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요약

본 프로토콜은 강제 진동 기술(FOT)을 사용하여 생체 외 쥐 모델의 호흡 역학을 분석하기 위한 단계적 방법을 설명합니다.

초록

호흡 역학은 기능적 폐활량을 평가하여 폐 병리학을 정의하고 치료하는 데 있어 연구의 핵심 영역입니다. 폐 역학은 다양한 진동 파형을 포함하는 다양한 폐 운동을 통해 평가할 수 있습니다. 폐에 적용하면 이러한 조작은 파형에 대한 반응을 기반으로 압력, 부피 및 유량과 같은 여러 변수를 측정합니다. 그런 다음 이러한 신호를 계산 및 분석하여 히스테리시베이티, 저항, 순응도, 조직 감쇠 및 조직 탄성도와 같은 매개변수를 결정하고 전반적인 폐 기능에 대한 자세한 평가를 제공합니다. 호흡 역학 분석은 폐 이식을 위한 기증자 폐를 평가하는 데 특히 중요합니다. 현재 프로토콜은 생체 쥐 모델을 사용하여 호흡 역학을 평가하기 위한 포괄적이고 재현 가능한 단계적 방법을 제공하는 최초의 프로토콜입니다. 여기에는 선택한 동물 모델, 폐 회복, 보관 및 보존, 강제 진동 기술 기반 시스템을 사용한 실험에 대한 세부 정보가 포함됩니다. 또한 데이터 분석, 임상적 중요성 및 생체 외 모델 연구에서 강제 진동 기술의 적용을 간략하게 설명합니다.

서문

폐 이식은 말기 폐 질환에 대한 유일하고 지속적인 치료법입니다. 전 세계적으로 매년 약 4,600명이 폐 이식 수술을 받지만, 약 600명의 환자가 대기자 명단에서 사망하고 있으며, 이는 적절한 기증자 폐의 부족으로 인한 것입니다 1,2. 사용 가능한 폐 풀을 늘리기 위한 노력의 일환으로 기증자 할당 시스템이 지속적으로 조정되고 있으며, 이로 인해 외과의는 기증자 장기를 확보하기 위해 더 먼 거리를 이동하게 되었습니다3. 거리가 멀어짐에 따라 냉허혈 시간이 항상 증가하여 추가적인 장기 보존 방법이 필요하게 되었습니다.

폐 이식 시 기증자 장기 보존에 대한 현재 표준은 4°C에서 저온 정적 보존이며, 보존 시간을 6-8시간으로 제한하여 이식을 위한 생존 가능성이 작은 창입니다4. 그러나 이동 거리가 길어지고 허혈 시간이 늘어남에 따라 이식 전 폐 기능을 평가하는 것이 매우 중요하다4. 폐 이식에 대한 정책이 발전함에 따라 이러한 요구를 해결하기 위한 새로운 연구가 수행되었습니다. 최근 연구에 따르면 10°C에서 냉간 정전기 보존이 폐 보존을 위한 최적의 보관 온도이며 결과적으로 폐 기능이 개선되고 손상에 대한 저항력이 있으며 이식 시 1차 이식 기능 장애의 비율이 비슷하다고 합니다 4,5,6,7,8. 또한, 체외폐관류(ex vivo lung perfusion, EVLP)를 중심으로 한 연구에서는 수혜자에게 해를 끼치지 않으면서 기증자의 폐 이용과 이식이 크게 개선되는 것으로 나타났다9. 폐 이식을 위한 기증자 풀을 확대하고 보존 기간을 연장하기 위해 EVLP를 사용하는 것은 잘 문서화되어 있지만, 이 기술은 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되며10가지 작업을 수행하기 위해 전문 교육이 필요합니다. 따라서 체외 폐 기능을 연구하기 위해 포괄적이고 저렴하며 재현 가능한 추가 방법이 필요합니다.

컴플라이언스, 저항, 탄성 및 압력-부피 곡선과 같은 폐 역학의 전통적인 측정은 신체 혈량측정법을 사용하거나 단일 구획 모델을 사용하는 인공호흡기 기술을 사용하여 안정적으로 결정할 수 있습니다. 기도 역학을 중앙 및 주변 구획(뉴턴 저항, 조직 감쇠/탄성, 히스테리시비티)으로 나눌 수 있는 상수 위상 모델에 맞게 강제 진동 모델을 사용하여 보다 자세한 역학을 얻을 수 있습니다11. 이러한 기술의 적용은 재현 가능하고 포괄적이지만, 지금까지의 한계는 아마도 폐포 입구 고리(12)에서 출혈된 폐가 구조를 잃기 때문에 생체 내 모델에서 이러한 측정을 수행해야 한다는 요구 사항이었습니다. 이 연구는 폐 이식 응용 분야를 위한 폐 역학을 더 잘 특성화하기 위해 생체 외 모델을 개발하기 위해 상업적으로 이용 가능한 강제 진동 기술 기반 소형 설치류 인공호흡기를 사용했습니다.

프로토콜

이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 실험실 동물 관리 및 사용 가이드(National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 동물 연구 위원회(Committee on Animal Research)의 승인을 받았습니다. 생후 6-8주, 체중 18-28g의 C57Bl/6 야생형 마우스를 사용했습니다. 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나와 있습니다.

1. 준비

  1. 모든 수술 절차에 대해 최대 20배 배율의 작동 현미경을 사용하십시오.
  2. 절차를 시작하기 전에 모든 수술 기구를 세척하고 소독하십시오. 오토클레이브 기구를 사용하거나 적절한 살균 용액을 사용하여 무균 상태를 유지하십시오.

2. 기증자 폐 적출

  1. 멸균 상태에서 모든 작업을 수행하십시오.
    참고: 이 단계는 전용 수술 공간에서 멸균 상태로 수행됩니다.
  2. 마우스를 마취 유도실에 넣고 산소 중 5% 이소플루란으로 마취를 유도하고 절차 내내 산소 중 3.5% 이소플루란으로 마취를 유지합니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름).
  3. 첫 번째 절개 전에 마우스 체중을 기록합니다.
  4. 수술대에 마우스를 고정하고 발가락에 압력을 가하여 적절한 마취 깊이를 보장합니다. 마우스가 통증으로 물러나면 필요에 따라 마취를 높이십시오.
  5. 표준 절차에 따라 기증자로부터 폐를 제거합니다13.
    참고: 폐와 심장을 블록으로 추출하여 생체 외 폐를 관류하고 나중에 삽관하기 위해 기관의 일부를 제거했습니다.

3. 폐 저장 및 보존

  1. 기증자로부터 폐가 제거되면 카테터를 조심스럽게 전진시켜 18G 정맥 혈관 카테터로 기관을 삽관하여 기관에 구멍을 뚫지 않도록 합니다.
  2. 3-0 실크 봉합사를 사용하여 캐뉼라 위에 기관을 고정하여 단단히 밀봉합니다. 18G 혈관 카테터를 폐동맥 판막 바로 지나서 우심실 유출로(RVOT) 내에 있을 때까지 전진시킵니다.
  3. 폐가 몸에서 제거된 시간을 기록하십시오.
  4. 시중에서 판매되는 보존 용액이 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브에 폐를 4°C 또는 10°C에서 하룻밤 동안 보관합니다.

4. 설정 및 교정

  1. 시스템 및/또는 소프트웨어의 전원을 켜는 것으로 시작합니다.
  2. 프로그램을 시작하고, 새 연구 만들기 버튼을 클릭하고, 화면의 지시에 따라 프로토콜을 정의하고 주제를 할당합니다.
  3. 실험 세션을 클릭하고 사용자의 첫 번째 이니셜과 마지막 이니셜을 사용하여 로그인합니다.
  4. 일관된 명명 규칙에 따라 제목에 레이블을 지정하기 시작합니다.
  5. 각 과목의 성별, 생년월일, 체중 정보를 입력합니다.
  6. 측정 부위에 피험자를 선택하여 할당하고 체중을 확인합니다.
  7. 화면의 지시에 따라 소프트웨어의 설정 및 보정을 계속합니다.
    참고: 튜브를 보정하는 동안 기증자 폐 삽관에 사용된 것과 동일한 유형의 캐뉼라가 일관성을 보장하기 위해 시스템의 Y-튜브에 부착되었습니다.
  8. 교정 값이 허용 범위를 벗어나는 경우 교정을 반복합니다.
  9. 준비가 될 때까지 환기를 시작하라는 프롬프트를 취소합니다. 인공호흡 및 데이터 기록이 포함된 실험 세션은 나중에 시작할 수 있습니다.

5. 폐 환기 및 데이터 수집

  1. 50mL 원뿔형 튜브에서 폐를 제거합니다. 이전에 배치된 18G 정맥 혈관 카테터와 추가 보존 용액을 60mL/kg의 용량으로 사용하여 우심실 유출로(RVOT)를 세척하여 폐 모세혈관을 세척합니다.
    참고: 기증자 폐의 탈수는 폐 역학을 연구하는 데 알려진 교란 요인이므로 기증자 폐의 탈수를 피하기 위해 세심한 주의를 기울여야 합니다.
  2. 기증자의 폐를 인공호흡기에 고정하고 실험을 시작합니다.
  3. Start Ventilation을 클릭하고 준비가 되면 Start Recording을 눌러 실험 세션을 시작합니다.
    참고: 이 연구에 사용된 인공호흡기는 호흡수가 150회/분, 일회량은 10mL/kg, PEEP는 3으로 설정되었습니다.
  4. 페이지 오른쪽의 작업 목록에서 폐 역학 평가를 위한 작업을 두 번 클릭하여 각 작업을 실행합니다.
  5. 작업 목록에 있는 Deep Inflation 작업을 실행하여 무기폐 영역이 모집되고 폐 용적이 표준화되었는지 추가로 확인합니다. 자세한 내용은 결과 섹션을 참조하십시오.
  6. 작업 순서를 진행합니다.
    참고: 폐 기능은 기계적 특성을 평가하는 여러 작업을 통해 평가할 수 있습니다. 딥 인플레이션(Deep Inflation )은 폐 용적을 표준화하고, 프라임-8(Prime-8 )은 폐 역학을 안정화합니다. PV-P PV-V 는 정적 및 동적 컴플라이언스, 기도 저항 및 전도도를 측정합니다. Snapshot 150 은 저항, 순응도 및 탄성도를 신속하게 평가하는 반면, QuickPrime 은 폐 점탄성과 함께 기도 및 조직 저항을 평가합니다. 이러한 작업은 총체적으로 폐 기능에 대한 포괄적인 분석을 보장합니다. 이 기사에서는 Deep Inflation, Snapshot 150 및 QuickPrime(시판되는 장비 사용)에서 수행된 작업에 대한 데이터를 대표 결과로 제공합니다. 폐 용적은 데이터를 해석할 때 혼란스러운 변수를 최소화하기 위해 Deep Inflation 작업을 사용하여 섭동 사이의 균형을 표준화했습니다.
  7. 선택한 작업 순서를 세 번 실행합니다.
  8. Stop Recording(기록 중지)을 클릭한 다음 Stop Ventilation(환기 중지)을 클릭합니다.
  9. 데이터를 개별적으로 내보내거나 다음 주제로 계속 진행하고 5.1-5.9단계를 반복합니다.
    참고: Snapshot 150 및 QuickPrime 섭동에서 파생된 데이터의 경우 신뢰할 수 있는 분석을 위해 >0.95의 COD가 필요합니다.

결과

실험 설계에 대한 그래픽 묘사는 마우스 모델에 제공됩니다(그림 1). 다양한 조건에서 기증자 조직의 호흡 역학을 평가하기 위해 상업적으로 이용 가능한 강제 진동 기술 기반의 소형 설치류 인공호흡기 시스템을 사용하여 폐를 팽창시켰습니다(그림 2). 보존된 기증자 폐 그룹 간의 결과를 비교할 때, 10°C에서 보관된 기증자 폐...

토론

중요성 및 잠재적 응용 분야
호흡 역학은 폐 병리학 및 폐 손상을 연구하기 위해 다양한 응용 분야에서 일상적으로 사용됩니다. 호흡 역학에 대한 연구는 ARDS와 같은 질병의 진행과 보조 환기의 경우에 대해 여러 번 설명되었지만 장기 이식과 관련된 문헌에는 훨씬 적게 설명되어 있습니다 15,16,17,18,19.

공개

저자는 이 연구가 이해 상충으로 잘못 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계 없이 수행되었다고 선언합니다.

감사의 말

저자는 인공호흡기 시스템을 사용해 준 Sophie Paczensy와 도움을 준 Colin Welsh에게 감사의 뜻을 전합니다. 그림 1 은 biorender.com 를 사용하여 만든 것입니다. 이 연구는 사우스캐롤라이나 임상 및 중개 연구소(NIH/National Center for Advancing Translational Sciences)의 보조금(수상 번호 UL1-TR001450)의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
18 G angio-catheterB. Braun4251687-02Straight hub
24 G angio-catheterB. Braun4251601-02Straight hub
3 mL syringeFisher Scientific14-823-41
3-0 silk sutureMedexETH-A304H
50 mL conical tubesThermo Fisher339652
70% EtOHFisher ScientificBP82031GAL
Anesthesia induction chamberHarvard Apparatus75-2030Air-tight induction chamber for rats
Anesthesia machineHarvard Apparatus75-0238Mobile anesthesia system with passive scavenging
Anesthesia maskHarvard Apparatus59-8255Rat anesthesia mask
Blunt micro forcepsWorld Precision Instruments501217Dressing forceps, 12.5 cm, straight, serrated
C57Bl/6 miceCharles RiverStrain Code 027 Wild type, 6-8 weeks, 18-28g
Digital weight scaleFisher ScientificS72422
FlexiVent systemScireqNC2926059forced oscillation technique-based small rodent ventilator 
Insulin syringe, 1 mLFisher Scientific14-841-33
Isoflurane, USPPiramal Critical CareNDC 66794-017-25
Operating microscope or surgical loupesAmScopeSM-3BZ-80S3.5x - 90x Stereo Microscope
Perfadex solutionXvivo19811, 19850
Petri dishesFisher ScientificFB0875714
Sterile cotton swabsPuritan25-806 1WC
Sterile gauze spongesFisher Scientific22-037-902
Surgical scissorsWorld Precision Instruments1962CMetzenbaum scissors

참고문헌

  1. Erdman, J., et al. Lung transplant outcomes in adults in the United States: Retrospective cohort study using real-world evidence from the SRTR. Transplantation. 106 (6), 1233-1242 (2022).
  2. . OPTN/SRTR 2022 Annual Data Report: Lung Available from: https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2022/Lung.aspx (2022)
  3. Benvenuto, L., Arcasoy, S. The new allocation era and policy. J Thorac Dis. 13 (11), 6504-6513 (2021).
  4. Ali, A., et al. Static lung storage at 10 °C maintains mitochondrial health and preserves donor organ function. Sci Transl Med. 13 (611), eabf7601 (2021).
  5. Wang, L., et al. The effect of ischemic time and temperature on lung preservation in a simple ex vivo rabbit model used for functional assessment. J Thorac Cardiovasc Surg. 98 (3), 333-342 (1989).
  6. Date, H., et al. In a canine model, lung preservation at 10 °C is superior to that at 4 °C: A comparison of two preservation temperatures on lung function and on adenosine triphosphate level measured by phosphorus 31-nuclear magnetic resonance. J Thorac Cardiovasc Surg. 103 (4), 773-780 (1992).
  7. Hoetzenecker, K., et al. The advent of semi-elective lung transplantation-prolonged static cold storage at 10 °C. Transpl Int. 37 (1), 12310 (2024).
  8. Abdelnour-Berchtold, E., et al. Evaluation of 10 °C as the optimal storage temperature for aspiration-injured donor lungs in a large animal transplant model. J Heart Lung Transplant. 41 (12), 1679-1688 (2022).
  9. Moreno Garijo, J., Roscoe, A. Ex vivo lung perfusion. Curr Opin Anaesthesiol. 33 (1), 50-54 (2020).
  10. Rajab, T., Keshavjee, S. Ex vivo lung perfusion. Artif Organs. 44 (1), 12-15 (2020).
  11. Oostveen, E., et al. The forced oscillation technique in clinical practice: Methodology, recommendations, and future developments. Eur Respir J. 22 (6), 1026-1041 (2003).
  12. Gibney, B., et al. Structural and functional evidence for the scaffolding effect of alveolar blood vessels. Exp Lung Res. 43 (9-10), 337-346 (2017).
  13. Rajab, T. Techniques for lung transplantation in the rat. Exp Lung Res. 45 (9-10), 267-274 (2019).
  14. Hill, M., et al. Evaluation of ventilation at 10 °C as the optimal storage condition for donor lungs in a murine transplant model. , (2024).
  15. Hess, D. Respiratory mechanics in mechanically ventilated patients. Respir Care. 59 (11), 1773-1794 (2014).
  16. Henderson, W., et al. Fifty years of research in ARDS: Respiratory mechanics in acute respiratory distress syndrome. Am J Respir Crit Care Med. 196 (7), 822-833 (2017).
  17. Mauri, T., et al. Respiratory mechanics to understand ARDS and guide mechanical ventilation. Physiol Meas. 38 (12), R280-R303 (2017).
  18. Bersten, A., et al. Respiratory mechanics and surfactant in the acute respiratory distress syndrome. Clin Exp Pharmacol Physiol. 25 (11), 955-963 (1998).
  19. Grinnan, D., Truwit, J. Clinical review: Respiratory mechanics in spontaneous and assisted ventilation. Crit Care. 9 (5), 472-484 (2005).

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