doador à máquina do ventilador e comece o experimento.
3. Clique em Iniciar ventilação e, quando estiver pronto, pressione Iniciar gravação para iniciar a sessão experimental.
   NOTA: O ventilador utilizado para este estudo foi configurado para ter uma frequência respiratória de 150 respirações/min, um volume corrente de 10 mL/kg e uma PEEP de 3.
4. Execute cada tarefa clicando duas vezes na tarefa para avaliações de mecânica pulmonar na lista de tarefas no lado direito da página.
5. Execute a tarefa de Inflação Profunda localizada na lista de tarefas para garantir ainda mais que as regiões atelectásicas sejam recrutadas e os volumes pulmonares tenham sido padronizados. Para obter detalhes, consulte a seção Resultados.
6. Prossiga com a sequência de tarefas.
   NOTA: A função pulmonar pode ser avaliada por meio de várias tarefas de avaliação de propriedades mecânicas. O Deep Inflation padroniza o volume pulmonar, enquanto o Prime-8 estabiliza a mecânica pulmonar. O PV-P e o PV-V medem a complacência estática e dinâmica, a resistência das vias aéreas e a condutância. O Snapshot 150 fornece uma avaliação rápida da resistência, complacência e elastância, enquanto o QuickPrime avalia a resistência das vias aéreas e dos tecidos junto com a viscoelasticidade pulmonar. Essas tarefas coletivamente garantem uma análise abrangente da função pulmonar. Neste artigo, os dados das tarefas executadas no Deep Inflation, Snapshot 150 e QuickPrime (usando equipamentos disponíveis comercialmente) são fornecidos como resultados representativos. Os volumes pulmonares foram padronizados entre as perturbações usando a tarefa de Insuflação Profunda, a fim de minimizar as variáveis de confusão na interpretação dos dados.
7. Execute a sequência escolhida de tarefas em triplicado.
8. Clique em Parar Gravação e depois em Parar Ventilação.
9. Exporte os dados individualmente ou continue para o próximo assunto e repita as etapas 5.1-5.9.
   NOTA: Para dados derivados das perturbações do Snapshot 150 e QuickPrime, é necessário um COD de >0,95 para uma análise confiável.

Resultados

Uma representação gráfica do projeto experimental é fornecida para o modelo de camundongo (Figura 1). Os pulmões foram inflados usando um sistema de ventilação de pequenos roedores baseado na técnica de oscilação forçada disponível comercialmente para avaliar a mecânica respiratória do tecido doador sob várias condições (Figura 2). Ao comparar os resultados entre os grupos de pulmões de doadores preservados, os...

Discussão

Importância e potenciais aplicações
A mecânica respiratória é usada rotineiramente em várias aplicações para estudar patologia pulmonar e lesão pulmonar. O estudo da mecânica respiratória tem sido descrito muitas vezes para a progressão de doenças como a SDRA e em casos de ventilação assistida, mas tem sido descrito muito menos na literatura no que se refere ao transplante de órgãos 15,16,17,18,19.^...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G angio-catheter	B. Braun	4251687-02	Straight hub
24 G angio-catheter	B. Braun	4251601-02	Straight hub
3 mL syringe	Fisher Scientific	14-823-41
3-0 silk suture	Medex	ETH-A304H
50 mL conical tubes	Thermo Fisher	339652
70% EtOH	Fisher Scientific	BP82031GAL
Anesthesia induction chamber	Harvard Apparatus	75-2030	Air-tight induction chamber for rats
Anesthesia machine	Harvard Apparatus	75-0238	Mobile anesthesia system with passive scavenging
Anesthesia mask	Harvard Apparatus	59-8255	Rat anesthesia mask
Blunt micro forceps	World Precision Instruments	501217	Dressing forceps, 12.5 cm, straight, serrated
C57Bl/6 mice	Charles River	Strain Code 027	Wild type, 6-8 weeks, 18-28g
Digital weight scale	Fisher Scientific	S72422
FlexiVent system	Scireq	NC2926059	forced oscillation technique-based small rodent ventilator
Insulin syringe, 1 mL	Fisher Scientific	14-841-33
Isoflurane, USP	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Operating microscope or surgical loupes	AmScope	SM-3BZ-80S	3.5x - 90x Stereo Microscope
Perfadex solution	Xvivo	19811, 19850
Petri dishes	Fisher Scientific	FB0875714
Sterile cotton swabs	Puritan	25-806 1WC
Sterile gauze sponges	Fisher Scientific	22-037-902
Surgical scissors	World Precision Instruments	1962C	Metzenbaum scissors