Эффективная ретровирусная трансдукция и конкурентный хоуминг для исследования GPCR-опосредованной локализации Т-клеток в различных тканевых микросредах

Резюме

Мы представляем усовершенствованные протоколы ретровирусной трансдукции рецепторов транспорта и конкурентного хоуминга для изучения рецептор-опосредованного позиционирования лимфоцитов, специфичного для органов и микроокружения. Этот метод дает ценную информацию о механизмах транспортировки иммунных клеток и имеет потенциальное применение в будущих фундаментальных и терапевтических исследованиях.

Аннотация

Понимание того, как экспрессия рецептора, сопряженного с G-белком (GPCR), влияет на позиционирование клеток в различных тканевых микроокружениях, имеет важное значение для выяснения механизмов транспортировки иммунных клеток. Мы представляем конкурентный хоуминговый анализ, предназначенный для изучения GPCR-опосредованной локализации Т-клеток в органах, экспрессирующих родственные им хемоаттрактантные лиганды, применимый как для краткосрочных, так и для долгосрочных исследований. Этот подход включает в себя усовершенствованный протокол рекомбинантной трансдукции Т-клеток вирусом мышиных стволовых клеток (MSCV) для экспрессии интересующего GPCR или контрольной конструкции с последующим конкурентным хоумингом у мышей-реципиентов. Распределение клеток по различным органам анализируется с помощью проточной цитометрии и/или конфокальной микроскопии. В краткосрочных экспериментах (10-12 ч) конфокальная микроскопия выявила различные закономерности локализации клеток, в том числе в альвеолах, подслизистых оболочках бронхов, венозных участках и интерстиции в легких, а также в эпителии, выстилающем трахею, желудок и рог матки. В долгосрочных исследованиях (1-7 недель) проточная цитометрия позволила получить представление о преимущественном накоплении клеток, выявив динамические изменения и потенциальное созревание или изменение положения в тканях с течением времени. Этот конкурентный анализ самонаведения является надежным инструментом для изучения GPCR-опосредованного позиционирования клеток, предлагая ценную информацию о тканеспецифическом распределении и потенциальном применении в иммунологии и терапевтических исследованиях.

Введение

Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR), играют основополагающую роль в регулировании различных клеточных процессов, включая передачу сигналов, нейротрансмиссию, гормональную регуляцию^{и миграцию} иммунных клеток. Они играют решающую роль в пространственно-временном контроле миграции и локализации лимфоцитов². Во время фазы прайминга иммунных реакций местное микроокружение и клеточные взаимодействия побуждают Т-лимфоциты экспрессировать уникальный набор молекул адгезии и хемокиновых рецепторов, известных как самонаводящиеся рецепторы. Эта адаптация позволяет Т-клеткам, испытывающим антигены, взаимодействовать с органоспецифическими эндотелиальными клетками (ЭК) и мигрировать в различные ткани-мишени. Способность Т-клеток приобретать тканевый тропизм жизненно важна для эффективных реакций на отзыв, особенно в контексте рецидивирующих инфекций, поражающих один и тот же орган ^3,4.

GPCR направляют иммунные клетки к определенным тканям и органам, где они выполняют критически важные функции, такие как направление CD8+ Т и NK-клеток к опухолевым участкам для цитотоксического действия или помощь CD4+ Т-клеткам в организации иммунных реакций, поддерживая активацию других иммунных клеток. Понимание того, как GPCR направляют Т-клетки к их точному местоположению, имеет важное значение для продвижения таргетной иммунотерапии ^5,6. Проблема, однако, заключается в моделировании этих сложных взаимодействий in vitro, поскольку одновременная репликация как пространственно ограниченных сигналов, так и направленных хемотаксических сигналов затруднена.

Выяснение роли специфических лейкоцитарных рецепторов также часто является сложной задачей из-за их ограниченной частоты экспрессии в эндогенных популяциях и того факта, что эти рецепторы обычно украшают различные типы клеток. Такая сложность затрудняет выделение роли специфического рецептора из других механизмов, специфичных для клеточного подмножества. В идеале методы должны сравнивать сходные популяции, отличающиеся только рецептором, представляющим интерес, чтобы обеспечить четкое понимание.

Чтобы преодолеть эти проблемы, мы приняли конкурентный хоуминг-анализ, в котором используется рекомбинантная ретровирусная трансдукция MSCV для эффективной экспрессии GPCR в Т-клетках. Ретровирусные векторы MSCV, которые сочетают в себе элементы векторов MESV на основе вируса миелопролиферативной саркомы (PCMV) и векторов LN на основе вируса мышиной лейкемии Moloney (MMLV), включают расширенный гибридный упаковочный сигнал, полученный из векторов LN⁷. Эта модификация повышает эффективность доставки генов, позволяя проводить как краткосрочные, так и долгосрочные исследования локализации Т-клеток in vivo. Используя ретровирусные частицы с высоким титром и конфокальную микроскопию, этот подход позволяет точно визуализировать позиционирование Т-клеток и взаимодействия в сложных тканевых средах. Мы представляем подробные протоколы ретровирусной трансдукции тракционных рецепторов и проведения внутренне контролируемых (так называемых конкурентных) хоуминговых анализов для изучения рецептор-опосредованного органо- и микроокруженного позиционирования лимфоцитов. Общая цель этого метода заключается в том, чтобы получить ценную информацию о механизмах транспортировки иммунных клеток и обеспечить возможность их применения в будущем как в фундаментальных исследованиях, так и в терапевтических разработках.

протокол

Все мыши в этом исследовании содержались в специфических свободных от патогенов (SPF) учреждениях в системе здравоохранения Пало-Альто по делам ветеранов (VAPAHCS). Мыши B6/SJL Prprc Pep3BoyJ (CD45.1), C57B6/J (CD45.2) и Rag1-/- были приобретены в Jackson Laboratories. Хотя мы использовали PepBoy для получения клеток CD45.1, мы рекомендуем использовать JAXBoy (C57BL/6J-Ptprc^em6Lutzy/J). JAXBoy — это полностью коизогенный штамм, полученный с помощью CRISPR вместо традиционного обратного скрещивания, что улучшает генетическую стабильность. Исторически сложилось так, что исследования, маркированные аллотипом CD45 на мышах PepBoy (CD45.1), которые не являются полностью генетическими, включали контрольные анализы хоуминга и рециркуляции со сравнением дикого типа (WT/WT) для учета потенциальной изменчивости. Теперь, когда мыши JAXBoy доступны в качестве полностью изогенной альтернативы, эти дополнительные средства контроля могут больше не требоваться. Исследователи все же должны учитывать, что различия между вариантами CD45.1 и CD45.2, такие как их роль в качестве протеинтирозинфосфатаз, могут влиять на клеточное поведение и паттерны хоуминга. Все протоколы, обсуждаемые в тексте и ниже, были одобрены или соответствуют рекомендациям аккредитованного Департамента медицины лабораторных животных и Административной группы по уходу за лабораторными животными в системе здравоохранения VA Palo Alto Health Care System (VAPAHCS). Животных приносили в жертву с использованием утвержденных процедур. В эксперименты были включены мыши обоего пола в возрасте 8-12 недель.

1. Векторная подготовка МСЦВ

1. Приобретите ретровирусный вектор MSCV-IRES-Thy1.1 с кодирующей областью интересующего гена мыши (GOI) или ORF_Stuffer (отрицательный контроль ORF)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта конструкция включает в себя поверхностный маркер Thy1.1 вместе с интересующим геном GPCR. Линкер с внутренним сайтом входа рибосом (IRES) обеспечивает совместную экспрессию GPCR с Thy1.1, облегчая идентификацию трансдуцированных клеток с помощью проточной цитометрии или очистки и выделения с помощью магнитных шариков. Это особенно полезно, когда антитела, специфичные к GPCR, недоступны, как это часто бывает в случае плохо изученных GPCR.
2. Приобретайте плазмиду MSCV в бактериальной форме и культуре путем инокуляции бульона Лурии-Бертани (LB) с добавлением соответствующего антибиотика, подобранного на основе гена резистентности, кодируемого плазмидой (например, ампициллином, канамицином или хлорамфениколом). Среда LB состоит из триптона (10 г/л), дрожжевого экстракта (5 г/л) и NaCl (10 г/л), доведенных до pH 7,0 и стерилизованных автоклавированием. Инкубируйте культуру при температуре 37 °C в встряхивающем инкубаторе (220 об/мин) в течение ночи.
3. Подготовьте плазмиды с использованием стандартных методов молекулярной биологии с помощью набора для подготовки ДНК.
4. После выделения ДНК измерьте концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра и приготовьте рабочие растворы плазмид в концентрации 1 мкг/мкл. Храните плазмиды при температуре -20 °C для дальнейшего использования.

2. Создание культуры упаковочной клеточной линии

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали клетки Platinum E (Plat-E) от Cell Biolabs. Клетки Plat-E представляют собой клеточную линию на основе 293T с промотором EF1α, который обеспечивает стабильную и высокопродуктивную экспрессию ретровирусных структурных белков (генов gag, pol и env), что позволяет упаковывать ретровирусы с помощью одной трансфекции плазмиды⁸. Хотя могут быть использованы и другие клеточные линии, такие как NIH-3T3 или 293T, мы не тестировали эти альтернативы.

1. Приготовьте клеточную среду Plat-E путем добавления DMEM, 10% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина, бластицидина (10 мкг/мл) и пуромицина (1 мкг/мл). Используйте бластицидин и пуромицин для поддержания клеток, но исключите их во время и после трансфекции.
2. Пластинчатые клетки Plat-E поставляются замороженными в 1,0 мл при >3 x 10⁶ клеток/мл в DMEM, 20% FBS и 10% DMSO. Быстро разморозьте их на водяной бане при температуре 37 °C. Перенесите все размороженные клетки в коническую пробирку объемом 15 мл с питательной средой Plat-E.
3. Центрифугируйте при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C. Ресуспендируйте клеточную таблетку в 1 мл среды Plat-E путем осторожного пипетирования до получения одноклеточной суспензии.
4. Добавьте 9 мл среды Plat-E в чашку для культур диаметром 10 см, затем перенесите 1 мл ресуспендированных клеток в чашку. Подтвердите, что размороженные клетки жизнеспособны, смешав равное количество клеточной суспензии и Trypan Blue и подсчитав жизнеспособные (неокрашенные) и мертвые (окрашенные в синий цвет) клетки с помощью гемоцитометра или счетчика клеток, стремясь к жизнеспособности >70%.
5. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5%_CO2. Не меняйте носитель в течение первых 3 дней; Нормально наблюдать плавающие и мертвые клетки после первой оттепели.
6. Когда конфлюенция клеток достигнет 85%-90%, промойте с помощью DMEM/PBS Ca-/Mg-. Отделите клетки с помощью 2 мл 0,05% трипсина/0,5 мМ ЭДТА и инкубируйте в течение 3 минут при 37 °C. Добавьте 8 мл среды Plat-E, соберите клетки в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 450 x g в течение 5 минут при 4 °C.
7. Разделите в соотношении поверхности 1:10 или 1:5 (т.е. засейте новые тарелки с 1/10 или 1/5 от общего объема от исходного блюда). Ресуспендировать в конечном объеме 10 мл среды Plat-E и инкубировать при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5%_CO2.
8. Остальные клетки аликвотировать в 1 мл FBS с 10% ДМСО и заморозить при -80 °С, а затем в жидком азоте для длительного использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обрабатывайте клетки, как описано выше, когда их слияние близко к 85%. Чтобы поддерживать оптимальное здоровье клеток, избегайте чрезмерной конфлюенции и стремитесь к 3-дневным сплитам с разведением 1:10. Если рост замедляется, используйте свежий аликвоту. Производительность клеток обычно снижается при последующих пассажах. Для достижения наилучших результатов мы рекомендуем использовать клетки для трансфекции между проходами 4 и 15.

3. Производство трансдуцированных клеток

1. День 1: Seed Plat E клетки
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитайте необходимое количество ячеек и пластин Plat E. Мы использовали 1 мл вирусной надосадочной жидкости на лунку в 24-луночном планшете для трансфекции клеток в 2 раза. Обычно мы используем примерно две 10-сантиметровые трансфицированные чашки Петри с клетками Plate-E на 24-луночный планшет с Т-клетками в культуре.
   1. Начните с покрытия 10-сантиметровых планшетов для культивирования тканей 50 мл поли-D-лизина 50 мкл в стерильной воде. Выдерживать при комнатной температуре в течение 45 минут. Промойте 2 раза стерильным PBS Ca-/Mg, чтобы убедиться, что не осталось остатков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем наносить покрытие на планшеты, так как клетки Plat-E имеют тенденцию отделяться после трансфекции, что приводит к снижению производительности клеток и снижению выработки титров вирусов.
   2. Отделите клетки Plat-E, как описано выше на шаге 2.6, и проведите анализ исключения трипанового синего для обеспечения жизнеспособности. Смешайте равное количество клеточной суспензии и Трипана Синего. Подсчитайте жизнеспособные (неокрашенные) и мертвые (окрашенные в синий цвет) клетки с помощью гемоцитометра/счетчика клеток. Засейте 3 x 10⁶ живые клетки в 10-сантиметровой тканевой культуре чашки Петри с безантибиотиковой средой Plat-E.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Засеянные пластины должны достичь 85%-90% слияния на следующий день. Если этого не достигнуто, рассмотрите возможность использования другой ячейки аликвоты. Регулируйте густоту посева в зависимости от сроков нанесения покрытия; Для вечерней облицовки можно использовать 3,5 х 10⁶ ячеек.
2. День 2: Трансфекция Plat-E клеток и покрытие Т-клеток анти-CD3 и анти-CD28 антителами
   1. Замените среду на клеточных культурах Plat-E 6,5 мл восстановленной сывороточной среды.
   2. Приготовьте трансфекционную смесь в соответствии с инструкциями производителя для реагента Липофектамин (в данном исследовании использовался Липофектамин 2000).
   3. Для каждой пластины смешайте 45 мкл липофектамина 2000 с 210 мкл восстановленной сывороточной среды в одной пробирке и 15 г ДНК с 235 мкл восстановленной сывороточной среды в другой пробирке. Соедините содержимое пробирок пипетированием 3х-4х.
   4. Инкубируйте смесь в течение 5-20 минут при комнатной температуре, чтобы образовались комплексы липофектамин/ДНК, затем добавьте по каплям в планшеты. Инкубируйте планшеты в течение 16 часов при 37 °C.
   5. Лунки для активации Т-клеток: покрыть 24-луночные планшеты 5 мкг/мл антимышиного CD28 (37,51) и 10 мкг/мл антимышиного CD3 (145-2c11) в дозе 375 мкл/лунка PBS в течение ночи при 4 °C или в течение 3-4 ч в инкубаторе при 37 °C на 3-й день.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При инкубации в течение ночи оберните пластины прозрачной пленкой, чтобы предотвратить испарение. Активатор мыши Dynabeads CD3/CD28 может быть использован в качестве альтернативы с сопоставимыми результатами.
3. День 3: Смена среды Plat-E и выделение и активация Т-клеток
   1. Утром замените среду для трансфекции Plat-E на 14 мл полной среды DMEM. Приготовьте Т-клеточную среду путем добавления RPMI-10: RPMI 1640 с L-глутамином, 10% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина, 1x заменимых аминокислот MEM, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ β-меркаптоэтанола и 1 мМ HEPES.
   2. Усыпить мышей JAXBoy (CD45.1) и C57B6/J (CD45.2) с помощью ингаляции CO₂с последующим вывихом шейки матки. Изолируйте селезенку и лимфатические узлы в стерильных условиях.
   3. Аккуратно разомните селезенку на нейлоновом сетчатом сетчатом ситечке размером 100 мкм со средой RPMI в 6-луночном планшете с помощью поршня шприца.
   4. Переведите раствор через нейлоновое сетчатое сетчатое сетчатое ситечко для суспензии одиночных клеток в коническую пробирку объемом 50 мл. Центрифугируйте при 450 x g в течение 5 минут при 4 °C и промойте их PBS Ca-/Mg-.
   5. Выполните отбор магнитных негативов с помощью изоляционного набора Mouse T/T CD4 в соответствии с инструкциями производителя или отсортируйте клетки с помощью стерильного FACS
   6. Подсчитайте количество Т-клеток с помощью счетчика клеток и поместите их в лунки для активации Т-клеток в соотношении 1-1,5 x 10⁶ на лунку в 1 мл среды RPMI-10 на лунку. Инкубируйте клетки при 37 °C с 5% CO₂ во увлажненном инкубаторе. Подождите 24-48 часов для правильной активации, как это было оценено под микроскопом, как описано в примечаниях ниже.
      Примечание: Сшивка CD3 и CD28 эффективно активирует Т-клетки в этой конфигурации. Из одной селезенки мыши обычно получается примерно 1 x 10⁸ спленоцитов. CD4+ Т-клетки обычно составляют около 10% от общей популяции спленоцитов. Таким образом, для приготовления 24-луночного планшета с 1-1,5 x 10⁶ CD4+ Т-клетками на лунку, по оценкам, будет достаточно клеток от 2-3 мышей.
4. День 4: Трансдукция
   1. Проверьте Т-клетки через 24 ч под микроскопом. Перед трансдукцией убедитесь, что Т-клетки находятся в взрывном состоянии (образуют кластеры и кажутся увеличенными из-за активации). Взрыв Т-клеток обеспечивает их нахождение в деловом состоянии, что имеет решающее значение для трансдукции MSCV⁹.
   2. Соберите ~10 мл вирусной надосадочной жидкости из 10-сантиметровых пластин в коническую пробирку. Замените планшеты для культивирования Plat-E еще 10 мл среды Plat-E без антибиотиков, чтобы обеспечить достаточное количество среды для получения большего количества сред для повторной трансдукции на следующий день. Регулируйте объем среды в планшетах PLAT-E в зависимости от количества лунок Т-клеток, которые необходимо трансфицировать на следующий день.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Двукратное преобразование значительно повышает эффективность.
   3. Отфильтруйте вирусную надосадочную жидкость, пропустив через шприцевой фильтр 0,45 мкм. Добавьте 8 мкг/мл полибрена и 1:100 HEPES.
   4. Вращайте 24-луночный планшет с Т-клетками в течение 7 минут при давлении 950 x g. Тщательно соберите и сохраните надосадочную жидкость, не смещая клетки. Эта надосадочная жидкость содержит цитокины и другие факторы, секретируемые Т-клетками после активации и заменяемые этим надосадочной жидкостью после спенинфекции для поддержания цитокинового профиля и профиля факторов для поддержки пролиферации и роста Т-клеток.
   5. Проведите спазинфекцию, добавив 1 мл вирусной надосадочной жидкости в каждую лунку и вращая при 1150 x g в течение 4 ч при 32 °C. Заклейте пластины полиэтиленовой пленкой во время дезинфекции.
   6. После спаринфекции осторожно замените среду на ранее сохраненную надосадочную жидкость Т-клеток.
5. День 5: Повторная трансдукция
   1. Повторите трансфекцию, как описано на 4-й день. При необходимости смешайте сохраненный надосадочный слой на шаге 3.4.3 из первоначально активированных Т-клеток со свежей средой в соотношении 1:1, если среда кажется исчерпанной.
6. День 6: Промойте ячейки и расширяйте
   1. Промойте ячейки PBS Ca+/Mg+. и перенесите их в новую культуральную тарелку со 130 Ед/мл мышиного IL2 и 10 нг/мл мышиного IL7. Инкубируйте клетки в течение не менее 2 дней или до тех пор, пока они не достигнут желаемого уровня расширения, в зависимости от количества клеток, необходимых для инъекции.
7. День 8: Сбор урожая и очищение
   1. Соберите клетки и очистите их с помощью градиента плотности Histopaque 1.077.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод помогает изолировать жизнеспособные клетки (например, лимфоциты или другие иммунные клетки) из мертвых клеток или мусора. Мертвые клетки, которые имеют более высокую плотность, оседают на дне трубки, в то время как жизнеспособные клетки обычно остаются в слое интерфейса.
   2. Добавьте 5 мл Histopaque 1.077 в 15 мл пробирки. Соберите клетки путем центрифугирования при 450 x g в течение 5 минут при 4 °C для гранулирования клеток.
   3. Ресуспендируйте клеточную таблетку в 5 мл PBS Ca+/Mg+. Осторожно нанесите клеточную суспензию поверх 5 мл Histopaque 1.077 в центрифужной пробирке.
   4. Центрифугируйте при давлении 400-500 x g в течение 20 минут при комнатной температуре, следя за тем, чтобы разрыв/ускорение центрифуги было равно нулю.
   5. После центрифугирования клетки разделяются на отдельные слои в зависимости от плотности. Желаемые ячейки обычно находятся на границе между Histopaque и верхней средой, в то время как мертвые клетки располагаются внизу. Осторожно соберите клеточный слой на границе раздела с помощью пипетки, не допуская загрязнения другими слоями. Теперь собранные клетки готовы и чисты для инъекций.
   6. Оцените эффективность трансдукции путем проведения окрашивания Thy1.1 и анализа проточной цитометрии. Стратегия стробирования показана на рисунке 1.
      Примечание: После трансдукции клетки могут быть использованы в анализах хемотаксиса для оценки их миграции к специфическим хемокинам по сравнению с клетками контрольных векторов для функционального подтверждения их активности in vitro перед продолжением инъекций.
8. Долгосрочный анализ локализации in vivo
   1. Для долгосрочного хоуминга используйте CD45.1 для интересующей мыши GPCR и CD45.2 для пустых векторных (или наоборот) трансдуцированных клеток. Смешайте две популяции клеток в соотношении 1:1.
   2. Введите внутривенно 20-30 x 10 по⁶ клеток на каждую взрослую мышь-реципиента Rag1-/- для 1-недельной тропики и 5 x 10⁶ для 7-недельной тропиза. Мы используем реципиентов Rag1-/- с дефицитом лимфоцитов для снижения конкуренции с эндогенными Т-клетками.
   3. Через 1–7 недель (в зависимости от исследования) введите антитела к CD45 внутривенно (в/в) мышам за 5 минут до сбора для мечения клеток, передающихся через кровь.
   4. Усыпьте мышей с помощью ингаляции_CO2 с последующим вывихом шейки матки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Были проведены исследования продолжительностью 1 неделя и 7 недель; Более длительные исследования возможны, но их еще предстоит проверить.
   5. Собирайте клетки из различных органов, представляющих интерес и контролирующих органы. Переваривают ткани в соответствии со стандартными протоколами подготовки лимфоцитов для каждого органа^10,11.
   6. Окрашивание собранных клеток моноклональными антителами (mAb) для проведения проточного цитометрического анализа.
9. Краткосрочное конкурентное хоуминг: позиционирование и визуализация Т-клеток
   1. Мы рекомендуем использовать мышей C57B6/J в качестве доноров, учитывая, что мы будем флуоресцентно мечить клетки. Тем не менее, для очень коротких самонаводящихся анализов продолжительностью до нескольких часов можно использовать любой штамм.
   2. На 8-й день культивирования магнитно изолируют трансдуцированные (Thy1.1+) клетки с использованием микрогранул CD90.1 в соответствии с инструкцией производителя¹².
   3. После этого момента в культуре следует поддерживать только трансдуцированные клетки (чистота >95%) в течение 2 дней под контролем IL2 и IL7, как указано выше, и дать им расшириться. Микрогранулы биоразлагаемы и через 48 ч не нарушают нормальную функцию клеток.
   4. На 11-й день пометьте клетки, экспрессирующие интересующий GPCR, карбоксифлуоресцеином сукцинимидиловым эфиром (CFSE — краситель для окрашивания флуоресцентных клеток). Для ячеек Stuffer используйте желтый флуоресцентный краситель, или наоборот. Вы можете использовать альтернативные красители, если предпочитаете.
      1. Приготовьте клеточную суспензию в концентрации 1 x 10⁶ клеток/мл в RPMI с 2% FBS. Инкубировать клетки с красителем в конечной концентрации 5 мкМ при 37 °C на водяной бане с легким перемешиванием в течение 20 минут. Чтобы получить сопоставимые результаты, чередуйте назначения красителей в отдельных экспериментах. В качестве альтернативы можно использовать один краситель для обозначения общего типа клеток в качестве внутреннего стандарта, включая экспериментальные и контрольные клетки у разных реципиентов.
      2. Промойте помеченные ячейки и смешайте их в соотношении 1:1. Оцените концентрацию клеток с помощью счетчика клеток. Введите 15-30 x 10⁶ клеток внутривенно мышам-реципиентам (WT или трансгенным мышам-реципиентам, в зависимости от цели эксперимента).
   5. Примерно через 10-12 ч вводите мышам антитела против CD31 (например, меченый DyLight 633, клон 390), которые следует ввести за 10-15 мин до жертвоприношения, чтобы разграничить кровеносные сосуды и отличить внутрисосудистые клетки от экстравазированных.
   6. Усыпьте мышей с помощью ингаляции_CO2 с последующим вывихом шейки матки. Анализируйте локализацию клеток с помощью FACS клеточных суспензий, как описано в шаге 3.8 выше, или путем визуализации целых тканей, как в шаге 3.9.8 или шаге 3.9.7 для органов, представляющих интерес, с помощью конфокальной микроскопии.
   7. Для тонких органов, таких как трахея, маточный рог или лимфатические узлы, подготовьте крепления для кабачков. Поместите салфетку на предметное стекло с помощью двустороннего скотча по бокам, добавьте несколько капель монтажного раствора Fluoromount-G, накройте покровным слипом и аккуратно и равномерно прижмите, чтобы зафиксировать покровное стекло к ленте с помощью отдельного предметного стекла или другого плоского предмета.
   8. Для замороженных срезов поместите ткань в состав с оптимальной температурой резки (OCT). Для легких перфузия с 50% ОКТ/ПБС перед внедрением.
   9. Используйте проточную цитометрию для контрольных органов, таких как периферические лимфатические узлы (PLN), селезенка или кровь, для оценки эффективности трансдукции (% Thy1,1+), как показано на рисунке 1 , и нормализации результатов. Визуализируйте PLN с помощью креплений или секций для сквоша с помощью конфокальной микроскопии. Подсчитывайте клетки с помощью конфокальной микроскопии с программным обеспечением Imiris.
   10. Определите соотношение GPCR-трансдуцированных клеток к контрольным клеткам (трансдуцированным Stuffer) в целых органах или в конкретных компартментах органов. Нормализуйте до соотношения входных данных, определенных с помощью FACS, и/или до соотношения, полученного от контрольных органов, в которых GPCR известен или считается нерелевантным.
   11. Для анализа локализации микроокружения в легких измерьте расстояние между клетками до гистологических ориентиров (например, базальных мембран бронхов или вен) с помощью программного обеспечения Imiris.

Результаты

В данном исследовании мы представляем подробный протокол исследования способности специфических рецепторов к прямой локализации Т-клеток in vivo. В качестве демонстрации этого протокола мы использовали GPR25¹³. Мы можем достичь 30%-40% эффективности трансдукци?...

Обсуждение

Внутренне контролируемый анализ самонаведения, описанный в этом исследовании, представляет собой комплексный метод изучения GPCR-опосредованного транспорта и позиционирования Т-клеток в различных органах и тканевых микросредах. Этот подход объединяет несколько кри?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AF647 anti mouse CD90.1-Thy1.1 (OX-7)	Biolegend	202507
anti-CD31 (DyLight 633, clone 390)	InvivoMab	BE0377
anti-mouse CD28 37.51	eBiosciences
anti-mouse CD3 145-2c11	eBiosciences
APCCy7 anti mouse CD3 (145-2c11)	Biolegend	100329
BV421 anti mouse CD8b (Ly-3)	Biolegend	126629
BV711 anti mouse CD4 (RM4-5)	Biolegend	100549
CD90.1 microbeads	Miltenyi	130-121-273
CFSE	Thermoscientific	C34554
FITC anti mouse CD45.2 (104)	BD	AB_395041
mouse IL2	Peprotech	200-02-50UG
mouse IL7	Peprotech	217-17-10UG
Mouse T CD4 isolation kit	STEMCELL technologies	18000
MSCV-IRES- Thy1.1 GPR25	Vectorbuilder
MSCV-IRES- Thy1.1 Stuffer	Vectorbuilder
PE-CD45 (30-F11) antibody	Biolegend	103105
PECy7 anti mouse TCRb (H57-597)	Tonbo
PercpCy5.5 anti mouse CD45.1 (A20)	eBiosciences
Platinum-E (Plat-E)	cell Biolabs. Inc	RV-101
Yellow fluorescent dye	Thermoscientific