Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים פרוטוקולים משופרים להתמרה רטרו-ויראלית של קולטני סחר וביות תחרותי כדי לחקור מיקום לימפוציטים ספציפיים לאיברים ומיקרו-סביבה בתיווך קולטנים. שיטה זו מציעה תובנות חשובות לגבי מנגנוני סחר בתאי חיסון ויש לה יישומים פוטנציאליים במחקר בסיסי וטיפולי עתידי.

Abstract

הבנת האופן שבו ביטוי קולטן מצומד חלבון G (GPCR) משפיע על מיקום התאים בתוך מיקרו-סביבות רקמה מגוונות חיונית להבהרת מנגנוני סחר בתאי חיסון. אנו מציגים מבחן ביות תחרותי שנועד לחקור לוקליזציה של תאי T בתיווך GPCR לאיברים המבטאים את הליגנדים הכימואטרקנטיים הקוגנטיים שלהם, ישים למחקרים קצרי טווח וארוכי טווח כאחד. הגישה כוללת פרוטוקול משופר להעברת וירוס תאי גזע עכברי רקומביננטי (MSCV) של תאי T כדי לבטא את ה-GPCR המעניין או מבנה בקרה, ואחריו ביות תחרותי בעכברים מקבלים. התפלגות התאים על פני איברים שונים מנותחת באמצעות ציטומטריית זרימה ו/או מיקרוסקופיה קונפוקלית. בניסויים קצרי טווח (10-12 שעות), מיקרוסקופיה קונפוקלית חשפה דפוסי לוקליזציה מובהקים של תאים, כולל לנאדיות, תת-רירית הסמפונות, אתרים ורידיים ואינטרסטיציום בריאה, כמו גם האפיתל המצפה את קנה הנשימה, הקיבה וקרן הרחם. במחקרים ארוכי טווח (1-7 שבועות), ציטומטריית זרימה סיפקה תובנות לגבי הצטברות תאים מועדפת, וחשפה שינויים דינמיים והתבגרות פוטנציאלית או מיקום מחדש בתוך רקמות לאורך זמן. מבחן ביות תחרותי זה הוא כלי חזק לחקר מיקום תאים בתיווך GPCR, ומציע תובנות חשובות לגבי התפלגות ספציפית לרקמה ויישומים פוטנציאליים באימונולוגיה ובמחקר טיפולי.

Introduction

קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) הם בסיסיים בוויסות מגוון תהליכים תאיים, כולל העברת אותות, הולכה עצבית, ויסות הורמונים ונדידת תאי חיסון1. הם ממלאים תפקיד מכריע בבקרה מרחבית-זמנית של נדידת לימפוציטים ולוקליזציה2. במהלך שלב ההתחלה של תגובות חיסוניות, המיקרו-סביבה המקומית והאינטראקציות התאיות מעודדות לימפוציטים מסוג T לבטא קבוצה ייחודית של מולקולות הידבקות וקולטני כימוקין הידועים כקולטני ביות. הסתגלות זו מאפשרת לתאי T המנוסים באנטיגן לעסוק בתאי אנדותל ספציפיים לאיבר (ECs) ולנדוד לרקמות מטרה נפרדות. היכולת של תאי T לרכוש טרופיזם של רקמות חיונית לתגובות זיכרון יעילות, במיוחד בהקשר של זיהומים חוזרים המשפיעים על אותו איבר 3,4.

GPCRs מנחים תאי חיסון לרקמות ואיברים ספציפיים שבהם הם מבצעים פונקציות קריטיות - כגון הפניית תאי CD8+ T ו-NK לאתרי גידול לפעולה ציטוטוקסית או סיוע לתאי CD4+ T בתזמור תגובות חיסוניות על ידי תמיכה בהפעלה של תאים חיסוניים אחרים. הבנת האופן שבו GPCRs מכוונים תאי T למיקומם המדויק חיונית לקידום אימונותרפיה ממוקדת 5,6. האתגר, עם זאת, טמון במידול האינטראקציות המורכבות הללו במבחנה, שכן קשה לשכפל הן רמזים מוגבלים מרחבית והן אותות כימוטקטיים כיווניים בו זמנית.

הבהרת התפקידים של קולטני לויקוציטים ספציפיים היא לעתים קרובות מאתגרת בשל תדירות הביטוי המוגבלת שלהם באוכלוסיות אנדוגניות והעובדה שקולטנים אלה בדרך כלל מקשטים סוגי תאים שונים. מורכבות זו מקשה על בידוד תפקידו של קולטן ספציפי ממנגנונים ספציפיים אחרים לתת-קבוצה של תאים. באופן אידיאלי, שיטות צריכות להשוות אוכלוסיות דומות, שונות רק בקולטן המעניין כדי לספק תובנות ברורות.

כדי להתגבר על אתגרים אלה, אימצנו בדיקת ביות תחרותית המשתמשת בטרנסדוקציה רטרו-ויראלית רקומביננטית של MSCV לביטוי יעיל של GPCR בתאי T. וקטורים רטרו-ויראליים של MSCV, המשלבים אלמנטים מווקטורי MESV מבוססי נגיף הסרקומה המיאלופרוליפרטיבי (PCMV) וקטורי LN מבוססי וירוס לוקמיה עכברי מולוני (MMLV), משלבים אות אריזה היברידי מורחב הנגזר מווקטורי LN7. שינוי זה משפר את יעילות העברת הגנים, ומאפשר מחקרים קצרי טווח וארוכי טווח של לוקליזציה של תאי T in vivo. על ידי שימוש בחלקיקים רטרו-ויראלים בעלי טיטר גבוה ומיקרוסקופיה קונפוקלית, הגישה מאפשרת הדמיה מדויקת של מיקום תאי T ואינטראקציות בתוך סביבות רקמה מורכבות. אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים להתמרה רטרו-ויראלית של קולטני סחר וביצוע מבחני ביות מבוקרים פנימיים (מה שנקרא תחרותי) כדי לחקור מיקום לימפוציטים ספציפיים לאיברים ומיקרו-סביבה בתיווך קולטנים. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לספק תובנות חשובות לגבי מנגנוני סחר בתאי חיסון ולאפשר יישומים עתידיים הן במחקר בסיסי והן בפיתוח טיפולי.

Protocol

כל העכברים במחקר זה הוחזקו במתקנים ספציפיים ללא פתוגנים (SPF) במערכת הבריאות לענייני חיילים משוחררים בפאלו אלטו (VAPAHCS). עכברי B6/SJL Prprc Pep3BoyJ (CD45.1), C57B6/J (CD45.2) ו-Rag1-/- נרכשו ממעבדות ג'קסון. בעוד שהשתמשנו ב-PepBoy כדי להשיג תאי CD45.1, אנו ממליצים להשתמש ב-JAXBoy (C57BL/6J-Ptprcem6Lutzy/J). JAXBoy הוא זן קואיזוגני לחלוטין שנוצר באמצעות CRISPR במקום הכלאה אחורית מסורתית, מה שמשפר את העקביות הגנטית. מבחינה היסטורית, מחקרים מסומנים באלוטיפ CD45 באמצעות עכברי PepBoy (CD45.1), שאינם מולדים לחלוטין, כללו בדיקות ביות בקרה ומחזור עם השוואות מסוג בר (WT/WT) כדי לטפל בשונות פוטנציאלית. עם עכברי JAXBoy הזמינים כעת כחלופה איזוגנית מלאה, ייתכן שלא יהיה עוד צורך בבקרות נוספות אלה. חוקרים עדיין צריכים לקחת בחשבון שהבדלים בין גרסאות CD45.1 ו-CD45.2 - כגון תפקידיהם כחלבון טירוזין פוספטאזות - יכולים להשפיע על התנהגות התאים ודפוסי הביות. כל הפרוטוקולים הנדונים בטקסט ולהלן אושרו או עומדים בהנחיות המחלקה המוסמכת לרפואת חיות מעבדה והפאנל המנהלי לטיפול בחיות מעבדה במערכת הבריאות של VA פאלו אלטו (VAPAHCS). בעלי חיים הוקרבו באמצעות נהלים מאושרים. עכברים משני המינים, בגילאי 8-12 שבועות, נכללו בניסויים.

1. הכנת וקטור MSCV

  1. רכוש וקטור רטרו-ויראלי MSCV-IRES-Thy1.1 עם האזור המקודד של גן העכבר המעניין (GOI) או ORF_Stuffer (בקרת ORF שלילית)
    הערה: מבנה זה כולל את סמן פני השטח Thy1.1 לצד הגן GPCR המעניין. המקשר לאתר כניסת הריבוזום הפנימי (IRES) מאפשר ביטוי משותף של ה-GPCR עם ה-Thy1.1, מה שמקל על זיהוי תאים מותמרים על ידי ציטומטריית זרימה או טיהור ובידוד על ידי חרוזים מגנטיים. זה שימושי במיוחד כאשר נוגדנים ספציפיים ל-GPCR אינם זמינים, כפי שקורה לעתים קרובות עם GPCRs שנחקרו בצורה גרועה.
  2. רכשו את הפלסמיד MSCV בצורה חיידקית ובתרבית על ידי חיסון מרק לוריא-ברטאני (LB) בתוספת בחירת אנטיביוטיקה מתאימה המבוססת על גן העמידות המקודד על ידי הפלסמיד (למשל, אמפיצילין, קנמיצין או כלורמפניקול). מדיום LB מורכב מטריפטון (10 גרם/ליטר), תמצית שמרים (5 גרם/ליטר) ו-NaCl (10 גרם/ליטר), מותאם ל-pH 7.0 ומעוקר על ידי חיטוי. דגרו את התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד (220 סל"ד) למשך הלילה.
  3. הכן מלאי פלסמיד באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיות באמצעות ערכת הכנת DNA.
  4. לאחר בידוד ה-DNA, מדוד את ריכוז ה-DNA עם ספקטרופוטומטר והכן תמיסות פלסמיד עובדות בריכוז של 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר. אחסן פלסמידים ב-20 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.

2. הקמת תרבית קו תאי אריזה

הערה: השתמשנו בתאי פלטינה E (Plat-E) מ-Cell Biolabs. תאי Plat-E הם קו תאים מבוסס 293T עם מקדם EF1α, המספק ביטוי יציב ובעל תפוקה גבוהה של חלבונים מבניים רטרו-ויראליים (גנים gag, pol ו-env), המאפשר אריזה רטרו-ויראלית עם טרנספקציה של פלסמידיחיד 8. למרות שניתן להשתמש בקווי תאים אחרים, כגון NIH-3T3 או 293T, לא בדקנו חלופות אלה.

  1. הכן מדיה תאית Plat-E על ידי הוספת DMEM, 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, בלסטיצידין (10 מיקרוגרם/מ"ל) ופורומיצין (1 מיקרוגרם/מ"ל). השתמש בבלסטיצידין ובפורומיצין לתחזוקת התאים אך השמיט אותם במהלך ואחרי הטרנספקציה.
  2. תאי Plate Plat-E נשלחו קפואים ב-1.0 מ"ל, ב->3 x 106 תאים/מ"ל ב-DMEM, 20% FBS ו-10% DMSO. הפשירו אותם במהירות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. מעבירים את כל התאים המופשרים לצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל מדיום תרבית Plat-E.
  3. צנטריפוגה ב-450 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השעו מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של מדיום Plat-E על ידי פיפטינג עדין ליצירת תרחיף חד-תאי.
  4. מוסיפים 9 מ"ל של מדיום Plat-E לתבנית תרבית של 10 ס"מ, ואז מעבירים את 1 מ"ל התאים התלויים לתבשיל. ודא שהתאים המופשרים ברי קיימא על ידי ערבוב נפח שווה של תרחיף תאים וטריפן כחול וספירת התאים הקיימים (לא מוכתמים) והמתים (מוכתמים בכחול) באמצעות המוציטומטר או מונה תאים, במטרה להשיג >70% כדאיות.
  5. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה עם 5% CO2. אל תשנה את המדיום במשך 3 הימים הראשונים; זה נורמלי לצפות בתאים צפים ומתים עם ההפשרה הראשונה.
  6. כאשר התאים מגיעים למפגש של 85%-90%, יש לשטוף עם DMEM/PBS Ca-/Mg-. נתק תאים באמצעות 2 מ"ל של 0.05% טריפסין/0.5 מ"מ EDTA ודגירה למשך 3 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. הוסף 8 מ"ל של מדיום Plat-E, אסוף תאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל, וצנטריפוגה ב-450 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  7. מחלקים ביחס משטח של 1:10 או 1:5 (כלומר, זרעי צלחות חדשות עם 1/10 או 1/5 מהנפח הכולל מהמנה המקורית). השעו מחדש בנפח סופי של 10 מ"ל של מדיום Plat-E ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה עם 5% CO2.
  8. יש לשים את שאר התאים ב -1 מ"ל של FBS עם 10% DMSO ולהקפיא ב -80 מעלות צלזיוס ולאחר מכן בחנקן נוזלי לשימוש ארוך טווח.
    הערה: יש לטפל בתאים כמתואר לעיל כאשר הם קרובים ל-85% מתלכדים. כדי לשמור על בריאות תאים מיטבית, הימנעו מהתכנסות יתר ושאפו לפיצולים של 3 ימים עם דילול של 1:10. אם הצמיחה מואטת, השתמש במנה טרייה. ביצועי התא בדרך כלל יורדים עם המעברים הבאים. אנו ממליצים להשתמש בתאים לטרנספקציה בין מעברים 4 ו-15 לקבלת התוצאות הטובות ביותר.

3. ייצור תאים מותמרים

  1. יום 1: תאי Seed Plat E
    הערה: חשב את מספר התאים והלוחות של Plat E הנדרשים. השתמשנו ב-1 מ"ל של סופרנטנט ויראלי לבאר בצלחת של 24 בארות כדי להעביר תאים פי 2. בדרך כלל אנו משתמשים בכשתי צלחות פטרי בגודל 10 ס"מ עם תאי Plate-E לכל צלחת של 24 בארות עם תאי T בתרבית.
    1. התחל בציפוי צלחות תרבית רקמה בגודל 10 ס"מ ב-5 מ"ל של 50 מיקרוגרם/מ"ל פולי-D-ליזין במים סטריליים. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות. יש לשטוף פעמיים עם PBS Ca-/Mg סטרילי - כדי להבטיח שלא יישארו שאריות.
      הערה: אנו ממליצים לצפות את הלוחות מכיוון שתאי Plat-E נוטים להתנתק לאחר טרנספקציה, מה שמוביל לביצועי תאים גרועים ולהפחתת ייצור הטיטר הנגיפי.
    2. נתק תאי Plat-E כמתואר לעיל בשלב 2.6 ובצע בדיקת אי הכללה של טריפן כחול כדי להבטיח כדאיות. מערבבים נפח שווה של תרחיף תאים וטריפן כחול. ספרו את התאים הקיימים (הלא מוכתמים) והמתים (המוכתמים בכחול) באמצעות המוציטומטר/מונה תאים. זרע תאים חיים בגודל 3 x 10⁶ בצלחת פטרי של תרבית רקמה בגודל 10 ס"מ עם מדיום Plat-E ללא אנטיביוטיקה.
      הערה: צלחות זרעים צריכות להגיע למפגש של 85%-90% למחרת. אם זה לא הושג, שקול להשתמש בשם תא אחר. התאם את צפיפות הזריעה על סמך עיתוי הציפוי; לציפוי ערב ניתן להשתמש ב 3.5 x 106 תאים.
  2. יום 2: טרנספקציה של תאי Plat-E ולוחות ציפוי לתאי T בנוגדנים נגד CD3 ואנטי-CD28
    1. החלף את המדיום בתרביות תאים Plat-E ב-6.5 מ"ל של מדיה מופחתת בסרום.
    2. הכן את תערובת הטרנספקציה בהתאם להוראות היצרן עבור מגיב הליפופקטמין (ליפופקטמין 2000 שימש במחקר זה).
    3. עבור כל צלחת, מערבבים 45 מיקרוליטר של ליפופקטמין 2000 עם 210 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת בצינור אחד, ו-15 מיקרוגרם של DNA עם 235 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת בצינור אחר. שלב את תכולת הצינורות על ידי פיפטינג 3x-4x.
    4. דגרו את התערובת למשך 5-20 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר היווצרות קומפלקסים של ליפופקטמין/DNA, ולאחר מכן הוסיפו טיפה לצלחות. דגרו את הצלחות למשך 16 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    5. בארות הפעלת תאי T: מצפים 24 צלחות באר עם 5 מיקרוגרם/מ"ל של CD28 נגד עכבר (37.51) ו-10 מיקרוגרם/מ"ל של CD3 נגד עכבר (145-2c11) ב-375 מיקרוליטר / באר PBS למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס או למשך 3-4 שעות בחממה ב-37 מעלות צלזיוס ביום השלישי.
      הערה: עטפו צלחות בסרט שקוף אם מדגרים למשך הלילה כדי למנוע אידוי. מפעיל העכבר CD3/CD28 של Dynabeads יכול לשמש כחלופה עם תוצאות דומות.
  3. יום 3: שנה את מדיית Plat-E ובודד והפעל תאי T
    1. שנה את מדיית הטרנספקציה Plat-E ל-14 מ"ל של מדיום שלם DMEM בבוקר. הכן את מדיית תאי T על ידי הוספת RPMI-10: RPMI 1640 עם L-גלוטמין, 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 1x חומצות אמינו לא חיוניות MEM, 1 מ"מ נתרן פירובט, 50 מיקרומטר β-מרקפטואתנול ו-1 מ"מ HEPES.
    2. המתת חסד של עכברי JAXBoy (CD45.1) ו-C57B6/J (CD45.2) באמצעות שאיפת CO2ואחריה פריקת צוואר הרחם. לבודד טחול ובלוטות לימפה בתנאים סטריליים.
    3. מועכים בעדינות טחול על מסננת תאי רשת ניילון 100 מיקרומטר עם מדיום RPMI בצלחת 6 בארות בעזרת בוכנת מזרק.
    4. העבירו את התמיסה דרך מסננת תא רשת ניילון 40 מיקרומטר עבור תרחיף תא יחיד לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל. צנטריפוגה ב-450 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ושטפו אותם עם PBS Ca-/Mg-.
    5. בצע בחירה שלילית מגנטית באמצעות ערכת הבידוד Mouse T/T CD4 בהתאם להוראות היצרן, או לחלופין, מיין את התאים באמצעות FACS סטרילי
    6. ספרו את תאי ה-T באמצעות מונה תאים וצלחו אותם בבארות הפעלת תאי T ב-1-1.5 x 106 לבאר ב-1 מ"ל של מדיום RPMI-10 לבאר. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ באינקובטור לח. אפשר 24-48 שעות להפעלה תקינה, כפי שהוערך במיקרוסקופ, כפי שמוסבר בהערות שלהלן.
      הערה: הקישור הצולב של CD3 ו-CD28 מפעיל ביעילות את תאי ה-T בהגדרה זו. טחול עכבר אחד מניב בדרך כלל כ-1 x 108 טחול. תאי CD4+ T מהווים בדרך כלל כ-10% מכלל אוכלוסיית הטחול. לכן, להכנת צלחת 24 בארות עם 1-1.5 x 106 תאי CD4+ T לבאר, ההערכה היא שתאים מ 2-3 עכברים יספיקו.
  4. יום 4: התמרה
    1. בדוק את תאי ה-T לאחר 24 שעות במיקרוסקופ. ודא שתאי T נמצאים במצב פיצוץ (יוצרים אשכולות ונראים מוגדלים עקב הפעלה) לפני ההעברה. פיצוץ תאי T מבטיח שהם במצב חלוקה, שהוא חיוני להעברת MSCV9.
    2. אספו ~10 מ"ל של סופרנטנט ויראלי מלוחות 10 ס"מ בצינור חרוטי. החלף את לוחות התרבית Plat-E בעוד 10 מ"ל של מדיום Plat-E ללא אנטיביוטיקה כדי להבטיח מדיה מספקת ליצירת מדיה נוספת להתמרה שנייה למחרת. כוונן את נפח המדיה בלוחות PLAT-E בהתבסס על מספר בארות תאי T שיש להעביר למחרת.
      הערה: התמרה פי 2 משפרת משמעותית את היעילות.
    3. סנן את הסופרנטנט הנגיפי על ידי מעבר דרך מסנן מזרק של 0.45 מיקרומטר. מוסיפים 8 מיקרוגרם/מ"ל פוליברן ו-1:100 HEPES.
    4. סובב את לוחית תא ה-T בעלת 24 הבארות למשך 7 דקות ב-950 x גרם. אסוף בזהירות ושמור את הסופרנטנט מבלי לעקור את התאים. סופרנטנט זה מכיל ציטוקינים וגורמים אחרים המופרשים על ידי תאי T לאחר ההפעלה והוחלפו בסופרנטנט זה לאחר הזיהום כדי לשמור על פרופיל הציטוקינים והגורמים לתמיכה בשגשוג וצמיחה של תאי T.
    5. בצע חיטוי על ידי הוספת 1 מ"ל של סופרנטנט ויראלי לכל באר וסיבוב ב-1,150 x גרם למשך 4 שעות ב-32 מעלות צלזיוס. אוטמים את הצלחות בניילון נצמד במהלך חיטוי.
    6. לאחר חיטוי, החלף בזהירות את המדיה בחומר העל של תאי T שנשמר קודם לכן.
  5. יום 5: התמרה חוזרת
    1. חזור על הטרנספקציה כמתואר ביום 4. לחלופין, ערבב את ה-supernatant שנשמר בשלב 3.4.3 של תאי T שהופעלו בתחילה עם מדיה טרייה ביחס של 1:1 אם המדיה נראית מותשת.
  6. יום 6: שטיפת תאים והרחבה
    1. שטפו תאים עם PBS Ca+/Mg+. ולהעביר אותם ללוחית תרבית חדשה עם 130 U/mL של עכבר IL2 ו-10 ננוגרם/מ"ל של IL7 של עכבר. דגירה על התאים למשך יומיים לפחות או עד שהם מגיעים לרמת ההתפשטות הרצויה, בהתבסס על מספר התאים הדרושים להזרקה.
  7. יום 8: קציר וטיהור
    1. קצור תאים וטהר עם שיפוע צפיפות Histopaque 1.077.
      הערה: טכניקה זו עוזרת לבודד תאים ברי קיימא (כמו לימפוציטים או תאים חיסוניים אחרים) מתאים מתים או פסולת. תאים מתים, בעלי צפיפות גבוהה יותר, ישקעו בתחתית הצינור, בעוד שתאים ברי קיימא נשארים בדרך כלל בשכבת הממשק.
    2. הוסף 5 מ"ל של Histopaque 1.077 לצינור של 15 מ"ל. קצור תאים על ידי צנטריפוגה ב-450 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לגלול את התאים.
    3. השעו מחדש את גלולת התא ב-5 מ"ל של PBS Ca+/Mg+. שכב את מתלה התא בזהירות על גבי 5 מ"ל של Histopaque 1.077 בצינור הצנטריפוגה.
    4. צנטריפוגה ב-400-500 x גרם למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, מה שמבטיח שהשבירה/תאוצה של הצנטריפוגה מוגדרת לאפס.
    5. לאחר הצנטריפוגה, התאים ייפרדו לשכבות נפרדות על סמך צפיפות. התאים הרצויים יהיו בדרך כלל בשכבת הממשק בין ההיסטופק למדיום העליון, בעוד שתאים מתים ישקעו בתחתית. אסוף בזהירות את שכבת התא בשכבת הממשק באמצעות פיפטה, הימנע מזיהום בשכבות אחרות. התאים שנאספו מוכנים ונקיים כעת להזרקות.
    6. הערכת יעילות התמרה על ידי ביצוע צביעת Thy1.1 וניתוח ציטומטריית זרימה. ראה את אסטרטגיית השער באיור 1.
      הערה: לאחר הטרנסדוקציה, ניתן להשתמש בתאים במבחני כימוטקסיס כדי להעריך את נדידתם לעבר כימוקינים ספציפיים בהשוואה לתאי וקטור ביקורת כדי לאשר תפקודית את פעילותם במבחנה לפני שתמשיך בהזרקות.
  8. בדיקת לוקליזציה ארוכת טווח in vivo
    1. עבור ביות לטווח ארוך, השתמש ב-CD45.1 עבור GPCR של העכבר המעניין וב-CD45.2 עבור תאים מותמרים וקטוריים ריקים (או להיפך). ערבב את שתי אוכלוסיות התאים ביחס של 1:1.
    2. יש להזריק תוך ורידי 20-30 x 106 תאים בסך הכל עבור כל עכבר נמען Rag1-/- מבוגר עבור טרופיזם של שבוע אחד ו-5 x 106 עבור טרופיזם של 7 שבועות. אנו משתמשים במושתלי Rag1-/- חסרי לימפוציטים כדי להפחית את התחרות עם תאי T אנדוגניים.
    3. לאחר 1 עד 7 שבועות (תלוי במחקר), יש להזריק נוגדן נגד CD45 תוך ורידי (i.v.) לעכברים 5 דקות לפני הקטיף כדי לסמן תאים הנישאים בדם.
    4. המתת חסד של העכברים באמצעות שאיפת CO2 ואחריה פריקת צוואר הרחם.
      הערה: נערכו מחקרים של שבוע ו-7 שבועות; מחקרים ארוכים יותר עשויים להיות אפשריים אך טרם נבדקו.
    5. קצירת תאים מאיברים שונים בעלי עניין ובקרה. עכל את הרקמות על פי פרוטוקולי הכנת לימפוציטים סטנדרטיים לכל איבר10,11.
    6. צבעו את התאים שנאספו בנוגדנים חד שבטיים (mAbs) לניתוח זרימה ציטומטרי.
  9. ביות תחרותי לטווח קצר: מיקום והדמיה של תאי T
    1. אנו ממליצים להשתמש בעכברי C57B6/J כתורמים, בהתחשב בכך שאנו נסמן את התאים באופן פלואורסצנטי. עם זאת, עבור מבחני ביות קצרים מאוד של עד כמה שעות, ניתן להשתמש בכל מאמץ.
    2. ביום 8 של התרבית, יש לבודד מגנטית תאים מותמרים (Thy1.1+) באמצעות מיקרו-חרוזים CD90.1, על פי הוראות היצרן12.
    3. שמור רק על תאים מותמרים (>טוהר של 95%) בתרבית לאחר נקודה זו למשך יומיים תחת IL2 ו-IL7 כפי שצוין לעיל ואפשר להתרחב. המיקרו-חרוזים מתכלים ולאחר 48 שעות לא יפגעו בתפקוד תקין של התאים.
    4. ביום ה-11, סמנו את התאים המבטאים את ה-GPCR המעניין עם אסטר Carboxyfluorescein succinimidyl (CFSE הוא צבע צביעה של תאים פלואורסצנטיים). עבור תאי Stuffer, השתמש בצבע פלואורסצנטי צהוב, או להיפך. אתה יכול להשתמש בצבעים חלופיים אם אתה מעדיף.
      1. הכן תרחיף תאים בריכוז של 1 x 106 תאים/מ"ל ב-RPMI עם 2% FBS. דגרו את התאים עם הצבע בריכוז סופי של 5 מיקרומטר ב -37 מעלות צלזיוס באמבט מים עם תסיסה עדינה למשך 20 דקות. כדי להבטיח תוצאות דומות, החלף את הקצאות הצבע בניסויים נפרדים. לחלופין, השתמש בצבע בודד כדי לתייג סוג תא נפוץ כתקן פנימי, כולל תאי ניסוי ובקרה בנמענים שונים.
      2. שוטפים את התאים המסומנים ומערבבים אותם ביחס של 1:1. הערך את ריכוז התאים באמצעות מונה תאים. להזריק 15-30 x 106 תאים תוך ורידי לעכברים נמענים (WT או עכברים נמענים טרנסגניים, תלוי במטרת הניסוי).
    5. כ-10-12 שעות לאחר מכן, הזריקו לעכברים נוגדן אנטי-CD31 (למשל, DyLight 633 מסומן, שיבוט 390), שאמור להיות 10-15 דקות לפני ההקרבה כדי לתחום כלי דם ולהבחין בין תאים תוך-וסקולריים לתאים מחוץ לכלי הדם.
    6. המתת חסד של העכברים באמצעות שאיפת CO2 ואחריה פריקת צוואר הרחם. נתח לוקליזציה של תאים על ידי FACS של תרחיפי תאים כמתואר בשלב 3.8 לעיל או על ידי הדמיית תושבות רקמות שלמות כמו בשלב 3.9.8 או שלב 3.9.7 עבור איברים מעניינים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
    7. עבור איברים דקים כמו קנה הנשימה, קרן הרחם או בלוטות הלימפה, הכינו תושבות דלעת. הנח את הרקמה על שקופית עם סרט דו צדדי בצדדים, הוסף כמה טיפות של תמיסת הרכבה Fluoromount-G, כסה בהחלקת כיסוי ולחץ בעדינות ובאופן שווה כדי לקבע את החלקת הכיסוי לסרט באמצעות שקופית נפרדת או חפץ שטוח אחר.
    8. עבור חלקים קפואים, הטמע את הרקמה בתרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית (OCT). לריאות, יש לטפטף 50% OCT/PBS לפני ההטמעה.
    9. השתמש בזרימה ציטומטרית עבור איברי בקרה כגון בלוטת לימפה היקפית (PLN), טחול או דם כדי להעריך את יעילות ההעברה (% Thy1.1+) כפי שמוצג באיור 1 ולנרמל את התוצאות. דמיין PLN עם תושבות סקווש או קטעים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. ספירת תאים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית עם תוכנת Imaris.
    10. קבע את היחס בין תאים שהומרו GPCR לתאי בקרה (Stuffer transducted) באיברים שלמים או בתאי איברים ספציפיים. לנרמל ליחסי קלט שנקבעו על ידי FACS ו/או ליחס שהתאושש מאיברי בקרה שבהם ה-GPCR ידוע או משוער כלא רלוונטי.
    11. לניתוח לוקליזציה מיקרו-סביבתית בריאות, מדוד את מרחק התאים לציוני דרך היסטולוגיים (למשל, ממברנות בסיס סימפונות או ורידים) באמצעות תוכנת Imaris.

תוצאות

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לחקירת יכולתם של קולטנים ספציפיים לכוון לוקליזציה של תאי T in vivo. כהדגמה של פרוטוקול זה, השתמשנו ב-GPR2513. אנו מסוגלים להשיג יעילות התמרה של 30%-40% באמצעות פרוטוקול זה, כפי שהוערך על ידי צביעת Thy1.1 על ידי ציטומטריית זרימה. ביצענו ב?...

Discussion

בדיקת הביות המבוקרת הפנימית המתוארת במחקר זה היא שיטה מקיפה לבחינת סחר בתאי T בתיווך GPCR ומיקומם בתוך איברים ומיקרו-סביבות רקמות מגוונות. גישה זו משלבת מספר אופטימיזציות קריטיות כדי לשפר את יכולת השחזור, הדיוק והיעילות.

היבט קריטי של פרוטוקול זה הוא התמרה ?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

נתמך על ידי מענקי ה-NIH R01 AI178113 ו-R01 AI047822, מענק 1903-03787 מקרן הצדקה של ליאונה מ. והארי ב. הלמסלי, ומענקי התוכנית לחקר מחלות הקשורות לטבק (TRDRP) T31IP1880 ו-T33IR6609 ל-ECB; י.ב. נתמך על ידי פרס עמיתי מחקר של קרן קרוהן וקוליטיס של אמריקה (835171). B.O. נתמך על ידי מלגת פוסט-דוקטורט של קרן רמון ארצ'ס (מדריד, ספרד) ופרס עמיתי מחקר של קרן קרוהן וקוליטיס של אמריקה (574148). A.A. נתמך על ידי המכון לרפואה רגנרטיבית בקליפורניה (CIRM) - EDUC2-12677.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AF647 anti mouse CD90.1-Thy1.1 (OX-7)Biolegend 202507
anti-CD31 (DyLight 633, clone 390)InvivoMab BE0377
anti-mouse CD28 37.51eBiosciences 
anti-mouse CD3 145-2c11eBiosciences 
APCCy7 anti mouse CD3 (145-2c11)Biolegend 100329
BV421 anti mouse CD8b (Ly-3)Biolegend 126629
BV711 anti mouse CD4 (RM4-5) Biolegend 100549
CD90.1 microbeads Miltenyi 130-121-273
CFSE Thermoscientific C34554
FITC anti mouse CD45.2 (104)BDAB_395041
mouse IL2 Peprotech 200-02-50UG
mouse IL7 Peprotech  217-17-10UG
Mouse T CD4 isolation kit STEMCELL technologies 18000
MSCV-IRES- Thy1.1 GPR25Vectorbuilder 
MSCV-IRES- Thy1.1 StufferVectorbuilder 
PE-CD45 (30-F11) antibody Biolegend 103105
PECy7 anti mouse TCRb (H57-597)Tonbo
PercpCy5.5 anti mouse CD45.1 (A20)eBiosciences 
Platinum-E (Plat-E) cell Biolabs. Inc RV-101
Yellow fluorescent dye Thermoscientific 

References

  1. Cheng, L., et al. Structure, function and drug discovery of GPCR signaling. MolBiomed. 4 (1), 46 (2023).
  2. Lammermann, T., Kastenmuller, W. Concepts of GPCR-controlled navigation in the immune system. Immunol Rev. 289 (1), 205-231 (2019).
  3. Fu, H., Ward, E. J., Marelli-Berg, F. M. Mechanisms of t cell organotropism. Cell Mol Life Sci. 73 (16), 3009-3033 (2016).
  4. Cinalli, R. M., et al. T cell homeostasis requires g protein-coupled receptor-mediated access to trophic signals that promote growth and inhibit chemotaxis. Eur J Immunol. 35 (3), 786-795 (2005).
  5. Wu, V., et al. Illuminating the onco-GPCRome: Novel g protein-coupled receptor-driven oncocrine networks and targets for cancer immunotherapy. J Biol Chem. 294 (29), 11062-11086 (2019).
  6. Wu, V. H., et al. The GPCR-alpha(s)-pka signaling axis promotes T-cell dysfunction and cancer immunotherapy failure. Nat Immunol. 24 (8), 1318-1330 (2023).
  7. Ramezani, A., Hawley, T. S., Hawley, R. G. Stable gammaretroviral vector expression during embryonic stem cell-derived in vitro hematopoietic development. Mol Ther. 14 (2), 245-254 (2006).
  8. . . Plat-E retroviral packaging cells (RV-101) user manual. , (2024).
  9. Anderson, J., Hope, T. Intracellular trafficking of retroviral vectors: obstacles and advances. Gene Ther. 12, 1667-1678 (2005).
  10. Kim, E., et al. Isolation and analyses of lamina propria lymphocytes from mouse intestines. STAR Protoc. 3 (2), 101366 (2022).
  11. Steinert, E. M., et al. Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance. Cell. 161 (4), 737-749 (2015).
  12. Miltenyi Biotec. . CD90.1 MicroBeads mouse and rat. , (2024).
  13. Ocón, B., et al. A lymphocyte chemoaffinity axis for lung, non-intestinal mucosae and CNS. Nature. 635, 736-745 (2024).
  14. Sumida, H., et al. Gpr55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage. Sci Immunol. 2 (18), eaao1135 (2017).
  15. Foxman, E. F., Campbell, J. J., Butcher, E. C. Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis. J. Cell Biol. 139 (5), 1349-1360 (1997).
  16. Alawar, N., et al. A solution for highly efficient electroporation of primary cytotoxic T lymphocytes. BMC Biotechnol. 24 (1), 16 (2024).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

217

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved