Farklı Doku Mikroortamlarında GPCR Aracılı T Hücresi Lokalizasyonunu Araştırmak için Verimli Retroviral Transdüksiyon ve Rekabetçi Hedef Arama

Özet

Kaçakçılık reseptörlerinin retroviral transdüksiyonu ve reseptör aracılı organ ve mikroçevreye özgü lenfosit konumlandırmasını incelemek için rekabetçi hedef arama için geliştirilmiş protokoller sunuyoruz. Bu yöntem, bağışıklık hücresi kaçakçılığı mekanizmaları hakkında değerli bilgiler sunar ve gelecekteki temel ve terapötik araştırmalarda potansiyel uygulamalara sahiptir.

Özet

G-proteinine bağlı reseptör (GPCR) ekspresyonunun çeşitli doku mikro ortamlarında hücre pozisyonunu nasıl etkilediğini anlamak, immün hücre trafiği mekanizmalarını aydınlatmak için gereklidir. Hem kısa hem de uzun vadeli çalışmalar için geçerli olan, aynı kökenli kemoatraktan ligandlarını eksprese eden organlara GPCR aracılı T hücresi lokalizasyonunu incelemek için tasarlanmış rekabetçi bir hedef arama testi sunuyoruz. Yaklaşım, ilgilenilen GPCR'yi veya bir kontrol yapısını ifade etmek için T hücrelerinin rekombinant murin kök hücre virüsü (MSCV) transdüksiyonu için geliştirilmiş bir protokolü ve ardından alıcı farelerde rekabetçi hedef hedeflemeyi içerir. Farklı organlar arasındaki hücre dağılımı, akış sitometrisi ve/veya konfokal mikroskopi kullanılarak analiz edilir. Kısa süreli deneylerde (10-12 saat), konfokal mikroskopi, alveoller, bronş submukozası, venöz bölgeler ve akciğerdeki interstisyumun yanı sıra trakea, mide ve uterus boynuzunu kaplayan epitel dahil olmak üzere farklı hücre lokalizasyon paternlerini ortaya çıkardı. Uzun süreli çalışmalarda (1-7 hafta), akış sitometrisi, tercihli hücre birikimi hakkında bilgi sağladı, zaman içinde dokular içinde dinamik değişiklikleri ve potansiyel olgunlaşmayı veya yeniden konumlandırmayı ortaya çıkardı. Bu rekabetçi hedef arama testi, GPCR aracılı hücre konumlandırmasını incelemek için sağlam bir araçtır ve dokuya özgü dağılım ve immünoloji ve terapötik araştırmalardaki potansiyel uygulamalar hakkında değerli bilgiler sunar.

Giriş

G-proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler), sinyal iletimi, nörotransmisyon, hormon regülasyonu ve bağışıklık hücresi göçü dahil olmak üzere çeşitli hücresel süreçlerin düzenlenmesinde temeldir¹. Lenfosit göçünün ve lokalizasyonunun uzay-zamansal kontrolünde çok önemli bir rol oynarlar². İmmün yanıtların hazırlama aşaması sırasında, lokal mikro çevre ve hücresel etkileşimler, T lenfositleri, hedef arama reseptörleri olarak bilinen benzersiz bir adezyon molekülleri ve kemokin reseptörleri setini eksprese etmeye sevk eder. Bu adaptasyon, antijenle deneyimlenen T hücrelerinin organa özgü endotel hücreleri (EC'ler) ile etkileşime girmesini ve farklı hedef dokulara göç etmesini sağlar. T hücrelerinin doku tropizmi kazanma yeteneği, özellikle aynı organı etkileyen tekrarlayan enfeksiyonlar bağlamında, etkili hatırlama yanıtları için hayati önem taşır ^3,4.

GPCR'ler, bağışıklık hücrelerini, CD8 + T ve NK hücrelerini sitotoksik etki için tümör bölgelerine yönlendirmek veya CD4 + T hücrelerine diğer bağışıklık hücrelerinin aktivasyonunu destekleyerek bağışıklık tepkilerini düzenlemede yardımcı olmak gibi kritik işlevleri yerine getirdikleri belirli doku ve organlara yönlendirir. GPCR'lerin T hücrelerini kesin konumlarına nasıl yönlendirdiğini anlamak, hedefe yönelik immünoterapileri ilerletmek için çok önemlidir ^5,6. Bununla birlikte, zorluk, bu karmaşık etkileşimleri in vitro olarak modellemede yatmaktadır, çünkü hem mekansal olarak kısıtlı ipuçlarını hem de yönlü kemotaktik sinyalleri aynı anda çoğaltmak zordur.

Spesifik lökosit reseptörlerinin rollerini aydınlatmak, endojen popülasyonlardaki sınırlı ekspresyon sıklıkları ve bu reseptörlerin tipik olarak farklı hücre tiplerini süslemesi nedeniyle genellikle zordur. Bu karmaşıklık, belirli bir reseptörün rolünü diğer hücre alt kümesine özgü mekanizmalardan izole etmeyi zorlaştırır. İdeal olarak, yöntemler, net içgörüler sağlamak için yalnızca ilgilenilen reseptörde farklılık gösteren benzer popülasyonları karşılaştırmalıdır.

Bu zorlukların üstesinden gelmek için, T hücrelerinde verimli GPCR ekspresyonu için rekombinant MSCV retroviral transdüksiyonu kullanan rekabetçi bir hedef arama testi benimsedik. Miyeloproliferatif sarkom virüsü (PCMV) tabanlı MESV vektörlerinden ve Moloney murin lösemi virüsü (MMLV) tabanlı LN vektörlerinden elementleri birleştiren MSCV retroviral vektörleri, LN vektörlerinden^türetilen genişletilmiş bir hibrit paketleme sinyali içerir 7. Bu modifikasyon, in vivo olarak T hücresi lokalizasyonunun hem kısa hem de uzun vadeli çalışmalarını mümkün kılarak gen iletiminin verimliliğini arttırır. Yüksek titreli retroviral partiküller ve konfokal mikroskopi kullanan yaklaşım, karmaşık doku ortamlarında T hücresi konumlandırmasının ve etkileşimlerinin hassas bir şekilde görselleştirilmesini sağlar. Kaçakçılık reseptörlerinin retroviral transdüksiyonu ve reseptör aracılı organ ve mikroçevreye özgü lenfosit konumlandırmasını incelemek için dahili olarak kontrol edilen (rekabetçi olarak adlandırılan) hedef arama testlerinin performansı için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. Bu yöntemin genel amacı, bağışıklık hücresi kaçakçılığı mekanizmaları hakkında değerli bilgiler sağlamak ve hem temel araştırma hem de terapötik geliştirmede gelecekteki uygulamaları mümkün kılmaktır.

Protokol

Bu çalışmadaki tüm fareler, Gazi İşleri Palo Alto Sağlık Hizmetleri'ndeki (VAPAHCS) spesifik patojen içermeyen (SPF) tesislerde tutuldu. B6/SJL Prprc Pep3BoyJ (CD45.1), C57B6/J (CD45.2) ve Rag1-/- fareler Jackson Laboratories'den satın alındı. CD45.1 hücrelerini elde etmek için PepBoy kullanırken, JAXBoy (C57BL / 6J-Ptprc^em6Lutzy / J) kullanmanızı öneririz. JAXBoy, genetik tutarlılığı artıran geleneksel geri çaprazlama yerine CRISPR yoluyla üretilen tamamen koizojenik bir türdür. Tarihsel olarak, tamamen konjenik olmayan PepBoy fareleri (CD45.1) kullanan CD45 allotip işaretli çalışmalar, potansiyel değişkenliği ele almak için vahşi tip (WT / WT) karşılaştırmaları ile kontrol hedef arama ve devridaim testlerini içermiştir. JAXBoy fareleri artık tamamen izojenik bir alternatif olarak mevcut olduğundan, bu ek kontroller artık gerekli olmayabilir. Araştırmacılar, CD45.1 ve CD45.2 varyantları arasındaki farklılıkların - protein tirozin fosfataz olarak rolleri gibi - hücresel davranışı ve hedef arama modellerini etkileyebileceğini düşünmelidir. Metinde ve aşağıda tartışılan tüm protokoller onaylanmıştır veya akredite Laboratuvar Hayvanları Tıbbı Bölümü ve VA Palo Alto Sağlık Bakım Sistemindeki (VAPAHCS) Laboratuvar Hayvanları Bakımı Yönetim Paneli'nin yönergelerini karşılamaktadır. Hayvanlar onaylanmış prosedürler kullanılarak kurban edildi. Her iki cinsiyetten 8-12 haftalık fareler deneylere dahil edildi.

1. MSCV vektör hazırlama

1. İlgilenilen fare geninin kodlama bölgesi (GOI) veya bir ORF_Stuffer (negatif ORF kontrolü) ile MSCV-IRES-Thy1.1 retroviral vektörü satın alın
   NOT: Bu yapı, ilgilenilen GPCR geninin yanı sıra Thy1.1 yüzey işaretleyicisini içerir. Dahili Ribozom Giriş Bölgesi (IRES) bağlayıcısı, GPCR'nin Thy1.1 ile birlikte ekspresyonuna izin vererek, transdüksiyonlu hücrelerin akış sitometrisi veya manyetik boncuklarla saflaştırma ve izolasyon ile tanımlanmasını kolaylaştırır. Bu, özellikle GPCR'ye özgü antikorlar mevcut olmadığında, genellikle kötü çalışılmış GPCR'lerde olduğu gibi yararlıdır.
2. Plazmit tarafından kodlanan direnç genine (örneğin, ampisilin, kanamisin veya kloramfenikol) dayalı olarak uygun antibiyotik seçimi ile desteklenmiş Luria-Bertani (LB) suyunu aşılayarak MSCV plazmidini bakteri formunda ve kültüründe temin edin. LB besiyeri, pH 7.0'a ayarlanmış ve otoklavlama ile sterilize edilmiş tripton (10 g/L), maya özütü (5 g/L) ve NaCl'den (10 g/L) oluşur. Kültürü gece boyunca çalkalanan bir inkübatörde (220 RPM) 37 ° C'de inkübe edin.
3. Bir DNA Hazırlama kiti kullanarak standart moleküler biyoloji tekniklerini kullanarak plazmit stoklarını hazırlayın.
4. DNA izolasyonunu takiben, DNA konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile ölçün ve 1 μg/μL konsantrasyonda çalışan plazmid çözeltileri hazırlayın. Plazmitleri ileride kullanmak üzere -20 °C'de saklayın.

2. Paketleme hücre hattı kültürünün kurulması

NOT: Cell Biolabs'tan Platinum E (Plat-E) hücrelerini kullandık. Plat-E hücreleri, retroviral yapısal proteinlerin (gag, pol ve env genleri) kararlı ve yüksek verimli bir ekspresyonunu sağlayan ve tek bir plazmit transfeksiyonu ile retroviral paketlemeyi mümkün kılan bir EF1α promotörüne sahip 293T bazlı bir hücre hattıdır⁸. NIH-3T3 veya 293T gibi diğer hücre hatları kullanılabilse de, bu alternatifleri test etmedik.

1. DMEM,% 10 FBS,% 1 Penisilin / Streptomisin, Blasticidin (10 μg / mL) ve Puromisin (1 μg / mL) ekleyerek Plat-E hücre ortamını hazırlayın. Hücre bakımı için blastisidin ve puromisin kullanın, ancak transfeksiyon sırasında ve sonrasında bunları atlayın.
2. Plaka Plat-E hücreleri 1.0 mL'de, DMEM'de >3 x 10⁶ hücre / mL'de,% 20 FBS ve% 10 DMSO'da donmuş olarak gönderilir. 37 °C'lik bir su banyosunda hızla çözdürün. Çözülen hücrelerin tümünü Plat-E kültür ortamı içeren 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
3. 450 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için hafifçe pipetleyerek hücre peletini 1 mL Plat-E ortamında yeniden süspanse edin.
4. 10 cm'lik bir kültür kabına 9 mL Plat-E ortamı ekleyin, ardından 1 mL yeniden süspanse edilmiş hücreleri tabağa aktarın. Eşit hacimde hücre süspansiyonu ve Tripan Mavisi karıştırarak ve canlı (lekelenmemiş) ve ölü (mavi lekeli) hücreleri bir hemositometre veya hücre sayacı kullanarak sayarak% >70 canlılığı hedefleyerek çözülmüş hücrelerin canlı olduğunu onaylayın.
5. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ile nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin. İlk 3 gün ortamı değiştirmeyin; İlk çözülmede yüzen ve ölü hücrelerin gözlemlenmesi normaldir.
6. Hücreler% 85 -% 90 birleşmeye ulaştığında, DMEM / PBS Ca- / Mg- ile yıkayın. 2 mL% 0.05 Tripsin / 0.5 mM EDTA kullanarak hücreleri ayırın ve 37 ° C'de 3 dakika inkübe edin. 8 mL Plat-E ortamı ekleyin, hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpe toplayın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 450 x g'da santrifüjleyin.
7. 1:10 veya 1:5 yüzey oranında bölün (yani, orijinal tabaktan toplam hacmin 1/10 veya 1/5'i ile yeni tabaklar ekin). 10 mL Plat-E ortamının son hacminde yeniden süspanse edin ve% 5 CO₂ ile nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
8. Hücrelerin geri kalanını %10 DMSO ile 1 mL FBS'de ayırın ve -80 ° C'de ve ardından uzun süreli kullanım için sıvı nitrojen içinde dondurun.
   NOT: Hücreleri% 85'e yakın birleştiğinde yukarıda açıklandığı gibi tedavi edin. Optimal hücre sağlığını korumak için, aşırı birleşmeden kaçının ve 1:10 seyreltme ile 3 günlük bölünmeleri hedefleyin. Büyüme yavaşlarsa, taze bir alikot kullanın. Hücre performansı tipik olarak sonraki geçişlerle azalır. En iyi sonuçlar için 4. ve 15. pasajlar arasında transfeksiyon için hücrelerin kullanılmasını öneririz.

3. Dönüştürülen hücrelerin üretimi

1. 1. Gün: Tohum Plat E hücreleri
   NOT: Gerekli Plat E hücrelerinin ve plakalarının sayısını hesaplayın. Hücreleri 2 kez transfekte etmek için 24 oyuklu bir plakada kuyu başına 1 mL viral süpernatan kullandık. Tipik olarak, kültürde T hücreleri bulunan 24 oyuklu plaka başına Plate-E hücreli yaklaşık iki adet 10 cm'lik Petri kabı transfekte edilmiş plaka kullanırız.
   1. 10 cm'lik doku kültürü plakalarını steril suda 5 mL 50 μg/mL poli-D-lizin ile kaplayarak başlayın. Oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Kalıntı kalmadığından emin olmak için 2 kez steril PBS Ca-/Mg ile yıkayın.
      NOT: Plat-E hücreleri transfeksiyondan sonra ayrılma eğiliminde olduğundan, düşük hücre performansına ve viral titre üretiminin azalmasına neden olduğundan plakaların kaplanmasını öneririz.
   2. Plat-E hücrelerini yukarıda adım 2.6'da açıklandığı gibi ayırın ve canlılığı sağlamak için bir tripan mavisi dışlama testi gerçekleştirin. Eşit hacimde hücre süspansiyonu ve Tripan Mavisi karıştırın. Bir hemositometre / hücre sayacı kullanarak canlı (lekelenmemiş) ve ölü (mavi lekeli) hücreleri sayın. Antibiyotik içermeyen Plat-E ortamı ile 10 cm'lik bir doku kültürü Petri kabında 3 x 10⁶ canlı hücre tohumlayın.
      NOT: Tohumlanmış plakalar ertesi gün %85-90 oranında birleşim noktasına ulaşmalıdır. Bu elde edilemezse, farklı bir hücre alikotu kullanmayı düşünün. Tohumlama yoğunluğunu kaplama zamanlamasına göre ayarlayın; Akşam kaplama için 3,5 x 10⁶ hücre kullanılabilir.
2. 2. Gün: Anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları ile Plat-E hücrelerinin ve T hücreleri için kaplama plakalarının transfeksiyonu
   1. Plat-E hücre kültürlerindeki ortamı 6.5 mL azaltılmış serum ortamı ile değiştirin.
   2. Transfeksiyon karışımını, Lipofektamin reaktifi için üreticinin talimatlarına göre hazırlayın (bu çalışmada Lipofectamine 2000 kullanılmıştır).
   3. Her plaka için, bir tüpte 45 μL Lipofectamine 2000'i 210 μL indirgenmiş serum ortamı ile ve başka bir tüpte 235 μL indirgenmiş serum ortamı ile 15 μg DNA'yı karıştırın. Tüplerin içeriğini 3x-4x pipetleyerek birleştirin.
   4. Lipofektamin / DNA komplekslerinin oluşmasına izin vermek için karışımı oda sıcaklığında 5-20 dakika inkübe edin, ardından plakalara damla damla ekleyin. Plakaları 37 °C'de 16 saat inkübe edin.
   5. T hücresi aktivasyon kuyucukları: 24 oyuklu plakayı 5 μg / mL anti-fare CD28 (37.51) ve 10 μg / mL anti-fare CD3 (145-2c11) ile 375 μL / kuyu PBS'de gece boyunca 4 ° C'de veya 3. günde 37 ° C'de inkübatörde 3-4 saat boyunca kaplayın.
      NOT: Buharlaşmayı önlemek için gece boyunca inkübe ediyorsanız plakaları şeffaf filme sarın. Dynabeads fare aktivatörü CD3 / CD28, karşılaştırılabilir sonuçlarla bir alternatif olarak kullanılabilir.
3. 3. Gün: Plat-E ortamını değiştirin ve T hücrelerini izole edin ve aktive edin
   1. Sabahları Plat-E transfeksiyon ortamını 14 mL DMEM tam ortama değiştirin. RPMI-10 ekleyerek T Hücre Ortamını hazırlayın: L-glutamin, %10 FBS, %1 Penisilin / Streptomisin, 1x MEM Esansiyel olmayan amino asitler, 1 mM sodyum piruvat, 50 μM β-merkaptoetanol ve 1 mM HEPES içeren RPMI 1640.
   2. JAXBoy (CD45.1) ve C57B6 / J (CD45.2) farelerini CO₂inhalasyonu ve ardından servikal çıkık kullanarak ötenazi yapın. Steril koşullar altında dalakları ve lenf düğümlerini izole edin.
   3. Bir şırınga pistonu kullanarak 6 oyuklu bir plakada RPMI ortamı ile 100 μm'lik bir naylon örgü hücre süzgeci üzerinde dalakları nazikçe ezin.
   4. Çözeltiyi, tek hücreli bir süspansiyon için 40 μm'lik bir naylon ağ hücre süzgecinden 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 450 x g'da santrifüjleyin ve PBS Ca- / Mg- ile yıkayın.
   5. Üreticinin talimatlarını izleyerek Fare T/T CD4 İzolasyon Kitini kullanarak manyetik negatif seçim yapın veya alternatif olarak hücreleri steril FACS kullanarak sıralayın
   6. T hücrelerini bir hücre sayacı kullanarak sayın ve bunları oyuk başına 1 mL RPMI-10 ortamında kuyu başına 1-1.5 x^{10 6'da} T hücresi aktivasyon kuyucuklarında kaplayın. Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde %5 CO₂ ile 37 ° C'de inkübe edin. Aşağıdaki notlarda açıklandığı gibi, mikroskop altında değerlendirildiği gibi uygun aktivasyon için 24-48 saat bekleyin.
      NOT: CD3 ve CD28'in çapraz bağlanması, bu kurulumdaki T hücrelerini etkili bir şekilde aktive eder. Bir fare dalağı tipik olarak yaklaşık 1 x 10⁸ splenosit verir. CD4+ T hücreleri genellikle toplam splenosit popülasyonunun yaklaşık %10'unu oluşturur. Bu nedenle, oyuk başına 1-1.5 x 10⁶ CD4+ T hücresi ile 24 oyuklu bir plaka hazırlamak için 2-3 fareden alınan hücrelerin yeterli olacağı tahmin edilmektedir.
4. 4. Gün: Transdüksiyon
   1. T hücrelerini mikroskop altında 24 saat sonra kontrol edin. Transdüksiyondan önce T hücrelerinin patlatma durumunda olduğundan (kümeler oluşturduğundan ve aktivasyon nedeniyle genişlemiş göründüğünden) emin olun. Patlatma T hücreleri, MSCV transdüksiyonu⁹ için çok önemli olan bölünme durumunda olmalarını sağlar.
   2. Konik bir tüpteki 10 cm'lik plakalardan ~ 10 mL viral süpernatan toplayın. Ertesi gün ikinci bir transdüksiyon için daha fazla ortam oluşturmak için yeterli ortamı sağlamak için Plat-E kültür plakalarını antibiyotiksiz başka bir 10 mL Plat-E ortamı ile değiştirin. Ertesi gün transfekte edilmesi gereken T hücresi kuyularının sayısına bağlı olarak PLAT-E plakalarındaki ortam sesini ayarlayın.
      NOT: 2x dönüştürme, verimliliği önemli ölçüde artırır.
   3. 0.45 μm'lik bir şırınga filtresinden geçerek viral süpernatanı filtreleyin. 8 μg/mL polibren ve 1:100 HEPES ekleyin.
   4. 24 oyuklu T hücre plakasını 950 x g'da 7 dakika döndürün. Hücreleri yerinden çıkarmadan süpernatanı dikkatlice toplayın ve kurtarın. Bu süpernatant, aktivasyondan sonra T hücreleri tarafından salgılanan sitokinleri ve diğer faktörleri içerir ve T hücresi proliferasyonunu ve büyümesini desteklemek için sitokin ve faktör profilini korumak için spenfeksiyondan sonra bu süpernatan ile değiştirilir.
   5. Her oyuğa 1 mL viral süpernatan ekleyerek ve 32 ° C'de 4 saat boyunca 1.150 x g'da döndürerek spdezenfeksiyon gerçekleştirin. Püskürtme sırasında plakaları plastik sargı ile kapatın.
   6. Enfeksiyondan sonra, ortamı önceden kaydedilmiş T hücresi süpernatanı ile dikkatlice değiştirin.
5. 5. Gün: Transdüksiyonu tekrarlayın
   1. Transfeksiyonu 4. günde tarif edildiği gibi tekrarlayın. İsteğe bağlı olarak, başlangıçta aktive edilmiş T hücrelerinin 3.4.3 adımında kaydedilen süpernatanı, ortam tükenmiş görünüyorsa 1: 1 oranında taze ortamla karıştırın.
6. 6. Gün: Hücreleri yıkayın ve genişletin
   1. Hücreleri PBS Ca + / Mg + ile yıkayın. ve bunları 130 U/mL fare IL2 ve 10 ng/mL fare IL7 içeren yeni bir kültür plakasına aktarın. Hücreleri en az 2 gün veya enjeksiyon için gereken hücre sayısına bağlı olarak istenen genişleme seviyesine ulaşana kadar inkübe edin.
7. 8. Gün: Hasat ve saflaştırma
   1. Hücreleri hasat edin ve Histopak 1.077 yoğunluk gradyanı ile saflaştırın.
      NOT: Bu teknik, canlı hücrelerin (lenfositler veya diğer bağışıklık hücreleri gibi) ölü hücrelerden veya döküntülerden izole edilmesine yardımcı olur. Daha yüksek yoğunluğa sahip olan ölü hücreler tüpün dibine yerleşirken, canlı hücreler tipik olarak arayüz katmanında kalır.
   2. 15 mL'lik bir tüpe 5 mL Histopaque 1.077 ekleyin. Hücreleri peletlemek için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 450 x g'da santrifüjleyerek hücreleri hasat edin.
   3. Hücre peletini 5 mL PBS Ca + / Mg + içinde yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu, santrifüj tüpündeki 5 mL Histopaque 1.077'nin üzerine dikkatlice yerleştirin.
   4. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 400-500 x g'da santrifüjleyin ve santrifüjün kırılma/ivmesinin sıfıra ayarlandığından emin olun.
   5. Santrifüjlemeden sonra, hücreler yoğunluğa bağlı olarak farklı katmanlara ayrılacaktır. İstenen hücreler tipik olarak Histopak ile üst ortam arasındaki arayüz katmanında olurken, ölü hücreler altta yerleşecektir. Hücre katmanını bir pipet kullanarak arayüz katmanında dikkatlice toplayın ve diğer katmanlarla kontaminasyonu önleyin. Toplanan hücreler artık enjeksiyonlar için hazır ve temizdir.
   6. Thy1.1 boyama ve akış sitometrisi analizi yaparak transdüksiyon verimliliğini değerlendirin. Şekil 1'deki geçit stratejisine bakın.
      NOT: Transdüksiyondan sonra hücreler, enjeksiyonlara devam etmeden önce aktivitelerini in vitro olarak işlevsel olarak doğrulamak için kontrol vektör hücrelerine kıyasla belirli kemokinlere doğru göçlerini değerlendirmek için kemotaksis tahlillerinde kullanılabilir.
8. Uzun süreli in vivo lokalizasyon testi
   1. Uzun süreli hedef arama için, ilgilenilen fare GPCR'si için CD45.1 ve boş vektör (veya tam tersi) dönüştürülmüş hücreler için CD45.2 kullanın. İki hücre popülasyonunu 1:1 oranında karıştırın.
   2. 1 haftalık tropizm için her Rag1-/- yetişkin alıcı fare için intravenöz olarak 20-30 x^{10 6} hücre ve 7 haftalık tropizm için 5 x^{10 6} hücre enjekte edin. Endojen T hücreleri ile rekabeti azaltmak için lenfosit eksikliği olan Rag1-/- alıcılarını kullanıyoruz.
   3. 1 ila 7 hafta sonra (çalışmaya bağlı olarak), kan yoluyla bulaşan hücreleri etiketlemek için hasattan 5 dakika önce farelere intravenöz olarak (i.v.) anti-CD45 antikoru enjekte edin.
   4. CO₂ inhalasyonu ve ardından servikal çıkık kullanarak fareleri ötenazi yapın.
      NOT: 1 hafta ve 7 haftalık çalışmalar yapılmış olup; Daha uzun çalışmalar mümkün olabilir, ancak henüz test edilmemiştir.
   5. Farklı ilgi ve kontrol organlarından hücreleri toplayın. Dokuları her organ için standart lenfosit hazırlama protokollerine göre sindirin^10,11.
   6. Akış sitometrik analizi için toplanan hücreleri monoklonal antikorlar (mAbs) ile boyayın.
9. Kısa vadeli rekabetçi hedef arama: T hücresi konumlandırma ve Görüntüleme
   1. Hücreleri floresan olarak etiketleyeceğimiz göz önüne alındığında, C57B6 / J farelerini donör olarak kullanmanızı öneririz. Bununla birlikte, birkaç saate kadar çok kısa hedef arama testleri için herhangi bir suş kullanılabilir.
   2. Kültürün 8. gününde, üreticinin talimatlarına göre CD90.1 mikro boncukları kullanarak transdüksiyona uğramış (Thy1.1+) hücreleri manyetik olarak izole edin¹².
   3. Bu noktadan sonra kültürde yukarıda belirtildiği gibi IL2 ve IL7 altında 2 gün boyunca sadece dönüştürülmüş hücreleri (% >95 saflıkta) koruyun ve genişlemesine izin verin. Mikro boncuklar biyolojik olarak parçalanabilir ve 48 saat sonra normal hücre fonksiyonunu bozmaz.
   4. 11. Günde, ilgilenilen GPCR'yi ifade eden hücreleri Karboksifloresein süksinimidil ester ile etiketleyin (CFSE bir floresan hücre boyama boyasıdır). Doldurucu hücreler için sarı bir floresan boya kullanın veya tam tersi. Tercih ederseniz alternatif boyalar kullanabilirsiniz.
      1. % 2 FBS ile RPMI'de 1 x 10⁶ hücre / mL konsantrasyonda bir hücre süspansiyonu hazırlayın. Hücreleri, 37 ° C'de 5 μM'lik bir son konsantrasyonda boya ile 20 dakika boyunca hafif çalkalama ile bir su banyosunda inkübe edin. Karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için, boya atamalarını ayrı deneylerde değiştirin. Alternatif olarak, farklı alıcılardaki deneysel ve kontrol hücreleri de dahil olmak üzere ortak bir hücre tipini dahili bir standart olarak etiketlemek için tek bir boya kullanın.
      2. Etiketli hücreleri yıkayın ve 1:1 oranında karıştırın. Bir hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu tahmin edin. 15-30 x 10⁶ hücreyi intravenöz olarak alıcı farelere (deneyin amacına bağlı olarak WT veya transgenik alıcı fareler) enjekte edin.
   5. Yaklaşık 10-12 saat sonra, farelere anti-CD31 (örneğin, DyLight 633 etiketli, klon 390) antikoru enjekte edin, bu da kan damarlarını tanımlamak ve intravasküler hücreleri ekstravaze hücrelerden ayırt etmek için fedakarlıktan 10-15 dakika önce olmalıdır.
   6. CO₂ inhalasyonu ve ardından servikal çıkık kullanarak fareleri ötenazi yapın. Yukarıdaki adım 3.8'de tarif edildiği gibi hücre süspansiyonlarının FACS'si ile hücre lokalizasyonunu veya konfokal mikroskopi kullanarak ilgilenilen organlar için adım 3.9.8 veya adım 3.9.7'deki gibi doku tüm montajlarını görüntüleyerek analiz edin.
   7. Trakea, rahim boynuzu veya lenf düğümleri gibi ince organlar için kabak yuvaları hazırlayın. Dokuyu yanlarında çift taraflı bant bulunan bir slayt üzerine yerleştirin, birkaç damla Fluoromount-G montaj solüsyonu ekleyin, bir kapak fişi ile örtün ve lameli ayrı bir slayt veya başka bir düz nesne kullanarak banda sabitlemek için nazikçe ve eşit şekilde bastırın.
   8. Donmuş bölümler için, dokuyu optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğine gömün. Akciğerler için, gömmeden önce %50 OCT / PBS ile perfüze edin.
   9. Şekil 1'de gösterildiği gibi transdüksiyon verimliliğini (% Thy1.1+) değerlendirmek için periferik lenf nodu (PLN), dalak veya kan gibi kontrol organları için akış sitometrisi kullanın ve sonuçları normalleştirin. Konfokal mikroskopi kullanarak PLN'yi kabak montajları veya kesitleri ile görselleştirin. Imaris yazılımı ile konfokal mikroskopi kullanarak hücreleri sayın.
   10. GPCR ile dönüştürülen hücrelerin, tüm organlardaki veya belirli organ bölmelerindeki kontrol hücrelerine (Stuffer transdüksiyonlu) oranını belirleyin. FACS tarafından belirlenen giriş oranlarına ve/veya GPCR'nin ilgisiz olduğu bilinen veya varsayılan kontrol organlarından elde edilen orana normalleştirin.
   11. Akciğerlerdeki mikroçevresel lokalizasyonun analizi için, Imaris yazılımını kullanarak hücrelerin histolojik işaretlere (örneğin, bronşiyal bazal membranlar veya damarlar) olan mesafesini ölçün.

Sonuçlar

Bu çalışmada, spesifik reseptörlerin in vivo olarak T hücresi lokalizasyonunu yönlendirme yeteneğini araştırmak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu protokolün bir gösterimi olarak GPR25¹³ kullandık. Akış sitometrisi ile Thy1.1 boyama ile değerlendirildiği gibi, bu protokolü kullanarak% 30 -% 40 transdüksiyon verimliliği elde edebiliyoruz. Doldurucu kontrollerinin yanı sıra GPR25 ile dönüştürülmüş hücreleri kullanarak in v...

Tartışmalar

Bu çalışmada özetlenen dahili olarak kontrol edilen hedef arama testi, GPCR aracılı T hücresi trafiğini ve çeşitli organlar ve doku mikro çevreleri içinde konumlandırmayı incelemek için kapsamlı bir yöntemdir. Bu yaklaşım, tekrarlanabilirliği, doğruluğu ve verimliliği artırmak için çeşitli kritik optimizasyonları entegre eder.

Bu protokolün kritik bir yönü, viral üretim için Plat-E hücrelerinin kullanılmasıyla kolaylaştır?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
AF647 anti mouse CD90.1-Thy1.1 (OX-7)	Biolegend	202507
anti-CD31 (DyLight 633, clone 390)	InvivoMab	BE0377
anti-mouse CD28 37.51	eBiosciences
anti-mouse CD3 145-2c11	eBiosciences
APCCy7 anti mouse CD3 (145-2c11)	Biolegend	100329
BV421 anti mouse CD8b (Ly-3)	Biolegend	126629
BV711 anti mouse CD4 (RM4-5)	Biolegend	100549
CD90.1 microbeads	Miltenyi	130-121-273
CFSE	Thermoscientific	C34554
FITC anti mouse CD45.2 (104)	BD	AB_395041
mouse IL2	Peprotech	200-02-50UG
mouse IL7	Peprotech	217-17-10UG
Mouse T CD4 isolation kit	STEMCELL technologies	18000
MSCV-IRES- Thy1.1 GPR25	Vectorbuilder
MSCV-IRES- Thy1.1 Stuffer	Vectorbuilder
PE-CD45 (30-F11) antibody	Biolegend	103105
PECy7 anti mouse TCRb (H57-597)	Tonbo
PercpCy5.5 anti mouse CD45.1 (A20)	eBiosciences
Platinum-E (Plat-E)	cell Biolabs. Inc	RV-101
Yellow fluorescent dye	Thermoscientific