Effiziente retrovirale Transduktion und kompetitives Homing zur Untersuchung der GPCR-vermittelten T-Zell-Lokalisierung in verschiedenen Gewebemikroumgebungen

Zusammenfassung

Wir stellen verbesserte Protokolle für die retrovirale Transduktion von Transportrezeptoren und kompetitives Homing vor, um die Rezeptor-vermittelte organ- und mikroumgebungsspezifische Lymphozytenpositionierung zu untersuchen. Diese Methode bietet wertvolle Einblicke in die Mechanismen des Transports von Immunzellen und hat potenzielle Anwendungen in der zukünftigen Grundlagen- und Therapieforschung.

Zusammenfassung

Das Verständnis, wie die Expression des G-Protein-gekoppelten Rezeptors (GPCR) die Zellpositionierung in verschiedenen Gewebemikroumgebungen beeinflusst, ist für die Aufklärung der Mechanismen des Immunzelltransports unerlässlich. Wir präsentieren einen kompetitiven Homing-Assay, der entwickelt wurde, um die GPCR-vermittelte T-Zell-Lokalisierung in Organen zu untersuchen, die ihre verwandten Chemoattraktant-Liganden exprimieren, und der sowohl für Kurzzeit- als auch für Langzeitstudien geeignet ist. Der Ansatz beinhaltet ein verbessertes Protokoll für die Transduktion von T-Zellen durch rekombinante murine Stammzellviren (MSCV), um das interessierende GPCR oder ein Kontrollkonstrukt zu exprimieren, gefolgt von kompetitivem Homing in Empfängermäusen. Die Zellverteilung in verschiedenen Organen wird mittels Durchflusszytometrie und/oder konfokaler Mikroskopie analysiert. In Kurzzeitexperimenten (10-12 h) zeigte die konfokale Mikroskopie deutliche Zelllokalisationsmuster, u.a. in den Lungenbläschen, den Bronchien submukosa, den venösen Stellen und dem Interstitium in der Lunge sowie im Epithel, das die Luftröhre, den Magen und das Uterushorn auskleidet. In Langzeitstudien (1-7 Wochen) lieferte die Durchflusszytometrie Einblicke in die bevorzugte Zellakkumulation und zeigte so dynamische Veränderungen und eine mögliche Reifung oder Neupositionierung innerhalb des Gewebes im Laufe der Zeit. Dieser kompetitive Homing-Assay ist ein robustes Werkzeug zur Untersuchung der GPCR-vermittelten Zellpositionierung und bietet wertvolle Einblicke in die gewebespezifische Verteilung und potenzielle Anwendungen in der Immunologie und therapeutischen Forschung.

Einleitung

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind von grundlegender Bedeutung für die Regulierung einer Vielzahl von zellulären Prozessen, einschließlich Signaltransduktion, Neurotransmission, Hormonregulation und Immunzellmigration¹. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der räumlich-zeitlichen Kontrolle der Migration und Lokalisation von Lymphozyten². Während der Priming-Phase der Immunantwort veranlassen die lokale Mikroumgebung und zelluläre Wechselwirkungen die T-Lymphozyten, eine einzigartige Gruppe von Adhäsionsmolekülen und Chemokinrezeptoren zu exprimieren, die als Homing-Rezeptoren bekannt sind. Diese Anpassung ermöglicht es antigenerfahrenen T-Zellen, mit organspezifischen Endothelzellen (ECs) in Kontakt zu treten und in unterschiedliche Zielgewebe zu wandern. Die Fähigkeit von T-Zellen, Gewebetropismus zu erwerben, ist entscheidend für effektive Recall-Reaktionen, insbesondere im Zusammenhang mit wiederkehrenden Infektionen, die dasselbe Organ betreffen ^3,4.

GPCRs leiten Immunzellen zu bestimmten Geweben und Organen, wo sie kritische Funktionen erfüllen - wie z. B. die Leitung von CD8+ T- und NK-Zellen zu Tumorstellen für eine zytotoxische Wirkung oder die Unterstützung von CD4+ T-Zellen bei der Orchestrierung von Immunantworten, indem sie die Aktivierung anderer Immunzellen unterstützen. Zu verstehen, wie GPCRs T-Zellen an ihre genauen Orte leiten, ist für die Weiterentwicklung zielgerichteter Immuntherapien unerlässlich ^5,6. Die Herausforderung liegt jedoch darin, diese komplexen Wechselwirkungen in vitro zu modellieren, da es schwierig ist, sowohl räumlich eingeschränkte Signale als auch gerichtete chemotaktische Signale gleichzeitig zu replizieren.

Die Aufklärung der Rolle spezifischer Leukozytenrezeptoren ist auch oft schwierig, da sie in endogenen Populationen nur begrenzt exprimiert werden und diese Rezeptoren typischerweise unterschiedliche Zelltypen schmücken. Diese Komplexität macht es schwierig, die Rolle eines spezifischen Rezeptors von anderen zellspezifischen Mechanismen zu isolieren. Im Idealfall sollten die Methoden ähnliche Populationen vergleichen, die sich nur im interessierenden Rezeptor unterscheiden, um klare Erkenntnisse zu liefern.

Um diese Herausforderungen zu meistern, haben wir einen kompetitiven Homing-Assay eingeführt, der rekombinante retrovirale MSCV-Transduktion für eine effiziente GPCR-Expression in T-Zellen einsetzt. Retrovirale MSCV-Vektoren, die Elemente aus den auf dem myeloproliferativen Sarkomvirus (PCMV) basierenden MESV-Vektoren und den auf dem Moloney-Mausleukämievirus (MMLV) basierenden LN-Vektoren kombinieren, enthalten ein erweitertes hybrides Verpackungssignal, das von den LN-Vektoren abgeleitet ist⁷. Diese Modifikation erhöht die Effizienz der Genverabreichung und ermöglicht sowohl Kurzzeit- als auch Langzeitstudien zur T-Zell-Lokalisierung in vivo. Durch die Verwendung von retroviralen Partikeln mit hohem Titer und konfokaler Mikroskopie ermöglicht der Ansatz eine präzise Visualisierung der Positionierung und Wechselwirkungen von T-Zellen in komplexen Gewebeumgebungen. Wir stellen detaillierte Protokolle für die retrovirale Transduktion von Transportrezeptoren und die Durchführung von intern kontrollierten (sogenannten kompetitiven) Homing-Assays vor, um die rezeptorvermittelte organ- und mikroumgebungsspezifische Lymphozytenpositionierung zu untersuchen. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, wertvolle Einblicke in die Mechanismen des Immunzelltransports zu liefern und zukünftige Anwendungen sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der therapeutischen Entwicklung zu ermöglichen.

Protokoll

Alle Mäuse in dieser Studie wurden in spezifischen pathogenfreien (SPF) Einrichtungen des Veterans Affairs Palo Alto Health Care System (VAPAHCS) gehalten. B6/SJL Prprc Pep3BoyJ (CD45.1), C57B6/J (CD45.2) und Rag1-/- Mäuse wurden von Jackson Laboratories gekauft. Während wir PepBoy zur Gewinnung von CD45.1-Zellen verwendet haben, empfehlen wir die Verwendung von JAXBoy (C57BL/6J-Ptprc^em6Lutzy/J). JAXBoy ist ein vollständig coisogener Stamm, der durch CRISPR anstelle von herkömmlicher Rückkreuzung erzeugt wird, was die genetische Konsistenz verbessert. In der Vergangenheit umfassten CD45-Allotyp-markierte Studien mit PepBoy-Mäusen (CD45.1), die nicht vollständig kongenisch sind, Kontroll-Homing- und Rezirkulations-Assays mit Wildtyp-Vergleichen (WT/WT), um potenzielle Variabilität zu berücksichtigen. Da JAXBoy-Mäuse jetzt als vollständig isogene Alternative verfügbar sind, sind diese zusätzlichen Kontrollen möglicherweise nicht mehr erforderlich. Die Forscher sollten dennoch berücksichtigen, dass Unterschiede zwischen CD45.1- und CD45.2-Varianten - wie ihre Rolle als Protein-Tyrosin-Phosphatasen - das zelluläre Verhalten und die Homing-Muster beeinflussen können. Alle Protokolle, die im Text und im Folgenden besprochen werden, wurden genehmigt oder entsprechen den Richtlinien der akkreditierten Abteilung für Labortiermedizin und des Verwaltungsgremiums für die Versorgung von Labortieren am VA Palo Alto Health Care System (VAPAHCS). Die Tiere wurden nach anerkannten Verfahren getötet. Mäuse beiderlei Geschlechts im Alter von 8-12 Wochen wurden in die Experimente eingeschlossen.

1. Vorbereitung des MSCV-Vektors

1. Kauf eines retroviralen Vektors MSCV-IRES-Thy1.1 mit der kodierenden Region des interessierenden Maus-Gens (GOI) oder einer ORF_Stuffer (negative ORF-Kontrolle)
   HINWEIS: Dieses Konstrukt enthält den Oberflächenmarker Thy1.1 neben dem interessierenden GPCR-Gen. Der IRES-Linker (Internal Ribosome Entry Site) ermöglicht die Co-Expression des GPCR mit dem Thy1.1 und erleichtert so die Identifizierung transduzierter Zellen durch Durchflusszytometrie oder die Reinigung und Isolierung durch magnetische Beads. Dies ist besonders nützlich, wenn keine für den GPCR spezifischen Antikörper verfügbar sind, wie es bei schlecht untersuchten GPCRs oft der Fall ist.
2. Beschaffung des MSCV-Plasmids in bakterieller Form und Kultur durch Inokulation von Luria-Bertani (LB)-Brühe, die mit einer geeigneten Antibiotikaauswahl auf der Grundlage des vom Plasmid kodierten Resistenzgens (z. B. Ampicillin, Kanamycin oder Chloramphenicol) ergänzt wurde. Das LB-Medium besteht aus Trypton (10 g/L), Hefeextrakt (5 g/L) und NaCl (10 g/L), wird auf pH 7,0 eingestellt und durch Autoklavieren sterilisiert. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 °C in einem Schüttelinkubator (220 U/min) über Nacht.
3. Bereiten Sie Plasmidstämme mit molekularbiologischen Standardtechniken unter Verwendung eines DNA-Präparationskits vor.
4. Nach der DNA-Isolierung ist die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer zu messen und Arbeitsplasmidlösungen mit einer Konzentration von 1 μg/μl herzustellen. Lagern Sie die Plasmide bei -20 °C für die zukünftige Verwendung.

2. Etablierung der Verpackung von Zelllinienkulturen

HINWEIS: Wir haben Platinum E (Plat-E) Zellen von Cell Biolabs verwendet. Plat-E-Zellen sind eine 293T-basierte Zelllinie mit einem EF1α-Promotor, der eine stabile und ertragreiche Expression von retroviralen Strukturproteinen (gag-, pol- und env-Gene) ermöglicht und so eine retrovirale Verpackung mit einer einzigen Plasmidtransfektion^{ermöglicht 8}. Obwohl andere Zelllinien wie NIH-3T3 oder 293T verwendet werden könnten, haben wir diese Alternativen nicht getestet.

1. Bereiten Sie Plat-E-Zellmedien durch Zugabe von DMEM, 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin, Blasticidin (10 μg/ml) und Puromycin (1 μg/ml) vor. Verwenden Sie Blasticidin und Puromycin zur Zellerhaltung, lassen Sie sie jedoch während und nach der Transfektion weg.
2. Platten-Plat-E-Zellen werden gefroren in 1,0 ml geliefert, zu >3 x 10⁶ Zellen/ml in DMEM, 20 % FBS und 10 % DMSO. Tauen Sie sie schnell in einem 37 °C warmen Wasserbad auf. Übertragen Sie alle aufgetauten Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit Plat-E-Kulturmedium.
3. Zentrifugieren Sie bei 450 x g für 5 min bei 4 °C. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 mL Plat-E-Medium, indem Sie es vorsichtig pipettieren, um eine Einzelzellsuspension herzustellen.
4. Geben Sie 9 ml Plat-E-Medium in eine 10-cm-Kulturschale und geben Sie dann die 1 ml der resuspendierten Zellen in die Schale. Bestätigen Sie, dass die aufgetauten Zellen lebensfähig sind, indem Sie ein gleiches Volumen Zellsuspension und Trypanblau mischen und die lebensfähigen (ungefärbten) und toten (blau gefärbten) Zellen mit einem Hämozytometer oder Zellzähler zählen, um eine Lebensfähigkeit von >70 % zu erreichen.
5. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂. Wechseln Sie das Medium in den ersten 3 Tagen nicht. Es ist normal, schwimmende und tote Zellen beim ersten Auftauen zu beobachten.
6. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 85 % bis 90 % erreichen, waschen Sie sie mit DMEM/PBS Ca-/Mg-. Trennen Sie die Zellen mit 2 mL 0,05 % Trypsin/0,5 mM EDTA und inkubieren Sie 3 Minuten lang bei 37 °C. Geben Sie 8 mL Plat-E-Medium hinzu, sammeln Sie die Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 4 °C bei 450 x g .
7. Im Oberflächenverhältnis 1:10 oder 1:5 teilen (d. h. neue Platten mit 1/10 oder 1/5 des Gesamtvolumens der ursprünglichen Schale aussäen). In einem Endvolumen von 10 mL Plat-E-Medium resuspendieren und bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ inkubieren.
8. Den Rest der Zellen aliquotieren Sie in 1 mL FBS mit 10 % DMSO und frieren Sie bei -80 °C und anschließend in flüssigem Stickstoff für den Langzeitgebrauch ein.
   HINWEIS: Behandeln Sie Zellen wie oben beschrieben, wenn sie zu fast 85 % konfluent sind. Um eine optimale Zellgesundheit zu erhalten, vermeiden Sie eine übermäßige Konfluenz und streben Sie 3-Tage-Splits mit einer Verdünnung von 1:10 an. Wenn sich das Wachstum verlangsamt, verwenden Sie ein frisches Aliquot. Die Zellleistung nimmt in der Regel mit den nachfolgenden Passagen ab. Wir empfehlen, Zellen für die Transfektion zwischen den Passagen 4 und 15 zu verwenden, um die besten Ergebnisse zu erzielen.

3. Herstellung von transduzierten Zellen

1. Tag 1: Seed Plat E Zellen
   HINWEIS: Berechnen Sie die Anzahl der erforderlichen Plat E-Zellen und -Platten. Wir verwendeten 1 ml Virusüberstand pro Vertiefung in einer 24-Well-Platte, um Zellen 2x zu transfizieren. In der Regel verwenden wir etwa zwei 10-cm-Petrischalen-transfizierte Platten mit Plate-E-Zellen pro 24-Well-Platte mit T-Zellen in Kultur.
   1. Beginnen Sie damit, 10 cm große Gewebekulturplatten mit 5 mL 50 μg/mL Poly-D-Lysin in sterilem Wasser zu beschichten. Bei Raumtemperatur 45 min inkubieren. 2x mit sterilem PBS Ca-/Mg waschen -- um sicherzustellen, dass keine Rückstände zurückbleiben.
      HINWEIS: Wir empfehlen, die Platten zu beschichten, da Plat-E-Zellen dazu neigen, sich nach der Transfektion abzulösen, was zu einer schlechten Zellleistung und einer verminderten Virustiterproduktion führt.
   2. Entfernen Sie die Plat-E-Zellen wie oben in Schritt 2.6 beschrieben und führen Sie einen Trypanblau-Ausschlussassay durch, um die Lebensfähigkeit sicherzustellen. Mischen Sie ein gleiches Volumen aus Zellsuspension und Trypanblau. Zählen Sie die lebensfähigen (ungefärbten) und toten (blau gefärbten) Zellen mit einem Hämozytometer/Zellzähler. 3 x 10⁶lebende Zellen in einer 10 cm großen Gewebekultur-Petrischale mit antibiotikafreiem Plat-E-Medium säen.
      HINWEIS: Gesäte Platten sollten am nächsten Tag eine Konfluenz von 85 % bis 90 % erreichen. Wenn dies nicht erreicht wird, sollten Sie die Verwendung eines anderen Zellaliquots in Betracht ziehen. Passen Sie die Aussaatdichte basierend auf dem Zeitpunkt der Beschichtung an. Für die abendliche Plattierung können 3,5 x 10⁶ Zellen verwendet werden.
2. Tag 2: Transfektion von Plat-E-Zellen und Beschichtung von T-Zellen mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern
   1. Ersetzen Sie das Medium auf Plat-E-Zellkulturen durch 6,5 ml reduziertes Serummedium.
   2. Bereiten Sie die Transfektionsmischung gemäß den Herstellerangaben für das Lipofectamine-Reagenz vor (Lipofectamine 2000 wurde in dieser Studie verwendet).
   3. Mischen Sie für jede Platte 45 μl Lipofectamine 2000 mit 210 μl reduziertem Serummedium in einem Röhrchen und 15 μg DNA mit 235 μl reduziertem Serummedium in einem anderen Röhrchen. Kombinieren Sie den Inhalt der Röhrchen, indem Sie 3x-4x pipettieren.
   4. Inkubieren Sie die Mischung 5-20 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit sich Lipofectamine/DNA-Komplexe bilden können, und geben Sie sie dann tropfenweise auf die Platten. Die Platten 16 h bei 37 °C inkubieren.
   5. T-Zell-Aktivierungs-Wells: Beschichten Sie 24-Well-Platten mit 5 μg/ml Anti-Maus-CD28 (37,51) und 10 μg/ml Anti-Maus-CD3 (145-2c11) in 375 μl/Well-PBS über Nacht bei 4 °C oder an Tag 3 bis 3 Stunden im Inkubator bei 37 °C.
      HINWEIS: Wickeln Sie die Platten in transparente Folie ein, wenn Sie über Nacht inkubieren, um eine Verdunstung zu verhindern. Der Dynabeads Mausaktivator CD3/CD28 kann als Alternative mit vergleichbaren Ergebnissen verwendet werden.
3. Tag 3: Plat-E Medien wechseln und T-Zellen isolieren und aktivieren
   1. Wechseln Sie das Transfektionsmedium von Plat-E morgens auf 14 mL DMEM-Vollmedium. Bereiten Sie T-Zell-Medien vor, indem Sie RPMI-10 hinzufügen: RPMI 1640 mit L-Glutamin, 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin, 1x MEM Nicht-essentielle Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat, 50 μM β-Mercaptoethanol und 1 mM HEPES.
   2. Euthanasieren Sie JAXBoy (CD45.1) und C57B6/J (CD45.2) Mäuse durch CO₂-Inhalation, gefolgt von einer Zervixluxation. Milz und Lymphknoten unter sterilen Bedingungen isolieren.
   3. Die Milz auf einem 100-μm-Nylonnetz-Zellsieb mit RPMI-Medium in einer 6-Well-Platte mit einem Spritzenkolben vorsichtig zerdrücken.
   4. Übertragen Sie die Lösung durch ein 40-μm-Nylonnetz-Zellsieb für eine Einzelzellsuspension in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Bei 450 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und mit PBS Ca-/Mg- waschen.
   5. Führen Sie eine magnetische Negativauswahl mit dem Maus T/T CD4-Isolationskit gemäß den Anweisungen des Herstellers durch oder sortieren Sie die Zellen alternativ mit sterilem FACS
   6. Zählen Sie die T-Zellen mit einem Zellzähler und plätieren Sie sie in den T-Zell-Aktivierungswells bei 1-1,5 x 10⁶ pro Well in 1 ml RPMI-10-Medium pro Well. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO₂ in einem befeuchteten Inkubator. Warten Sie 24-48 Stunden für die ordnungsgemäße Aktivierung, wie unter dem Mikroskop beurteilt, wie in den folgenden Hinweisen erläutert.
      HINWEIS: Durch die Vernetzung von CD3 und CD28 werden die T-Zellen in diesem Setup effektiv aktiviert. Eine Milz einer Maus ergibt typischerweise etwa 1 x 10⁸ Splenozyten. CD4+ T-Zellen machen im Allgemeinen etwa 10 % der gesamten Splenozytenpopulation aus. Daher wird geschätzt, dass für die Herstellung einer 24-Well-Platte mit 1-1,5 x 10⁶ CD4+ T-Zellen pro Well Zellen von 2-3 Mäusen ausreichend sind.
4. Tag 4: Transduktion
   1. Kontrollieren Sie die T-Zellen nach 24 h unter dem Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass sich die T-Zellen vor der Transduktion in einem strahlenden Zustand befinden (Cluster bilden und aufgrund der Aktivierung vergrößert erscheinen). Die Sprengung von T-Zellen stellt sicher, dass sie sich in einem sich teilenden Zustand befinden, der für die MSCV-Transduktion entscheidend ist⁹.
   2. Sammeln Sie ~10 mL Virusüberstand von den 10 cm Platten in einem konischen Röhrchen. Ersetzen Sie die Plat-E-Kulturplatten durch weitere 10 mL Plat-E-Medium ohne Antibiotika, um sicherzustellen, dass genügend Medien vorhanden sind, um mehr Medien für eine zweite Transduktion am nächsten Tag zu erzeugen. Passen Sie das Medienvolumen in PLAT-E-Platten basierend auf der Anzahl der T-Zell-Wells an, die am nächsten Tag transfiziert werden müssen.
      HINWEIS: Die 2-fache Übertragung verbessert den Wirkungsgrad erheblich.
   3. Filtrieren Sie den Virusüberstand durch einen 0,45-μm-Spritzenvorsatzfilter. Fügen Sie 8 μg/mL Polybren und 1:100 HEPES hinzu.
   4. Drehen Sie die 24-Well-T-Zellplatte 7 Minuten lang bei 950 x g. Sammeln Sie den Überstand vorsichtig und bewahren Sie ihn auf, ohne die Zellen zu entfernen. Dieser Überstand enthält Zytokine und andere Faktoren, die von den T-Zellen nach der Aktivierung sezerniert und nach der Infektion durch diesen Überstand ersetzt werden, um das Zytokin- und Faktorenprofil zur Unterstützung der T-Zellproliferation und des T-Zellwachstums aufrechtzuerhalten.
   5. Führen Sie eine Desinfektion durch, indem Sie 1 ml Virusüberstand in jede Vertiefung geben und 4 Stunden lang bei 32 °C bei 1.150 x g drehen. Verschließen Sie die Platten während der Desinfektion mit Plastikfolie.
   6. Ersetzen Sie das Medium nach der Desinfektion vorsichtig durch den zuvor gespeicherten T-Zell-Überstand.
5. Tag 5: Wiederholung der Transduktion
   1. Wiederholen Sie die Transfektion wie an Tag 4 beschrieben. Optional kann der in Schritt 3.4.3 gespeicherte Überstand der initial aktivierten T-Zellen im Verhältnis 1:1 mit frischem Medium gemischt werden, wenn das Medium erschöpft erscheint.
6. Tag 6: Zellen waschen und erweitern
   1. Waschen Sie die Zellen mit PBS Ca+/Mg+. und übertragen Sie sie auf eine neue Kulturplatte mit 130 U/ml Maus-IL2 und 10 ng/ml Maus-IL7. Inkubieren Sie die Zellen mindestens 2 Tage lang oder bis sie das gewünschte Expansionsniveau erreichen, basierend auf der Anzahl der für die Injektion benötigten Zellen.
7. Tag 8: Ernte und Reinigung
   1. Ernten Sie Zellen und reinigen Sie sie mit einem histopaken Dichtegradienten von 1,077.
      HINWEIS: Diese Technik hilft, lebensfähige Zellen (wie Lymphozyten oder andere Immunzellen) aus toten Zellen oder Ablagerungen zu isolieren. Tote Zellen, die eine höhere Dichte aufweisen, setzen sich am Boden des Röhrchens ab, während lebensfähige Zellen in der Regel in der Grenzschicht verbleiben.
   2. Geben Sie 5 mL Histopaque 1.077 in ein 15 mL Röhrchen. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 450 x g für 5 min bei 4 °C, um die Zellen zu pelletieren.
   3. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 mL PBS Ca+/Mg+. Schichten Sie die Zellsuspension vorsichtig auf 5 mL Histopaque 1.077 im Zentrifugenröhrchen.
   4. Zentrifugieren Sie bei 400-500 x g für 20 Minuten bei Raumtemperatur und stellen Sie sicher, dass die Unterbrechung/Beschleunigung der Zentrifuge auf Null eingestellt ist.
   5. Nach der Zentrifugation trennen sich die Zellen je nach Dichte in unterschiedliche Schichten. Die gewünschten Zellen befinden sich in der Regel an der Grenzschicht zwischen dem Histopaken und dem oberen Medium, während sich tote Zellen am unteren Rand absetzen. Entnehmen Sie die Zellschicht vorsichtig mit einer Pipette an der Grenzschicht, um eine Kontamination mit anderen Schichten zu vermeiden. Die gesammelten Zellen sind nun bereit und sauber für die Injektion.
   6. Beurteilen Sie die Transduktionseffizienz durch Durchführung von Thy1.1-Färbung und Durchflusszytometrie-Analyse. Siehe die Gating-Strategie in Abbildung 1.
      HINWEIS: Nach der Transduktion können Zellen in Chemotaxis-Assays verwendet werden, um ihre Migration zu spezifischen Chemokinen im Vergleich zu Kontrollvektorzellen zu beurteilen und ihre Aktivität in vitro funktionell zu bestätigen, bevor mit der Injektion fortgefahren wird.
8. Langzeit-In-vivo-Lokalisierungsassay
   1. Verwenden Sie für die Langzeithoming CD45.1 für den interessierenden Maus-GPCR und CD45.2 für leere Vektorzellen (oder umgekehrt), die transduziert wurden. Mischen Sie die beiden Zellpopulationen im Verhältnis 1:1.
   2. Injizieren Sie intravenös 20-30 x 10 insgesamt⁶ Zellen für jede Rag1-/- adulte Empfängermaus für 1 Woche Tropismus und 5 x 10⁶ für einen 7-wöchigen Tropismus. Wir verwenden lymphozytendefiziente Rag1-/- Empfänger, um die Konkurrenz mit endogenen T-Zellen zu reduzieren.
   3. Nach 1 bis 7 Wochen (je nach Studie) injizieren Sie den Mäusen 5 Minuten vor der Entnahme intravenös (i.v.) Anti-CD45-Antikörper, um die im Blut übertragenen Zellen zu markieren.
   4. Euthanasieren Sie die Mäuse durch CO₂ -Inhalation, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation.
      HINWEIS: Es wurden Studien von 1 Woche und 7 Wochen durchgeführt; Längere Studien könnten möglich sein, müssen aber noch getestet werden.
   5. Entnahme von Zellen aus verschiedenen Organen von Interesse und Kontrollen. Verdauen Sie das Gewebe gemäß den Standardprotokollen zur Lymphozytenvorbereitung für jedes Organ^10,11.
   6. Färben Sie die gesammelten Zellen mit monoklonalen Antikörpern (mAbs) für die durchflusszytometrische Analyse.
9. Kurzfristiges kompetitives Homing: T-Zell-Positionierung und Bildgebung
   1. Wir empfehlen, C57B6/J-Mäuse als Spender zu verwenden, da wir die Zellen fluoreszenz markieren werden. Für sehr kurze Homing-Assays von bis zu einigen Stunden kann jedoch jeder Stamm verwendet werden.
   2. Isolieren Sie am 8. Tag der Kultur transduzierte (Thy1.1+) Zellen magnetisch mit CD90.1-Mikrokügelchen gemäß den Anweisungen des Herstellers¹².
   3. Halten Sie nur transduzierte Zellen (>95% Reinheit) nach diesem Zeitpunkt 2 Tage lang unter IL2 und IL7 in Kultur, wie oben angegeben, und lassen Sie sie expandieren. Die Mikrokügelchen sind biologisch abbaubar und beeinträchtigen nach 48 h die normale Zellfunktion nicht.
   4. An Tag 11 markieren Sie die Zellen, die den interessierenden GPCR exprimieren, mit Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE ist ein Färbefarbstoff für fluoreszierende Zelle). Verwenden Sie für Stuffer-Zellen einen gelben Fluoreszenzfarbstoff oder umgekehrt. Sie können auf Wunsch alternative Farbstoffe verwenden.
      1. Bereiten Sie eine Zellsuspension in einer Konzentration von 1 x 10⁶ Zellen/ml in RPMI mit 2 % FBS vor. Inkubieren Sie die Zellen mit dem Farbstoff bei einer Endkonzentration von 5 μM bei 37 °C in einem Wasserbad unter sanftem Rühren für 20 min. Um vergleichbare Ergebnisse zu gewährleisten, wechseln Sie die Farbstoffzuordnungen in separaten Experimenten ab. Alternativ können Sie einen einzigen Farbstoff verwenden, um einen gemeinsamen Zelltyp als internen Standard zu markieren, einschließlich Versuchs- und Kontrollzellen bei verschiedenen Empfängern.
      2. Waschen Sie die markierten Zellen und mischen Sie sie im Verhältnis 1:1. Schätzen Sie die Zellkonzentration mit einem Zellzähler. Injizieren Sie 15-30 x 10⁶ Zellen intravenös in Empfängermäuse (WT oder transgene Empfängermäuse, je nach Zweck des Experiments).
   5. Etwa 10-12 Stunden später injizieren Sie den Mäusen Anti-CD31-Antikörper (z. B. DyLight 633 markiert, Klon 390), was 10-15 Minuten vor der Tötung sein sollte, um Blutgefäße abzugrenzen und intravaskuläre von extravasierten Zellen zu unterscheiden.
   6. Euthanasieren Sie die Mäuse durch CO₂ -Inhalation, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation. Analysieren Sie die Zelllokalisierung mittels FACS von Zellsuspensionen, wie in Schritt 3.8 oben beschrieben, oder durch Bildgebung ganzer Gewebehalterungen wie in Schritt 3.9.8 oder Schritt 3.9.7 für Organe von Interesse mittels konfokaler Mikroskopie.
   7. Bereiten Sie für dünne Organe wie Luftröhre, Gebärmutterhorn oder Lymphknoten Kürbishalterungen vor. Legen Sie das Taschentuch auf einen Objektträger mit doppelseitigem Klebeband an den Seiten, fügen Sie ein paar Tropfen Fluoromount-G-Montagelösung hinzu, decken Sie es mit einem Deckglas ab und drücken Sie vorsichtig und gleichmäßig, um das Deckglas mit einem separaten Objektträger oder einem anderen flachen Gegenstand am Klebeband zu befestigen.
   8. Bei Schnellschnitten betten Sie das Gewebe in die Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) ein. Bei der Lunge vor dem Einbetten mit 50 % OCT/PBS perfundieren.
   9. Verwenden Sie die Durchflusszytometrie für Kontrollorgane wie periphere Lymphknoten (PLN), Milz oder Blut, um die Transduktionseffizienz (% Thy1,1+) zu beurteilen, wie in Abbildung 1 gezeigt, und um die Ergebnisse zu normalisieren. Visualisieren Sie PLN mit Quetschhalterungen oder -schnitten mit konfokaler Mikroskopie. Zählen Sie Zellen mit konfokaler Mikroskopie mit der Imaris-Software.
   10. Bestimmen Sie das Verhältnis von GPCR-transduzierten Zellen zu Kontrollzellen (Stuffer-transduzierten) Zellen in ganzen Organen oder spezifischen Organkompartimenten. Normalisieren Sie auf die durch FACS ermittelten Input-Verhältnisse und/oder auf das Verhältnis, das von Kontrollorganen gewonnen wurde, bei denen der GPCR bekannt ist oder von dem angenommen wird, dass er irrelevant ist.
   11. Zur Analyse der Mikroumgebungslokalisation in der Lunge messen Sie mit der Imaris-Software den Abstand von Zellen zu histologischen Orientierungspunkten (z. B. bronchiale Basalmembranen oder Venen).

Ergebnisse

In dieser Studie stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, um die Fähigkeit spezifischer Rezeptoren zu untersuchen, die T-Zell-Lokalisierung in vivo zu steuern. Als Demonstration dieses Protokolls haben wir GPR25¹³ verwendet. Mit diesem Protokoll sind wir in der Lage, eine Transduktionseffizienz von 30 % bis 40 % zu erreichen, wie durch Thy1.1-Färbung mittels Durchflusszytometrie beurteilt wird. Wir führten in vitro Transwell-basierte Chemotaxis-Ass...

Diskussion

Der in dieser Studie beschriebene intern kontrollierte Homing-Assay ist eine umfassende Methode zur Untersuchung des GPCR-vermittelten T-Zelltransports und der Positionierung in verschiedenen Organen und Gewebemikroumgebungen. Dieser Ansatz integriert mehrere kritische Optimierungen, um die Reproduzierbarkeit, Genauigkeit und Effizienz zu verbessern.

Ein kritischer Aspekt dieses Protokolls ist die effiziente Transduktion von T-Zellen unter Verwendung von retro...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AF647 anti mouse CD90.1-Thy1.1 (OX-7)	Biolegend	202507
anti-CD31 (DyLight 633, clone 390)	InvivoMab	BE0377
anti-mouse CD28 37.51	eBiosciences
anti-mouse CD3 145-2c11	eBiosciences
APCCy7 anti mouse CD3 (145-2c11)	Biolegend	100329
BV421 anti mouse CD8b (Ly-3)	Biolegend	126629
BV711 anti mouse CD4 (RM4-5)	Biolegend	100549
CD90.1 microbeads	Miltenyi	130-121-273
CFSE	Thermoscientific	C34554
FITC anti mouse CD45.2 (104)	BD	AB_395041
mouse IL2	Peprotech	200-02-50UG
mouse IL7	Peprotech	217-17-10UG
Mouse T CD4 isolation kit	STEMCELL technologies	18000
MSCV-IRES- Thy1.1 GPR25	Vectorbuilder
MSCV-IRES- Thy1.1 Stuffer	Vectorbuilder
PE-CD45 (30-F11) antibody	Biolegend	103105
PECy7 anti mouse TCRb (H57-597)	Tonbo
PercpCy5.5 anti mouse CD45.1 (A20)	eBiosciences
Platinum-E (Plat-E)	cell Biolabs. Inc	RV-101
Yellow fluorescent dye	Thermoscientific