Valutazione della funzione polmonare in un modello murino ex vivo

Riepilogo

Il presente protocollo descrive un metodo graduale per analizzare la meccanica respiratoria di un modello murino ex vivo utilizzando la tecnica dell'oscillazione forzata (FOT).

Abstract

La meccanica respiratoria è un'area di studio chiave nella definizione e nel trattamento delle patologie polmonari attraverso la valutazione della capacità polmonare funzionale. La meccanica polmonare può essere valutata attraverso varie manovre polmonari che coinvolgono diverse forme d'onda oscillatorie. Quando applicate ai polmoni, queste manovre misurano più variabili, come la pressione, il volume e il flusso, in base alla risposta alle forme d'onda. Questi segnali vengono quindi calcolati e analizzati per determinare parametri come l'isterisività, la resistenza, la compliance, lo smorzamento dei tessuti e l'elastanza tissutale, fornendo una valutazione dettagliata della funzione polmonare complessiva. L'analisi della meccanica respiratoria è particolarmente importante nella valutazione dei polmoni del donatore per il trapianto di polmone. Il presente protocollo è il primo del suo genere e offre un metodo graduale completo e riproducibile per la valutazione della meccanica respiratoria utilizzando un modello murino ex vivo . Include dettagli sul modello animale selezionato, il recupero polmonare, lo stoccaggio e la conservazione e la sperimentazione utilizzando un sistema basato su una tecnica di oscillazione forzata. Inoltre, delinea l'analisi dei dati, il significato clinico e le applicazioni della tecnica dell'oscillazione forzata nello studio di un modello ex vivo .

Introduzione

Il trapianto di polmone rappresenta l'unico trattamento duraturo per le malattie polmonari allo stadio terminale. Circa 4.600 persone ricevono trapianti di polmone ogni anno in tutto il mondo, ma quasi 600 pazienti muoiono in lista d'attesa a causa della carenza di polmoni da donatore idonei ^1,2. Nel tentativo di aumentare il pool di polmoni disponibili, i sistemi di assegnazione dei donatori vengono continuamente regolati, il che ha portato i chirurghi a percorrere distanze maggiori per assicurarsi gli organi dei donatori³. L'aumento delle distanze aumenta invariabilmente il tempo ischemico freddo, presentando la necessità di ulteriori metodi di conservazione degli organi.

L'attuale standard per la conservazione degli organi da donatore del trapianto di polmone è la conservazione statica a freddo a 4 °C, limitando il tempo di conservazione a 6-8 ore, una piccola finestra di vitalità per il trapianto⁴. Tuttavia, con distanze di viaggio più lunghe e conseguente aumento dei tempi ischemici, la valutazione della funzione polmonare prima del trapianto è di fondamentale importanza⁴. Con l'evoluzione delle politiche per il trapianto di polmone, sono state condotte nuove ricerche per rispondere a questa esigenza. Recentemente, gli studi hanno suggerito che la conservazione statica a freddo a 10 °C è una temperatura di conservazione più ottimale per la conservazione dei polmoni con conseguente miglioramento della funzione polmonare, della resistenza alle lesioni e dei tassi comparabili di disfunzione primaria del trapianto quando impiantato 4,5,6,7,8. Inoltre, la ricerca incentrata sulla perfusione polmonare ex vivo (EVLP) ha mostrato un miglioramento significativo nell'utilizzo del polmone da donatore e nei trapianti senza danni per i riceventi⁹. Sebbene l'uso dell'EVLP per espandere il pool di donatori per il trapianto di polmone e prolungare il tempo di conservazione sia ben documentato, questa tecnologia è costosa, richiede molto tempo e richiede una formazione specializzata per eseguirne¹⁰. Pertanto, sono necessari metodi aggiuntivi per studiare la funzione polmonare ex vivo che siano completi, economici e riproducibili.

Le misure tradizionali della meccanica polmonare, ad esempio la compliance, la resistenza, l'elastanza e le curve pressione-volume, possono essere determinate in modo affidabile utilizzando la pletismografia corporea o con tecniche di ventilazione utilizzando un modello a compartimento singolo. Una meccanica più dettagliata può essere ottenuta utilizzando il modello di oscillazione forzata per adattarsi al modello a fase costante, che può suddividere la meccanica delle vie aeree in compartimenti centrali e periferici (resistenza newtoniana, smorzamento tissutale/elastance, isteresività)^11. Sebbene l'applicazione di queste tecniche sia riproducibile e completa, finora una limitazione è stata la necessità di eseguire tali misure in un modello in vivo, presumibilmente poiché il polmone dissanguato perde struttura all'anello di ingresso alveolare¹². Questo studio ha utilizzato un piccolo ventilatore per roditori basato su una tecnica di oscillazione forzata disponibile in commercio con l'obiettivo di sviluppare un modello ex vivo per caratterizzare meglio la meccanica polmonare per applicazioni di trapianto di polmone.

Protocollo

Questo studio è stato approvato dal Comitato per la ricerca sugli animali in conformità con la Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Sono stati utilizzati topi wild-type C57Bl/6, di età compresa tra 6 e 8 settimane e di peso compreso tra 18 e 28 g. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature sono forniti nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione

1. Utilizzare un microscopio operatorio con ingrandimento fino a 20x per tutte le procedure chirurgiche.
2. Pulire e sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici prima di iniziare la procedura. Autoclave gli strumenti o utilizzare una soluzione sterilizzante adatta per mantenere le condizioni asettiche.

2. Estrazione dei polmoni del donatore

1. Eseguire tutte le operazioni in condizioni sterili.
   NOTA: Questa fase viene eseguita in uno spazio chirurgico dedicato e in condizioni sterili.
2. Posizionare il topo in una camera di induzione dell'anestesia e indurre l'anestesia con il 5% di isoflurano in ossigeno e mantenere l'anestesia con il 3,5% di isoflurano in ossigeno per tutta la durata della procedura (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati).
3. Registrare il peso del mouse prima della prima incisione.
4. Fissare il mouse sul tavolo operatorio e garantire la corretta profondità dell'anestesia applicando pressione su un dito del piede. Se il topo si ritira per il dolore, aumentare l'anestesia secondo necessità.
5. Rimuovere i polmoni dal donatore seguendo la procedura standard¹³.
   NOTA: I polmoni e il cuore sono stati estratti in blocco per perfondere i polmoni ex vivo, e una parte della trachea è stata rimossa per una successiva intubazione.

3. Stoccaggio e conservazione dei polmoni

1. Una volta rimossi i polmoni dal donatore, intubare la trachea con un angiocatetere endovenoso da 18 G facendo avanzare con cautela il catetere, assicurandosi che non fori la trachea.
2. Fissare la trachea sopra la cannula utilizzando una sutura di seta 3-0, garantendo una tenuta ermetica. Far avanzare l'angiocatetere endovenoso da 18 G fino a quando non si trova all'interno del tratto di efflusso ventricolare destro (RVOT), appena oltre la valvola polmonare.
3. Registra il tempo in cui i polmoni sono stati rimossi dal corpo.
4. Conservare i polmoni in una provetta conica da 50 mL contenente la soluzione di conservazione disponibile in commercio a 4 °C o 10 °C per una notte.

4. Configurazione e calibrazione

1. Iniziare accendendo il sistema e/o il software.
2. Avvia il programma, fai clic sul pulsante Crea un nuovo studio e segui le istruzioni sullo schermo per definire il protocollo e assegnare le materie.
3. Fare clic su Sessione di sperimentazione e accedere utilizzando le iniziali del nome e del cognome dell'utente.
4. Inizia a etichettare gli argomenti in base a una convenzione di denominazione coerente.
5. Inserisci le informazioni sul sesso, la data di nascita e il peso di ciascun soggetto.
6. Selezionare e assegnare i soggetti al sito di misurazione e confermare i pesi.
7. Continuare l'impostazione e la calibrazione del software seguendo le istruzioni sullo schermo.
   NOTA: Durante la calibrazione del tubo, lo stesso tipo di cannula utilizzata nell'intubazione dei polmoni del donatore è stato collegato al tubo a Y del sistema per garantire la coerenza.
8. Ripetere la calibrazione se i valori di calibrazione non rientrano negli intervalli accettati.
9. Annulla le richieste per iniziare la ventilazione fino a quando non è pronto. Le sessioni sperimentali con ventilazione e registrazione dei dati possono essere avviate in un secondo momento.

5. Ventilazione polmonare e acquisizione dati

1. Rimuovere i polmoni dalla provetta conica da 50 mL. Lavare il tratto di efflusso ventricolare destro (RVOT) utilizzando l'angiocatetere endovenoso da 18 G precedentemente posizionato con una soluzione di conservazione aggiuntiva alla dose di 60 ml/kg per lavare i capillari polmonari.
   NOTA: È necessario prestare molta attenzione per evitare la disidratazione dei polmoni del donatore poiché questo è un noto fattore confondente nello studio della meccanica polmonare.
2. Fissare i polmoni del donatore alla macchina del ventilatore e iniziare l'esperimento.
3. Fare clic su Avvia ventilazione e, quando si è pronti, premere Avvia registrazione per iniziare la sessione sperimentale.
   NOTA: Il ventilatore utilizzato per questo studio è stato impostato per avere una frequenza respiratoria di 150 respiri/min, un volume corrente di 10 ml/kg e una PEEP di 3.
4. Esegui ogni attività facendo doppio clic sull'attività per le valutazioni della meccanica polmonare dall'elenco delle attività sul lato destro della pagina.
5. Eseguire l'attività Deep Inflation che si trova nell'elenco delle attività per garantire ulteriormente che le regioni atelettatiche siano state reclutate e che i volumi polmonari siano stati standardizzati. Per i dettagli, vedere la sezione Risultati.
6. Procedi con la sequenza delle attività.
   NOTA: La funzione polmonare può essere valutata attraverso molteplici attività di valutazione delle proprietà meccaniche. Il Deep Inflation standardizza il volume polmonare, mentre il Prime-8 stabilizza la meccanica polmonare. PV-P e PV-V misurano la conformità statica e dinamica, la resistenza delle vie aeree e la conduttanza. Snapshot 150 fornisce una valutazione rapida della resistenza, della compliance e dell'elastance, mentre QuickPrime valuta la resistenza delle vie aeree e dei tessuti insieme alla viscoelasticità polmonare. Questi compiti garantiscono collettivamente un'analisi completa della funzione polmonare. In questo articolo, i dati per le attività eseguite in Deep Inflation, Snapshot 150 e QuickPrime (utilizzando apparecchiature disponibili in commercio) sono forniti come risultati rappresentativi. I volumi polmonari sono stati standardizzati tra le perturbazioni utilizzando il compito Deep Inflation al fine di ridurre al minimo le variabili confondenti durante l'interpretazione dei dati.
7. Esegui la sequenza di attività scelta in triplice copia.
8. Fare clic su Interrompi registrazione e quindi su Interrompi ventilazione.
9. Esportare i dati singolarmente o passare all'argomento successivo e ripetere i passaggi 5.1-5.9.
   NOTA: Per i dati derivati dalle perturbazioni Snapshot 150 e QuickPrime, è necessario un COD di >0,95 per un'analisi affidabile.

Risultati

Per il modello murino viene fornita una rappresentazione grafica del disegno sperimentale (Figura 1). I polmoni sono stati gonfiati utilizzando un sistema di ventilazione per piccoli roditori basato su una tecnica di oscillazione forzata disponibile in commercio per valutare la meccanica respiratoria del tessuto donatore in varie condizioni (Figura 2). Confrontando i risultati tra i gruppi di polmoni di donatore conservati, i gr...

Discussione

Importanza e potenziali applicazioni
La meccanica respiratoria è abitualmente utilizzata in varie applicazioni per studiare la patologia polmonare e le lesioni polmonari. Lo studio della meccanica respiratoria è stato descritto molte volte per la progressione di malattie come l'ARDS e nei casi di ventilazione assistita, ma è stato descritto molto meno in letteratura per quanto riguarda il trapianto di organi 15,16,17,18,19.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G angio-catheter	B. Braun	4251687-02	Straight hub
24 G angio-catheter	B. Braun	4251601-02	Straight hub
3 mL syringe	Fisher Scientific	14-823-41
3-0 silk suture	Medex	ETH-A304H
50 mL conical tubes	Thermo Fisher	339652
70% EtOH	Fisher Scientific	BP82031GAL
Anesthesia induction chamber	Harvard Apparatus	75-2030	Air-tight induction chamber for rats
Anesthesia machine	Harvard Apparatus	75-0238	Mobile anesthesia system with passive scavenging
Anesthesia mask	Harvard Apparatus	59-8255	Rat anesthesia mask
Blunt micro forceps	World Precision Instruments	501217	Dressing forceps, 12.5 cm, straight, serrated
C57Bl/6 mice	Charles River	Strain Code 027	Wild type, 6-8 weeks, 18-28g
Digital weight scale	Fisher Scientific	S72422
FlexiVent system	Scireq	NC2926059	forced oscillation technique-based small rodent ventilator
Insulin syringe, 1 mL	Fisher Scientific	14-841-33
Isoflurane, USP	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Operating microscope or surgical loupes	AmScope	SM-3BZ-80S	3.5x - 90x Stereo Microscope
Perfadex solution	Xvivo	19811, 19850
Petri dishes	Fisher Scientific	FB0875714
Sterile cotton swabs	Puritan	25-806 1WC
Sterile gauze sponges	Fisher Scientific	22-037-902
Surgical scissors	World Precision Instruments	1962C	Metzenbaum scissors