Trasduzione retrovirale efficiente e homing competitivo per lo studio della localizzazione delle cellule T mediata da GPCR in diversi microambienti tissutali

Riepilogo

Presentiamo protocolli migliorati per la trasduzione retrovirale dei recettori del traffico e l'homing competitivo per studiare il posizionamento dei linfociti specifici per organo e microambiente mediati dal recettore. Questo metodo offre preziose informazioni sui meccanismi di traffico delle cellule immunitarie e ha potenziali applicazioni nella futura ricerca di base e terapeutica.

Abstract

Comprendere in che modo l'espressione del recettore accoppiato alla proteina G (GPCR) influenzi il posizionamento delle cellule all'interno di diversi microambienti tissutali è essenziale per chiarire i meccanismi di traffico delle cellule immunitarie. Presentiamo un saggio di homing competitivo progettato per studiare la localizzazione delle cellule T mediata da GPCR negli organi che esprimono i loro ligandi chemioattrattivi affini, applicabile sia per studi a breve che a lungo termine. L'approccio prevede un protocollo migliorato per la trasduzione ricombinante del virus delle cellule staminali murine (MSCV) delle cellule T per esprimere il GPCR di interesse o un costrutto di controllo, seguito da un homing competitivo nei topi riceventi. La distribuzione cellulare tra i diversi organi viene analizzata utilizzando la citometria a flusso e/o la microscopia confocale. In esperimenti a breve termine (10-12 ore), la microscopia confocale ha rivelato distinti modelli di localizzazione cellulare, inclusi alveoli, sottomucosa dei bronchi, siti venosi e interstizio nel polmone, nonché l'epitelio che riveste la trachea, lo stomaco e il corno uterino. Negli studi a lungo termine (1-7 settimane), la citometria a flusso ha fornito informazioni sull'accumulo preferenziale di cellule, rivelando cambiamenti dinamici e potenziale maturazione o riposizionamento all'interno dei tessuti nel tempo. Questo saggio di homing competitivo è uno strumento robusto per lo studio del posizionamento cellulare mediato da GPCR, che offre preziose informazioni sulla distribuzione tessuto-specifica e sulle potenziali applicazioni in immunologia e ricerca terapeutica.

Introduzione

I recettori accoppiati a proteine G (GPCR) sono fondamentali nella regolazione di una varietà di processi cellulari, tra cui la trasduzione del segnale, la neurotrasmissione, la regolazione ormonale^{e la migrazione} delle cellule immunitarie. Svolgono un ruolo cruciale nel controllo spazio-temporale della migrazione e della localizzazione dei linfociti². Durante la fase di priming delle risposte immunitarie, il microambiente locale e le interazioni cellulari spingono i linfociti T a esprimere un insieme unico di molecole di adesione e recettori per chemochine noti come recettori di homing. Questo adattamento consente alle cellule T con esperienza antigenica di interagire con le cellule endoteliali (EC) organo-specifiche e di migrare verso tessuti bersaglio distinti. La capacità delle cellule T di acquisire il trofismo tissutale è vitale per risposte di richiamo efficaci, in particolare nel contesto di infezioni ricorrenti che colpiscono lo stesso organo ^3,4.

I GPCR guidano le cellule immunitarie verso tessuti e organi specifici in cui svolgono funzioni critiche, come dirigere le cellule T e NK CD8+ verso i siti tumorali per l'azione citotossica o aiutare le cellule T CD4+ a orchestrare le risposte immunitarie supportando l'attivazione di altre cellule immunitarie. Comprendere in che modo i GPCR dirigono le cellule T verso le loro posizioni precise è essenziale per far progredire le immunoterapie mirate ^5,6. La sfida, tuttavia, risiede nella modellazione di queste complesse interazioni in vitro, poiché è difficile replicare contemporaneamente sia i segnali spazialmente limitati che i segnali chemiotattici direzionali.

Chiarire i ruoli di specifici recettori leucocitari è spesso difficile anche a causa della loro limitata frequenza di espressione nelle popolazioni endogene e del fatto che questi recettori in genere decorano tipi cellulari distinti. Questa complessità rende difficile isolare il ruolo di un recettore specifico da altri meccanismi specifici di un sottoinsieme cellulare. Idealmente, i metodi dovrebbero confrontare popolazioni simili, differendo solo nel recettore di interesse per fornire intuizioni chiare.

Per superare queste sfide, abbiamo adottato un saggio di homing competitivo che impiega la trasduzione retrovirale ricombinante di MSCV per un'efficiente espressione di GPCR nelle cellule T. I vettori retrovirali MSCV, che combinano elementi dei vettori MESV basati sul virus del sarcoma mieloproliferativo (PCMV) e dei vettori LN basati sul virus della leucemia murina di Moloney (MMLV), incorporano un segnale di imballaggio ibrido esteso derivato dai vettori LN⁷. Questa modifica migliora l'efficienza della consegna genica, consentendo studi sia a breve che a lungo termine sulla localizzazione delle cellule T in vivo. Utilizzando particelle retrovirali ad alto titolo e microscopia confocale, l'approccio consente una visualizzazione precisa del posizionamento e delle interazioni delle cellule T all'interno di ambienti tissutali complessi. Presentiamo protocolli dettagliati per la trasduzione retrovirale dei recettori di traffico e l'esecuzione di saggi di homing controllati internamente (cosiddetti competitivi) per studiare il posizionamento dei linfociti specifici per organi e microambienti mediati da recettori. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire preziose informazioni sui meccanismi di traffico delle cellule immunitarie e di consentire future applicazioni sia nella ricerca di base che nello sviluppo terapeutico.

Protocollo

Tutti i topi in questo studio sono stati mantenuti in strutture specifiche prive di agenti patogeni (SPF) presso il Veterans Affairs Palo Alto Health Care System (VAPAHCS). I topi B6/SJL Prprc Pep3BoyJ (CD45.1), C57B6/J (CD45.2) e Rag1-/- sono stati acquistati dai Jackson Laboratories. Sebbene sia stato utilizzato PepBoy per ottenere le cellule CD45.1, si consiglia di utilizzare JAXBoy (C57BL/6J-Ptprc^em6Lutzy/J). JAXBoy è una varietà completamente coisogenica generata attraverso CRISPR invece del tradizionale reincrocio, il che migliora la coerenza genetica. Storicamente, gli studi marcati con l'allotipo CD45 utilizzando topi PepBoy (CD45.1), che non sono completamente congeniti, hanno incluso saggi di homing e ricircolo di controllo con confronti wild-type (WT/WT) per affrontare la potenziale variabilità. Con i mouse JAXBoy ora disponibili come alternativa completamente isogenica, questi controlli aggiuntivi potrebbero non essere più necessari. I ricercatori dovrebbero ancora considerare che le differenze tra le varianti CD45.1 e CD45.2 – come il loro ruolo come proteina tirosina fosfatasi – possono influenzare il comportamento cellulare e i modelli di homing. Tutti i protocolli discussi nel testo e di seguito sono stati approvati o soddisfano le linee guida del Dipartimento accreditato di Medicina degli Animali da Laboratorio e del Gruppo Amministrativo sulla Cura degli Animali da Laboratorio presso il VA Palo Alto Health Care System (VAPAHCS). Gli animali venivano sacrificati secondo procedure approvate. Topi di entrambi i sessi, di età compresa tra 8 e 12 settimane, sono stati inclusi negli esperimenti.

1. Preparazione del vettore MSCV

1. Acquista il vettore retrovirale MSCV-IRES-Thy1.1 con la regione codificante del gene di interesse del topo (GOI) o un ORF_Stuffer (controllo ORF negativo)
   NOTA: Questo costrutto include il marcatore di superficie Thy1.1 insieme al gene GPCR di interesse. Il linker IRES (Internal Ribosome Entry Site) consente la co-espressione del GPCR con il Thy1.1, facilitando l'identificazione delle cellule trasdotte mediante citometria a flusso o purificazione e isolamento mediante biglie magnetiche. Ciò è particolarmente utile quando gli anticorpi specifici per i GPCR non sono disponibili, come spesso accade con i GPCR poco studiati.
2. Procurarsi il plasmide MSCV in forma batterica e coltura inoculando brodo di Luria-Bertani (LB) integrato con un'appropriata selezione di antibiotici basata sul gene di resistenza codificato dal plasmide (ad esempio, ampicillina, kanamicina o cloramfenicolo). Il terreno LB è costituito da triptone (10 g/L), estratto di lievito (5 g/L) e NaCl (10 g/L), regolati a pH 7,0 e sterilizzati in autoclave. Incubare la coltura a 37 °C in un'incubatrice vibrante (220 giri/min) per una notte.
3. Preparare stock di plasmidi utilizzando tecniche standard di biologia molecolare utilizzando un kit di preparazione del DNA.
4. Dopo l'isolamento del DNA, misurare la concentrazione di DNA con uno spettrofotometro e preparare soluzioni plasmidiche funzionanti a una concentrazione di 1 μg/μL. Conservare i plasmidi a -20 °C per un uso futuro.

2. Stabilire la coltura della linea cellulare di confezionamento

NOTA: Abbiamo utilizzato cellule di platino E (Plat-E) di Cell Biolabs. Le cellule Plat-E sono una linea cellulare a base di 293T con un promotore EF1α, che fornisce un'espressione stabile e ad alto rendimento delle proteine strutturali retrovirali (geni gag, pol ed env), consentendo l'impacchettamento retrovirale con una singola trasfezione plasmidica⁸. Sebbene possano essere utilizzate altre linee cellulari, come NIH-3T3 o 293T, non abbiamo testato queste alternative.

1. Preparare i terreni cellulari Plat-E aggiungendo DMEM, 10% FBS, 1% penicillina/streptomicina, blasticidina (10 μg/mL) e puromicina (1 μg/mL). Utilizzare la blasticidina e la puromicina per il mantenimento delle cellule, ma ometterle durante e dopo la trasfezione.
2. Le cellule Plat-E su piastra vengono spedite congelate in 1,0 mL, a >3 x 10⁶ cellule/mL in DMEM, 20% FBS e 10% DMSO. Scongelarli rapidamente a bagnomaria a 37 °C. Trasferire tutte le cellule scongelate in una provetta conica da 15 mL contenente terreno di coltura Plat-E.
3. Centrifugare a 450 x g per 5 min a 4 °C. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno Plat-E mediante pipettaggio delicato per creare una sospensione a cellula singola.
4. Aggiungere 9 mL di terreno Plat-E a una piastra di coltura da 10 cm, quindi trasferire 1 mL di cellule risospese nella piastra. Confermare che le cellule scongelate sono vitali mescolando un volume uguale di sospensione cellulare e blu di tripano e contando le cellule vitali (non colorate) e morte (colorate in blu) utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule, con l'obiettivo di ottenere una vitalità del >70%.
5. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato con CO₂ al 5%. Non cambiare il mezzo per i primi 3 giorni; È normale osservare cellule galleggianti e morte al primo disgelo.
6. Quando le cellule raggiungono l'85%-90% di confluenza, lavare con DMEM/PBS Ca-/Mg-. Staccare le cellule utilizzando 2 mL di tripsina allo 0,05%/0,5 mM EDTA e incubare per 3 minuti a 37 °C. Aggiungere 8 mL di terreno Plat-E, raccogliere le cellule in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 450 x g per 5 min a 4 °C.
7. Dividere con un rapporto di superficie 1:10 o 1:5 (ad esempio, seminare nuove piastre con 1/10 o 1/5 del volume totale della piastra originale). Risospendere in un volume finale di 10 mL di terreno Plat-E e incubare a 37 °C in un incubatore umidificato con CO₂ al 5%.
8. Aliquotare il resto delle cellule in 1 mL di FBS con DMSO al 10% e congelare a -80 °C e successivamente in azoto liquido per un uso a lungo termine.
   NOTA: Trattare le cellule come descritto sopra quando sono vicine all'85% confluenti. Per mantenere una salute ottimale delle cellule, evitare l'eccessiva confluenza e puntare a divisioni di 3 giorni con diluizione 1:10. Se la crescita rallenta, utilizzare un'aliquota fresca. Le prestazioni delle celle in genere diminuiscono con i passaggi successivi. Si consiglia di utilizzare le celle per la trasfezione tra i passaggi 4 e 15 per ottenere i migliori risultati.

3. Produzione di cellule trasdotte

1. Giorno 1: Cellule E Seed Plat
   NOTA: Calcolare il numero di celle e piastre Plat E necessarie. Abbiamo utilizzato 1 mL di surnatante virale per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti per trasfettare le cellule 2 volte. Di solito utilizziamo circa due piastre trasfettate con piastra di Petri da 10 cm con cellule E per piastra da 24 pozzetti con cellule T in coltura.
   1. Iniziare rivestendo piastre di coltura tissutale da 10 cm con 5 mL di poli-D-lisina da 50 μg/mL in acqua sterile. Incubare a temperatura ambiente per 45 min. Lavare 2 volte con PBS Ca-/Mg sterile, per assicurarsi che non rimangano residui.
      NOTA: Si consiglia di rivestire le piastre poiché le cellule Plat-E tendono a staccarsi dopo la trasfezione, portando a scarse prestazioni cellulari e a una ridotta produzione di titoli virali.
   2. Staccare le cellule Plat-E come descritto sopra al punto 2.6 ed eseguire un saggio di esclusione del blu di tripano per garantire la vitalità. Mescolare un volume uguale di sospensione cellulare e Trypan Blue. Contare le cellule vitali (non colorate) e morte (colorate in blu) utilizzando un emocitometro/contatore di cellule. Seminare 3 cellule vive da 10′ in una piastra Petri per colture tissutali da 10 cm con terreno Plat-E privo di antibiotici.
      NOTA: Le piastre seminate dovrebbero raggiungere l'85%-90% di confluenza il giorno successivo. Se ciò non viene raggiunto, prendere in considerazione l'utilizzo di un'aliquota di cella diversa. Regolare la densità di semina in base ai tempi di placcatura; Per la placcatura serale, possono essere utilizzate 3,5 x 10⁶ celle.
2. Giorno 2: Trasfezione di cellule Plat-E e piastre di rivestimento per cellule T con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28
   1. Sostituire il terreno su colture cellulari Plat-E con 6,5 mL di terreno di sieroterapia ridotto.
   2. Preparare la miscela di trasfezione secondo le istruzioni del produttore per il reagente Lipofectamine (in questo studio è stato utilizzato Lipofectamine 2000).
   3. Per ogni piastra, mescolare 45 μl di Lipofectamine 2000 con 210 μl di terreno sierico ridotto in una provetta e 15 μg di DNA con 235 μl di terreno sierico ridotto in un'altra provetta. Combinare il contenuto delle provette pipettando 3x-4x.
   4. Incubare la miscela per 5-20 minuti a temperatura ambiente per consentire la formazione di complessi lipofectamina/DNA, quindi aggiungere goccia a goccia alle piastre. Incubare le piastre per 16 ore a 37 °C.
   5. Pozzetti di attivazione delle cellule T: rivestire piastre a 24 pozzetti con 5 μg/mL di CD28 anti-topo (37,51) e 10 μg/mL di CD3 anti-topo (145-2c11) in PBS da 375 μL/pozzetto durante la notte a 4 °C o per 3-4 ore nell'incubatore a 37 °C il giorno 3.
      NOTA: Avvolgere le piastre in una pellicola trasparente se incubate durante la notte per evitare l'evaporazione. L'attivatore per topi Dynabeads CD3/CD28 può essere utilizzato in alternativa con risultati comparabili.
3. Giorno 3: Cambiare il terreno Plat-E e isolare e attivare le cellule T
   1. Sostituire il terreno di trasfezione Plat-E con 14 mL di terreno completo DMEM al mattino. Preparare i terreni di coltura delle cellule T aggiungendo RPMI-10: RPMI 1640 con L-glutammina, 10% FBS, 1% Penicillina/Streptomicina, 1x MEM Aminoacidi non essenziali, 1 mM di piruvato di sodio, 50 μM di β-mercaptoetanolo e 1 mM di HEPES.
   2. Eutanasia dei topi JAXBoy (CD45.1) e C57B6/J (CD45.2) utilizzando l'inalazione di CO₂seguita da lussazione cervicale. Isolare milze e linfonodi in condizioni sterili.
   3. Schiacciare delicatamente la milza su un filtro cellulare a rete di nylon da 100 μm con terreno RPMI in una piastra a 6 pozzetti utilizzando uno stantuffo a siringa.
   4. Trasferire la soluzione attraverso un filtro cellulare a rete di nylon da 40 μm per una sospensione a cellula singola in una provetta conica da 50 mL. Centrifugare a 450 x g per 5 min a 4 °C e lavarli con PBS Ca-/Mg-.
   5. Eseguire la selezione del negativo magnetico utilizzando il kit di isolamento Mouse T/T CD4 seguendo le istruzioni del produttore o, in alternativa, ordinare le cellule utilizzando FACS sterile
   6. Contare le cellule T utilizzando un contatore di cellule e piastrle nei pozzetti di attivazione delle cellule T a 1-1,5 x 10⁶ per pozzetto in 1 mL di terreno RPMI-10 per pozzetto. Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO₂ in un incubatore umidificato. Attendere 24-48 ore per una corretta attivazione, come valutato al microscopio, come spiegato nelle note seguenti.
      NOTA: La reticolazione di CD3 e CD28 attiva efficacemente le cellule T in questa configurazione. Una milza di topo produce tipicamente circa 1 x 10⁸ splenociti. Le cellule T CD4+ costituiscono generalmente circa il 10% della popolazione totale di splenociti. Pertanto, per preparare una piastra a 24 pozzetti con 1-1,5 x 10⁶ cellule T CD4+ per pozzetto, si stima che saranno sufficienti cellule di 2-3 topi.
4. Giorno 4: Trasduzione
   1. Controllare le cellule T dopo 24 ore al microscopio. Assicurarsi che le cellule T siano in uno stato esplosivo (formando cluster e apparendo ingrandite a causa dell'attivazione) prima della trasduzione. L'esplosione delle cellule T assicura che siano in uno stato di divisione, che è fondamentale per la trasduzione di MSCV⁹.
   2. Raccogliere ~10 mL di surnatante virale dalle piastre da 10 cm in una provetta conica. Sostituire le piastre di coltura Plat-E con altri 10 mL di terreno Plat-E senza antibiotici per garantire un terreno sufficiente a generare più terreno per una seconda trasduzione il giorno successivo. Regolare il volume dei terreni nelle piastre PLAT-E in base al numero di pozzetti delle cellule T che devono essere trasfettati il giorno successivo.
      NOTA: La trasduzione di 2x migliora significativamente l'efficienza.
   3. Filtrare il surnatante virale facendolo passare attraverso un filtro a siringa da 0,45 μm. Aggiungere 8 μg/mL di polibrene e HEPES 1:100.
   4. Centrifugare la piastra di celle T a 24 pozzetti per 7 minuti a 950 x g. Raccogliere e conservare con cura il surnatante senza spostare le cellule. Questo surnatante contiene citochine e altri fattori secreti dalle cellule T dopo l'attivazione e sostituiti con questo surnatante dopo la frattura per mantenere il profilo delle citochine e dei fattori per supportare la proliferazione e la crescita delle cellule T.
   5. Eseguire la sterilizzazione aggiungendo 1 mL di surnatante virale a ciascun pozzetto e centrifugando a 1.150 x g per 4 ore a 32 °C. Sigillare le piastre con pellicola trasparente durante la sterilizzazione.
   6. Dopo la sterilizzazione, sostituire con cura il terreno con il surnatante delle cellule T precedentemente salvato.
5. Giorno 5: Ripetere la trasduzione
   1. Ripetere la trasfezione come descritto il giorno 4. Facoltativamente, se il terreno appare esaurito, mescolare il surnatante salvato nel passaggio 3.4.3 delle cellule T attivate inizialmente con terreni freschi in un rapporto 1:1.
6. Giorno 6: Lavare le celle ed espandere
   1. Lavare le celle con PBS Ca+/Mg+. e trasferirli in una nuova piastra di coltura con 130 U/mL di IL2 di topo e 10 ng/mL di IL7 di topo. Incubare le cellule per almeno 2 giorni o fino a quando non raggiungono il livello di espansione desiderato, in base al numero di cellule necessarie per l'iniezione.
7. Giorno 8: Raccolta e purificazione
   1. Raccogli le cellule e purificale con un gradiente di densità Histopaque 1.077.
      NOTA: Questa tecnica aiuta a isolare le cellule vitali (come i linfociti o altre cellule immunitarie) dalle cellule morte o dai detriti. Le cellule morte, che hanno una densità più elevata, si depositano sul fondo del tubo, mentre le cellule vitali in genere rimangono nello strato di interfaccia.
   2. Aggiungere 5 mL di Histopaque 1.077 a una provetta da 15 mL. Raccogliere le celle centrifugando a 450 x g per 5 minuti a 4 °C per pellettare le cellule.
   3. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di PBS Ca+/Mg+. Sovrapporre accuratamente la sospensione cellulare sopra 5 mL di Histopaque 1.077 nella provetta da centrifuga.
   4. Centrifugare a 400-500 x g per 20 minuti a temperatura ambiente, assicurandosi che la rottura/accelerazione della centrifuga sia impostata a zero.
   5. Dopo la centrifugazione, le cellule si separeranno in strati distinti in base alla densità. Le celle desiderate si troveranno tipicamente allo strato di interfaccia tra l'istopaco e il mezzo superiore, mentre le celle morte si depositeranno sul fondo. Raccogliere con cura lo strato di cellule allo strato di interfaccia utilizzando una pipetta, evitando la contaminazione con altri strati. Le cellule raccolte sono ora pronte e pulite per le iniezioni.
   6. Valutare l'efficienza della trasduzione eseguendo la colorazione Thy1.1 e l'analisi della citometria a flusso. Vedere la strategia di gating nella Figura 1.
      NOTA: Dopo la trasduzione, le cellule possono essere utilizzate nei saggi di chemiotassi per valutare la loro migrazione verso chemochine specifiche rispetto alle cellule vettoriali di controllo per confermare funzionalmente la loro attività in vitro prima di procedere con le iniezioni.
8. Saggio di localizzazione in vivo a lungo termine
   1. Per l'homing a lungo termine, utilizzare CD45.1 per il GPCR di topo di interesse e CD45.2 per le cellule trasdotte a vettore vuoto (o viceversa). Mescolare le due popolazioni cellulari in un rapporto 1:1.
   2. Iniettare per via endovenosa 20-30 x 10⁶ cellule totali per ogni topo adulto ricevente Rag1-/- per 1 settimana di tropismo e 5 x 10⁶ per 7 settimane di tropismo. Utilizziamo riceventi di Rag1-/- carenti di linfociti per ridurre la competizione con le cellule T endogene.
   3. Dopo 1-7 settimane (a seconda dello studio), iniettare l'anticorpo anti-CD45 per via endovenosa (i.v.) nei topi 5 minuti prima del prelievo per marcare le cellule trasportate dal sangue.
   4. Eutanasia dei topi utilizzando l'inalazione di CO₂ seguita da lussazione cervicale.
      NOTA: Sono stati condotti studi di 1 settimana e 7 settimane; Studi più lunghi possono essere possibili, ma devono ancora essere testati.
   5. Raccogli cellule da diversi organi di interesse e controlli. Digerire i tessuti secondo i protocolli standard di preparazione dei linfociti per ogni organo^10,11.
   6. Colorare le cellule raccolte con anticorpi monoclonali (mAb) per l'analisi citofluorimetrica.
9. Homing competitivo a breve termine: posizionamento delle cellule T e imaging
   1. Si consiglia di utilizzare topi C57B6/J come donatori, dato che etichetteremo le cellule in modo fluorescente. Tuttavia, per saggi di homing molto brevi fino a poche ore, è possibile utilizzare qualsiasi ceppo.
   2. L'ottavo giorno di coltura, isolare magneticamente le cellule trasdotte (Thy1.1+) utilizzando microsfere CD90.1, secondo le istruzioni del produttore¹².
   3. Mantenere in coltura solo le cellule trasdotte (purezza >95%) dopo questo punto per 2 giorni sotto IL2 e IL7 come indicato sopra e lasciarle espandere. Le microsfere sono biodegradabili e dopo 48 ore non compromettono la normale funzione cellulare.
   4. Il giorno 11, etichettare le cellule che esprimono il GPCR di interesse con carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE è un colorante fluorescente per la colorazione cellulare). Per le celle Stuffer, utilizzare un colorante fluorescente giallo o viceversa. Se preferisci, puoi usare coloranti alternativi.
      1. Preparare una sospensione cellulare a una concentrazione di 1 x 10⁶ cellule/mL in RPMI con FBS al 2%. Incubare le cellule con il colorante a una concentrazione finale di 5 μM a 37 °C in un bagno d'acqua con leggera agitazione per 20 minuti. Per garantire risultati comparabili, alternare le assegnazioni dei coloranti in esperimenti separati. In alternativa, utilizzare un singolo colorante per etichettare un tipo di cellula comune come standard interno, includendo cellule sperimentali e di controllo in diversi destinatari.
      2. Lavare le celle marcate e mescolarle in rapporto 1:1. Stimare la concentrazione di celle utilizzando un contatore di cellule. Iniettare 15-30 x 10⁶ cellule per via endovenosa nei topi riceventi (topi riceventi WT o transgenici, a seconda dello scopo dell'esperimento).
   5. Circa 10-12 ore dopo, iniettare nei topi l'anticorpo anti-CD31 (ad esempio, marcato con DyLight 633, clone 390), che dovrebbe essere 10-15 minuti prima del sacrificio per delineare i vasi sanguigni e discriminare le cellule intravascolari da quelle stravasate.
   6. Eutanasia dei topi utilizzando l'inalazione di CO₂ seguita da lussazione cervicale. Analizzare la localizzazione cellulare mediante FACS delle sospensioni cellulari come descritto nel passaggio 3.8 sopra o mediante imaging di montature intere di tessuto come nel passaggio 3.9.8 o nel passaggio 3.9.7 per gli organi di interesse utilizzando la microscopia confocale.
   7. Per organi sottili come la trachea, il corno uterino o i linfonodi, prepara le montature da squash. Posizionare il fazzoletto su un vetrino con nastro biadesivo sui lati, aggiungere alcune gocce di soluzione di montaggio Fluoromount-G, coprire con un vetrino coprioggetti e premere delicatamente e uniformemente per fissare il vetrino coprioggetti al nastro utilizzando un vetrino separato o un altro oggetto piatto.
   8. Per le sezioni congelate, incorporare il fazzoletto nel composto della temperatura di taglio ottimale (OCT). Per i polmoni, perfondere con il 50% di OCT/PBS prima dell'inclusione.
   9. Utilizzare la citometria a flusso per organi di controllo come i linfonodi periferici (PLN), la milza o il sangue per valutare l'efficienza di trasduzione (% Thy1,1+) come mostrato nella Figura 1 e normalizzare i risultati. Visualizzazione di PLN con montature o sezioni di squash utilizzando la microscopia confocale. Conta le cellule utilizzando la microscopia confocale con il software Imaris.
   10. Determinare il rapporto tra le cellule trasdotte da GPCR e le cellule di controllo (trasdotte da Stuffer) in interi organi o compartimenti d'organo specifici. Normalizzare i rapporti di input determinati dal FACS e/o il rapporto recuperato dagli organi di controllo in cui il GPCR è noto o si presume irrilevante.
   11. Per l'analisi della localizzazione microambientale nei polmoni, misurare la distanza delle cellule dai punti di riferimento istologici (ad esempio, membrane o vene del basamento bronchiale) utilizzando il software Imaris.

Risultati

In questo studio, presentiamo un protocollo dettagliato per studiare la capacità di specifici recettori di dirigere la localizzazione delle cellule T in vivo. Come dimostrazione di questo protocollo, abbiamo utilizzato GPR25¹³. Siamo in grado di raggiungere un'efficienza di trasduzione del 30%-40% utilizzando questo protocollo, come valutato dalla colorazione Thy1.1 mediante citometria a flusso. Abbiamo eseguito saggi di chemiotassi basati su transwell in vit...

Discussione

Il saggio di homing controllato internamente descritto in questo studio è un metodo completo per esaminare il traffico e il posizionamento delle cellule T mediate da GPCR all'interno di diversi organi e microambienti tissutali. Questo approccio integra diverse ottimizzazioni critiche per migliorare la riproducibilità, l'accuratezza e l'efficienza.

Un aspetto critico di questo protocollo è l'efficiente trasduzione delle cellule T utilizzando vettori retrovir...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AF647 anti mouse CD90.1-Thy1.1 (OX-7)	Biolegend	202507
anti-CD31 (DyLight 633, clone 390)	InvivoMab	BE0377
anti-mouse CD28 37.51	eBiosciences
anti-mouse CD3 145-2c11	eBiosciences
APCCy7 anti mouse CD3 (145-2c11)	Biolegend	100329
BV421 anti mouse CD8b (Ly-3)	Biolegend	126629
BV711 anti mouse CD4 (RM4-5)	Biolegend	100549
CD90.1 microbeads	Miltenyi	130-121-273
CFSE	Thermoscientific	C34554
FITC anti mouse CD45.2 (104)	BD	AB_395041
mouse IL2	Peprotech	200-02-50UG
mouse IL7	Peprotech	217-17-10UG
Mouse T CD4 isolation kit	STEMCELL technologies	18000
MSCV-IRES- Thy1.1 GPR25	Vectorbuilder
MSCV-IRES- Thy1.1 Stuffer	Vectorbuilder
PE-CD45 (30-F11) antibody	Biolegend	103105
PECy7 anti mouse TCRb (H57-597)	Tonbo
PercpCy5.5 anti mouse CD45.1 (A20)	eBiosciences
Platinum-E (Plat-E)	cell Biolabs. Inc	RV-101
Yellow fluorescent dye	Thermoscientific