Ex vivo Murin Modelinde Akciğer Fonksiyonunun Değerlendirilmesi

Özet

Mevcut protokol, zorlanmış salınım tekniğini (FOT) kullanarak bir ex vivo murin modelinin solunum mekaniğini analiz etmek için aşamalı bir yöntemi açıklamaktadır.

Özet

Solunum mekaniği, fonksiyonel akciğer kapasitesini değerlendirerek akciğer patolojilerinin tanımlanması ve tedavisinde önemli bir çalışma alanıdır. Akciğer mekaniği, farklı salınım dalga formlarını içeren çeşitli akciğer manevraları ile değerlendirilebilir. Akciğerlere uygulandığında, bu manevralar dalga formlarına verilen cevaba bağlı olarak basınç, hacim ve akış gibi çoklu değişkenleri ölçer. Bu sinyaller daha sonra histerizivite, direnç, uyum, doku sönümlemesi ve doku elastikansı gibi parametreleri belirlemek için hesaplanır ve analiz edilir ve genel akciğer fonksiyonunun ayrıntılı bir değerlendirmesini sağlar. Solunum mekaniğinin analizi, akciğer nakli için donör akciğerlerinin değerlendirilmesinde özellikle önemlidir. Bu protokol, türünün ilk örneğidir ve ex vivo bir fare modeli kullanarak solunum mekaniğini değerlendirmek için kapsamlı ve tekrarlanabilir aşamalı bir yöntem sunar. Seçilen hayvan modeli, akciğer geri kazanımı, depolama ve koruma ve zorlanmış salınım tekniği tabanlı bir sistem kullanılarak yapılan deneylerle ilgili ayrıntıları içerir. Ek olarak, bir ex vivo modelin incelenmesinde veri analizini, klinik önemi ve zorlanmış salınım tekniğinin uygulamalarını ana hatlarıyla belirtir.

Giriş

Akciğer nakli, son dönem akciğer hastalıkları için tek kalıcı tedaviyi temsil eder. Dünya çapında her yıl yaklaşık 4.600 kişiye akciğer nakli yapılmaktadır, ancak uygun donör akciğerlerinin yetersizliği nedeniyle bekleme listesinde yaklaşık 600 hasta ölmektedir ^1,2. Mevcut akciğer havuzunu artırma çabalarında, donör tahsis sistemleri sürekli olarak ayarlanmaktadır, bu da cerrahların donör organlarını güvence altına almak için daha uzak mesafelere seyahat etmesine yol açmıştır³. Artan mesafeler her zaman soğuk iskemik zamanı arttırır ve ek organ koruma yöntemlerine ihtiyaç duyulur.

Akciğer naklinin donör organ koruması için mevcut standart, 4 ° C'de soğuk statik korumadır ve koruma süresini 6-8 saat ile sınırlar - transplantasyon için küçük bir canlılık penceresi⁴. Bununla birlikte, daha uzun seyahat mesafeleri ve buna bağlı olarak artan iskemik sürelerle, transplantasyon öncesi akciğer fonksiyonunun değerlendirilmesi kritik derecede önemlidir⁴. Akciğer nakli için gelişen politikalarla birlikte, bu ihtiyacı karşılamak için yeni araştırmalar yapılmıştır. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, 10 °C'de soğuk statik korumanın, akciğer fonksiyonunda iyileşme, yaralanmaya direnç ve implante edildiğinde karşılaştırılabilir primer greft disfonksiyonu oranları ile akciğer koruması için daha optimal bir depolama sıcaklığı olduğunu göstermiştir ^4,5,6,7,8. Ayrıca, ex vivo akciğer perfüzyonu (EVLP) üzerine odaklanan araştırmalar, donör akciğer kullanımında ve alıcılara zarar vermeden transplantasyonlarda önemli bir iyileşme göstermiştir⁹. Akciğer nakli için donör havuzunu genişletmek ve koruma süresini uzatmak için EVLP'nin kullanımı iyi belgelenmiş olsa da, bu teknoloji pahalıdır, zaman alıcıdır ve gerçekleştirmek için özel eğitim gerektirir¹⁰. Bu nedenle, ex vivo akciğer fonksiyonunu incelemek için kapsamlı, ucuz ve tekrarlanabilir ek yöntemlere ihtiyaç vardır.

Pulmoner mekaniğin geleneksel ölçümleri, örneğin uyum, direnç, elastikiyet ve basınç-hacim eğrileri, vücut pletismografisi kullanılarak veya tek bölmeli bir model kullanılarak ventilatör teknikleriyle güvenilir bir şekilde belirlenebilir. Hava yolu mekaniğini merkezi ve periferik bölmelere ayırabilen sabit faz modeline uyacak şekilde zorlanmış salınım modeli kullanılarak daha ayrıntılı mekanikler elde edilebilir (Newton direnci, doku sönümlemesi/elastikiyeti)^11. Bu tekniklerin uygulanması tekrarlanabilir ve kapsamlı olsa da, şimdiye kadar bir sınırlama, muhtemelen kan kaybetmiş akciğerin alveolar giriş halkasındaki yapıyı kaybetmesi gibi, bu tür ölçümlerin in in vivo bir modelde gerçekleştirilmesi gerekliliği olmuştur¹². Bu çalışmada, akciğer nakli uygulamaları için akciğer mekaniğini daha iyi karakterize etmek için ex vivo bir model geliştirmek amacıyla, ticari olarak temin edilebilen zorunlu salınım tekniğine dayalı küçük bir kemirgen ventilatörü kullanılmıştır.

Protokol

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'ne uygun olarak Hayvan Araştırmaları Komitesi tarafından onaylanmıştır. Yaşları 6-8 hafta arasında ve ağırlıkları 18-28 g arasında olan C57Bl / 6 vahşi tip fareler kullanıldı. Reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. Hazırlık

1. Tüm cerrahi prosedürler için 20x'e kadar büyütme oranına sahip bir ameliyat mikroskobu kullanın.
2. İşleme başlamadan önce tüm cerrahi aletleri temizleyin ve sterilize edin. Aseptik koşulları korumak için aletleri otoklavlayın veya uygun bir sterilizasyon solüsyonu kullanın.

2. Donör akciğerlerinin çıkarılması

1. Tüm işlemleri steril koşullar altında gerçekleştirin.
   NOT: Bu adım, özel bir cerrahi alanda ve steril koşullar altında gerçekleştirilir.
2. Fareyi anestezik bir indüksiyon odasına yerleştirin ve oksijende% 5 izofluran ile anesteziyi indükleyin ve prosedür boyunca oksijende% 3.5 izofluran ile anesteziyi koruyun (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek).
3. İlk kesiden önce fare ağırlığını kaydedin.
4. Fareyi ameliyat masasına sabitleyin ve ayak parmağına baskı uygulayarak uygun anestezi derinliğini sağlayın. Fare acı içinde geri çekilirse, anesteziyi gerektiği gibi artırın.
5. Standart prosedür^13'ü izleyerek akciğerleri donörden çıkarın.
   NOT: Akciğerler ve kalp, akciğerleri ex vivo perfüze etmek için en blok olarak çıkarıldı ve daha sonra entübasyon için trakeanın bir kısmı çıkarıldı.

3. Akciğer depolama ve koruma

1. Akciğerler donörden çıkarıldıktan sonra, kateteri dikkatlice ilerleterek trakeayı 18 G intravenöz anjiyo-kateter ile entübe edin ve trakeayı delmediğinden emin olun.
2. 3-0 ipek sütür kullanarak trakeayı kanül üzerine sabitleyin ve sıkı bir sızdırmazlık sağlayın. 18 G intravenöz anjiyo-kateteri, pulmoner kapağın hemen yanından sağ ventrikül çıkış yolu (RVOT) içine gelene kadar ilerletin.
3. Akciğerlerin vücuttan çıkarıldığı zamanı kaydedin.
4. Akciğerleri, ticari olarak temin edilebilen koruma solüsyonunu içeren 50 mL'lik konik bir tüpte gece boyunca 4 ° C veya 10 ° C'de saklayın.

4. Kurulum ve kalibrasyon

1. Sistemi ve/veya yazılımı açarak başlayın.
2. Programı başlatın, Yeni bir çalışma oluştur düğmesine tıklayın ve protokolü tanımlamak ve konuları atamak için ekrandaki talimatları izleyin.
3. Deneme Oturumu'na tıklayın ve kullanıcının adının ve soyadının baş harflerini kullanarak oturum açın.
4. Konuları tutarlı bir adlandırma kuralına göre etiketlemeye başlayın.
5. Her konunun cinsiyet, doğum tarihi ve kilo bilgilerini girin.
6. Nesneleri seçin ve ölçüm alanına atayın ve ağırlıkları onaylayın.
7. Ekrandaki talimatları izleyerek yazılımın kurulumuna ve kalibrasyonuna devam edin.
   NOT: Borunun kalibrasyonu sırasında, donör akciğerlerinin entübasyonunda kullanılan aynı tip kanül, tutarlılığı sağlamak için sistemin Y-tüpüne bağlanmıştır.
8. Kalibrasyon değerleri kabul edilen aralıkların dışına çıkarsa kalibrasyonu tekrarlayın.
9. Hazır olana kadar havalandırmaya başlamak için istemleri iptal edin. Ventilasyon ve veri kaydı ile ilgili deney oturumları daha sonra başlatılabilir.

5. Akciğer ventilasyonu ve veri toplama

1. Akciğerleri 50 mL konik tüpten çıkarın. Akciğer kılcal damarlarını yıkamak için daha önce yerleştirilmiş 18 G intravenöz anjiyo-kateteri kullanarak 60 mL / kg'lık bir dozda ek koruma solüsyonu kullanarak sağ ventrikül çıkış yolunu (RVOT) yıkayın.
   NOT: Donör akciğerlerinin dehidrasyonunu önlemek için büyük özen gösterilmelidir, çünkü bu, akciğer mekaniğinin incelenmesinde bilinen bir karışıklıktır.
2. Donör akciğerlerini ventilatör makinesine sabitleyin ve deneye başlayın.
3. Havalandırmayı Başlat'a tıklayın ve hazır olduğunuzda deneysel oturumu başlatmak için Kaydı Başlat'a basın.
   NOT: Bu çalışma için kullanılan ventilatör, solunum hızı 150 nefes/dk, tidal hacim 10 mL/kg ve PEEP 3 olacak şekilde ayarlanmıştır.
4. Sayfanın sağ tarafındaki görev listesinden akciğer mekaniği değerlendirmeleri görevine çift tıklayarak her görevi çalıştırın.
5. Atelektik bölgelerin işe alındığından ve akciğer hacimlerinin standartlaştırıldığından daha fazla emin olmak için görev listesinde bulunan Derin Enflasyon görevini çalıştırın. Ayrıntılar için Sonuçlar bölümüne bakın.
6. Görev dizisine devam edin.
   NOT: Akciğer fonksiyonu, mekanik özellikleri değerlendiren birden fazla görevle değerlendirilebilir. Derin Şişirme akciğer hacmini standartlaştırırken, Prime-8 akciğer mekaniğini stabilize eder. PV-P ve PV-V , statik ve dinamik uyumu, hava yolu direncini ve iletkenliği ölçer. Snapshot 150 , direnç, uyumluluk ve elastikiyetin hızlı bir değerlendirmesini sağlarken, QuickPrime , akciğer viskoelastisitesi ile birlikte hava yolu ve doku direncini değerlendirir. Bu görevler toplu olarak akciğer fonksiyonunun kapsamlı bir analizini sağlar. Bu makalede, Deep Inflation, Snapshot 150 ve QuickPrime'da (ticari olarak mevcut ekipman kullanılarak) gerçekleştirilen görevlerin verileri temsili sonuçlar olarak verilmiştir. Verileri yorumlarken kafa karıştırıcı değişkenleri en aza indirmek için Derin Enflasyon görevi kullanılarak bozulmalar arasında akciğer hacimleri standartlaştırıldı.
7. Seçilen görev dizisini üç nüsha halinde çalıştırın.
8. Kaydı Durdur'a ve ardından Havalandırmayı Durdur'a tıklayın.
9. Verileri tek tek dışa aktarın veya bir sonraki konuya geçin ve 5.1-5.9 arasındaki adımları tekrarlayın.
   NOT: Snapshot 150 ve QuickPrime bozulmalarından elde edilen veriler için, güvenilir analiz için >0.95'lik bir COD gereklidir.

Sonuçlar

Fare modeli için deneysel tasarımın grafiksel bir tasviri sağlanmıştır (Şekil 1). Akciğerler, çeşitli koşullar altında donör dokunun solunum mekaniğini değerlendirmek için ticari olarak temin edilebilen bir zorlanmış salınım tekniği tabanlı küçük kemirgen ventilatör sistemi kullanılarak şişirildi (Şekil 2). Korunmuş donör akciğer grupları arasındaki sonuçlar karşılaştırıldığında, 10 ?...

Tartışmalar

Önemi ve potansiyel uygulamaları
Solunum mekaniği, akciğer patolojisini ve akciğer hasarını incelemek için çeşitli uygulamalarda rutin olarak kullanılmaktadır. Solunum mekaniği çalışması, ARDS gibi hastalıkların ilerlemesi ve yardımlı ventilasyon vakaları için birçok kez tanımlanmıştır, ancak organ nakli ile ilgili olduğu için literatürde çok daha az tanımlanmıştır 15,16,17,18,19.^...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G angio-catheter	B. Braun	4251687-02	Straight hub
24 G angio-catheter	B. Braun	4251601-02	Straight hub
3 mL syringe	Fisher Scientific	14-823-41
3-0 silk suture	Medex	ETH-A304H
50 mL conical tubes	Thermo Fisher	339652
70% EtOH	Fisher Scientific	BP82031GAL
Anesthesia induction chamber	Harvard Apparatus	75-2030	Air-tight induction chamber for rats
Anesthesia machine	Harvard Apparatus	75-0238	Mobile anesthesia system with passive scavenging
Anesthesia mask	Harvard Apparatus	59-8255	Rat anesthesia mask
Blunt micro forceps	World Precision Instruments	501217	Dressing forceps, 12.5 cm, straight, serrated
C57Bl/6 mice	Charles River	Strain Code 027	Wild type, 6-8 weeks, 18-28g
Digital weight scale	Fisher Scientific	S72422
FlexiVent system	Scireq	NC2926059	forced oscillation technique-based small rodent ventilator
Insulin syringe, 1 mL	Fisher Scientific	14-841-33
Isoflurane, USP	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Operating microscope or surgical loupes	AmScope	SM-3BZ-80S	3.5x - 90x Stereo Microscope
Perfadex solution	Xvivo	19811, 19850
Petri dishes	Fisher Scientific	FB0875714
Sterile cotton swabs	Puritan	25-806 1WC
Sterile gauze sponges	Fisher Scientific	22-037-902
Surgical scissors	World Precision Instruments	1962C	Metzenbaum scissors