ניתוח עקומת גדילה חיידקית והיישומים הסביבתיים שלה

Overview

מקור: מעבדות של ד"ר איאן פפר וד"ר צ'ארלס גרבה - אוניברסיטת אריזונה
הפגנה סופרת: לואיזה איקנר

חיידקים הם בין צורות החיים הנפוצות ביותר על פני כדור הארץ. הם נמצאים בכל מערכת אקולוגית וחיוניים לחיי היומיום. לדוגמה, חיידקים משפיעים על מה שאנשים אוכלים, שותים ונושמים, ולמעשה יש יותר תאים חיידקיים בגוף של האדם מאשר תאים יונקים. בגלל החשיבות של חיידקים, עדיף לחקור מינים מסוימים של חיידקים במעבדה. כדי לעשות זאת, חיידקים גדלים בתנאים מבוקרים בתרבות טהורה, כלומר רק סוג אחד של חיידק נמצא בחשבון. חיידקים גדלים במהירות בתרבית טהורה, ומספר התאים גדל באופן דרמטי בפרק זמן קצר. על ידי מדידת קצב הגידול באוכלוסיית התאים לאורך זמן, יש לפתח "עקומת גדילה". זה חשוב כאשר שואפים לנצל או לחסן מספרים ידועים של בידוד חיידקי, למשל כדי לשפר את צמיחת הצמח, להגדיל את ההתכלות של אורגנים רעילים, או לייצר אנטיביוטיקה או מוצרים טבעיים אחרים בקנה מידה תעשייתי.

Principles

רבייה חיידקית מתרחשת באמצעות ביקוע בינארי, שבו תא חיידקי אחד מתחלק והופך לשני תאים (איור 1). הזמן הדרוש לחלוקת התאים ידוע כזמן ייצור ממוצע, או זמן הכפלה, שהוא הזמן הדרוש להכפלת מספר התאים.

איור 1. חלוקת תאים מעריכית. כל חלוקת תאים גורמת להכפלה של מספר התא. במספרי תאים נמוכים, הגידול אינו גדול במיוחד; עם זאת, לאחר כמה דורות, מספרי התאים גדלים באופן נפיץ. לאחר n חטיבות, יש 2ⁿ תאים.

כדי להבין ולהגדיר את הצמיחה של מיקרואורגניזמים מסוימים, הם ממוקמים בקבוקון, שבו אספקת החומרים המזינים ואת התנאים הסביבתיים נשלטים. אם המדיום הנוזלי מספק את כל החומרים המזינים הדרושים לצמיחה ופרמטרים סביבתיים שתורם לצמיחה, ניתן למדוד את הגידול במספרים כפונקציה של זמן כדי להשיג עקומת צמיחה. ניתן לראות מספר שלבי צמיחה נפרדים בתוך עקומת הצמיחה (איור 2). אלה כוללים את שלב ההשהיה, שלב מעריכי או יומן רישום, השלב הנייח, ואת שלב המוות, שכל אחד מהם קשורים לשינויים פיזיולוגיים ספציפיים (טבלה 1).

שלב	מאפיינים
שלב השהיה	צמיחה איטית או חוסר צמיחה עקב הסתגלות פיזיולוגית של תאים לתנאי תרבית או דילול של exoenzymes עקב צפיפות תאים נמוכה ראשונית.
שלב מעריכי או יומן רישום	שיעורי צמיחה אופטימליים, שבמהלכם מספרי התאים כפולים במרווחי זמן נפרדים המכונים זמן ייצור ממוצע.
שלב נייח	צמיחה (חלוקת תאים) ומוות של תאים לאזן אחד את השני וכתוצאה מכך אין עלייה נטו במספרי התאים. קצב הצמיחה המופחת נובע בדרך כלל ממחסור בחומרים מזינים ו/או הצטברות של מרכיבי פסולת רעילה.
שלב המוות	שיעור התמותה עולה על קצב הצמיחה וכתוצאה מכך אובדן נטו של תאים בני קיימא.

טבלה 1. ארבעת השלבים של צמיחת חיידקים.

איור 2. עקומת גדילה טיפוסית לאוכלוסיית חיידקים. השווה את צורת העקומות בהתבסס על יחידות יוצרות מושבה (CFUs) לעומת צפיפות אופטית, במיוחד בשלב המוות. ההבדל נובע מהעובדה שתאים מתים עדיין גורמים לערימות, אך אינם יכולים ליצור מושבות ברות קיימא בתרבות.

בסך הכל, זה לעתים קרובות קריטי כדי לקבוע קינטיקה צמיחה חיידקית עבור מבודד חיידקי נתון, על מנת לדעת את מספר התאים החיידקיים הנוכחים במדיום הנוזלי. ישנן דרכים שונות למדוד צמיחה במדיום נוזלי, כולל מדידות עכורות באמצעות ספקטרופוטומטר צבעוני, ו ציפוי דילול סדרתי. מדידות עכירות מסתמכות על העובדה שכך שהתאים נמצאים יותר במדיום הנוזלי, כך הנוזל הופך להיות עכיר יותר. ציפוי דילול סדרתי כרוך בבחיטה של מספר התאים במדיום הנוזלי שיכולים ליצור מושבות קיימא על תרבות מוצקה, מדידה המכונה "יחידות יוצרות המושבה" של התרבות. עם זאת, שים לב כי בדיקות ציפוי כאלה יכולות לשמש רק עבור חיידקים כי הם, למעשה, culturable.

Procedure

1. אוסף עליקוטים של תרבות חיידקים

יום אחד לפני איסוף נקודות זמן הצמיחה, לחסן 20 מ"ל של ציר סויה טריפטיאז (TSB) בינוני בבקבוקון 50 מ"ל עם E. coli.
דגירה לילה ב 27 °C (5 °F). תקופת דגירה ארוכה יחסית זו גורמת לאוכלוסיית שלב נייחת מסוג בר E. coli של כ 10⁹ CFU / mL.
למחרת, להשתמש 100 μL של התרבות המוכנה כדי לחסן 250 מ"ל של TSB (בבקבוק 500 מ"ל). מערבבים היטב. הסר aliquot 5-mL ומקרר מיד ב 4 °C (5 °F). זוהי נקודת זמן T = 0 או T_0, ועליה להכיל כ- 4 x 10⁵ CFU/mL.
מניחים את הבקבוקון של E. coli הנותר (245 מ"ל) באינקובטור רועד של 37 מעלות צלזיוס. הסר aliquots 5-mL של תרבות כל שעה, עד 8 שעות. יש לאחסן כל עליקוט ב-4 °C (70 °F). ייעדו את עליקוטים אלה T₁ עד T₈.

2. דילול סדרתי

מוציאים עליקוטים של אי קולי מהמקרר ומניחים על קרח להובלה. שמור את כל התרבויות על קרח עד השימוש.
הקימו סדרה של צינורות דילול כדי להשיג דילולים שונים של כל תרבות אי-קולי (איור 3). צינורות מיקרופוגה נוחים לתפקוד זה. כל צינור דילול צריך להיות 900 μL של נוזל דילול (מלוחים סטריליים). סדרת דילול נדרשת עבור כל תרבות E. coli (T₀ עד T₈); תווית כל צינור לפי טבלה 2.

איור 3. סכמטי המציג את ההליך ל ציפוי E. coli.
התחל דילול על ידי הוספת 100 μL של E. coli מן הצינור שכותרתו T₀ (התרבות הראשונית E. coli) לצינור A, שהוא דילול 10^-1 של T₀. מערבולת הצינור עבור 5s.
לאחר מכן, להוסיף 100 μL של Tube A לצינור הבא של תמיסת מלח, Tube B, שהוא דילול^{10 -2} של T₀. המשך את סדרת הדילול הדרושה עבור aliquot נקודת זמן. זכור מערבולת כל צינור לפני ההעברה. חשוב גם להשתמש בטיפ פיפטה חדש לכל העברה.

תרבות ה- E. coli	דילולים נדרשים וצינור #
	A	B	C	D	E	F	G
T₀	10^-1	10^-2
T₁	10^-1	10^-2
T₂	10^-1	10^-2	10^-3
T₃	10^-1	10^-2	10^-3	10^-4
T₄	10^-1	10^-2	10^-3	10^-4	10^-5
T₅	10^-1	10^-2	10^-3	10^-4	10^-5	10^-6
T₆	10^-1	10^-2	10^-3	10^-4	10^-5	10^-6	10^-7
T₇	10^-1	10^-2	10^-3	10^-4	10^-5	10^-6
T₈	10^-1	10^-2	10^-3	10^-4	10^-5	10^-6

טבלה 2. סדרת דילול הנדרשת עבור כל תרבות אי-קולי.

3. ציפוי

שלושה דילולים עבור כל נקודת זמן תרבות E. coli יהיה מצופה, על פי טבלה 3. תוויות לוחיות עם נקודת הזמן (T₁ עד T₈), גורם הדילול ונפח ההוספה. השתמש בצלחות משולשות לכל דילול.
הוסיפו 100 μL של כל דילול לצלחת על ידי צנרת הסכום למרכז צלחת אגר(איור 3). מיד להפיץ את aliquot על ידי שימוש במוט זכוכית בצורת "L" מעוקר להבה. אם aliquot אינו מתפשט מיד, זה סורבים במקום על הצלחת, וכתוצאה מכך גידול יתר חיידקי במקום של חיסון ראשוני.
חזור על ה ציפוי עבור כל סדרת דילול עבור נקודות זמן T₁ עד T₈. זכור לחטא את המוט בין הצלחות ובמיוחד בין דילולים שונים.
לאחר צלחות התייבשו במשך כמה דקות, הפוך ומניחים 37 °C חממה לילה. היפוך הצלחות מונע עיבוי מנפילה על צלחת אגר. לאחר הדגירה הלילית, יש לאחסן צלחות במקרר.

תרבות *אי-קולי*	דילול שיש לציפוי
T₀	10^-1	10^-2	10^-3
T₁	10^-1	10^-2	10^-3
T₂	10^-2	10^-3	10^-4
T₃	10^-3	10^-4	10^-5
T₄	10^-4	10^-5	10^-6
T₅	10^-5	10^-6	10^-7
T₆	10^-6	10^-7	10^-8
T_7*	10^-5	10^-6	10^-7
T_8*	10^-4	10^-5	10^-6

^* דילול נמוך יותר לוקח בחשבון אוכלוסיות נמוכות יותר עקב שלב המוות.

טבלה 3. פרוטוקול ציפוי לתרבויות אי-קולי.

4. ספירת מושבות וחישוב זמן הדור הממוצע

לבחון לוחות לאחידות המושבות וחוסר זיהום.
עבור כל נקודת זמן (T₀ עד T₈), לבחור דילול אחד המכיל בין 30 ל 300 מושבות, ולספור לוחות משולשים.
באמצעות גורם הדילול, חשב לאחור את מספר התאים לכל mL של התרבות המקורית בנקודות זמן T₀ עד T₈. לדוגמה, אם מספר המושבות הנובע מדילול של^10-4 הוא 30, 28 ו- 32:
מספר ממוצע של מושבות = 30 מושבות
אלה עלו מ 0.1 מ"ל של דילול 10^-4
מספר מושבות למ"ל = 30 x 10⁴ = 3 x 10⁶
_{התוויית יומן} רישום 10 CFU/mL לעומת זמן (בשעות).
מהגרף, זהה את השלב המעריכי של הצמיחה. באמצעות 2 נקודות זמן בתוך שלב הצמיחה המעריכי ומספרי התאים המתאימים בכל פעם, חשב את זמן הדור הממוצע.

Results

לאחר ניסוי ציפוי דילול סדרתי, הנתונים הבאים הושגו. בתחילת הצמיחה המעריכית המיועדת כאן כזמן t = 0, הריכוז הראשוני של תאי חיידקים הוא 1,000 CFU / mL. בזמן t = 6 שעות, ריכוז התאים הוא 16,000 CFU / מ"ל.

עכשיו, X = 2^{n x} ₀

איפה: X₀ = ריכוז ראשוני של תאים = 1,000 CFU / מ"ל
X = ריכוז תאים לאחר זמן t = 16,000 CFU/mL
n = מספר הדורות
16,000 = 2ⁿ x 1,000
2ⁿ = 16
יומן רישום₁₀ 2ⁿ = יומן רישום₁₀ 16
n x 0.301 = 1.204
n = 1.204 = 4
0.301

ארבעה דורות חלפו ב-6 שעות, אז

זמן דור ממוצע = 6/4 = 1.5 שעות.

איור 4. גוש שורשים המכיל חיידקים לתיקון חנקן.

Application and Summary

ידע על קינטיקה של גדילה חיידקית ומספר חיידקים במדיום תרבית חשוב הן מבחינה מחקרית והן מבחינה מסחרית. במחקר, לעתים קרובות זה קריטי לדעת את מספר החיידקים במדגם, כך שניתן לשכפל את הניסוי, אם יהיה צורך, עם אותם מספרים בדיוק. לדוגמה, במהלך ניסויים שבהם inoculants חיידקים מתווספים לחלקת אדמה, מינימום של 10⁴ CFU צריך להיות נוסף לכל גרם של אדמה כדי לקבל את האפקט הרצוי, כגון מתכלה משופרת של מזהמי קרקע אורגניים רעילים. דוגמה נוספת היא המקרה של אינקולנטים קנה שורש המיוצרים מסחרית, שבו מספרים ידועים של rhizobia (חיידקים שנכנסים ליחסים סימביוטיים עם שורשי צמחים) הם ספוגים לתוך מדיום פחמן מבוסס כבול(איור 4). המדיום משמש לאחר מכן לחסן זרעי קטניות כדי לשפר את קיבוע החנקן הביולוגי (כלומר,המרת חנקן מולקולרי לצורות אורגניות שיכולות לשמש אורגניזמים כחומרים מזינים).

קינטיקה צמיחה שימושית גם להערכה אם זנים מסוימים של חיידקים מותאמים לעכל מצעים מסוימים, כגון פסולת תעשייתית או זיהום שמן. חיידקים מהונדסים גנטית כדי לנקות דליפות נפט, למשל, ניתן לגדל בנוכחות פחמימנים מורכבים כדי להבטיח כי הצמיחה שלהם לא יהיה מודחק על ידי ההשפעות הרעילות של שמן. באופן דומה, השיפוע והצורה של עקומות גדילה המיוצרות מחיידקים הגדלים בתערובות של מוצרי פסולת תעשייתית יכולים ליידע מדענים אם החיידקים יכולים לעכל את החומר המסוים, וכמה מקורות אנרגיה פוטנציאליים לחיידקים ניתן למצוא בתערובת הפסולת.

Tags

1. אוסף עליקוטים של תרבות חיידקים

יום אחד לפני איסוף נקודות זמן הצמיחה, לחסן 20 מ"ל של ציר סויה טריפטיאז (TSB) בינוני בבקבוקון 50 מ"ל עם E. coli.
דגירה לילה ב 27 °C (5 °F). תקופת דגירה ארוכה יחסית זו גורמת לאוכלוסיית שלב נייחת מסוג בר E. coli של כ 10⁹ CFU / mL.
למחרת, להשתמש 100 μL של התרבות המוכנה כדי לחסן 250 מ"ל של TSB (בבקבוק 500 מ"ל). מערבבים היטב. הסר aliquot 5-mL ומקרר מיד ב 4 °C (5 °F). זוהי נקודת זמן T = 0 או T_0, ועליה להכיל כ- 4 x 10⁵ CFU/mL.
מניחים את הבקבוקון של E. coli הנותר (245 מ"ל) באינקובטור רועד של 37 מעלות צלזיוס. הסר aliquots 5-mL של תרבות כל שעה, עד 8 שעות. יש לאחסן כל עליקוט ב-4 °C (70 °F). ייעדו את עליקוטים אלה T₁ עד T₈.

2. דילול סדרתי

מוציאים עליקוטים של אי קולי מהמקרר ומניחים על קרח להובלה. שמור את כל התרבויות על קרח עד השימוש.
הקימו סדרה של צינורות דילול כדי להשיג דילולים שונים של כל תרבות אי-קולי (איור 3). צינורות מיקרופוגה נוחים לתפקוד זה. כל צינור דילול צריך להיות 900 μL של נוזל דילול (מלוחים סטריליים). סדרת דילול נדרשת עבור כל תרבות E. coli (T₀ עד T₈); תווית כל צינור לפי טבלה 2.

איור 3. סכמטי המציג את ההליך ל ציפוי E. coli.
התחל דילול על ידי הוספת 100 μL של E. coli מן הצינור שכותרתו T₀ (התרבות הראשונית E. coli) לצינור A, שהוא דילול 10^-1 של T₀. מערבולת הצינור עבור 5s.
לאחר מכן, להוסיף 100 μL של Tube A לצינור הבא של תמיסת מלח, Tube B, שהוא דילול^{10 -2} של T₀. המשך את סדרת הדילול הדרושה עבור aliquot נקודת זמן. זכור מערבולת כל צינור לפני ההעברה. חשוב גם להשתמש בטיפ פיפטה חדש לכל העברה.

תרבות ה- E. coli	דילולים נדרשים וצינור #
	A	B	C	D	E	F	G
T₀	10^-1	10^-2
T₁	10^-1	10^-2
T₂	10^-1	10^-2	10^-3
T₃	10^-1	10^-2	10^-3	10^-4
T₄	10^-1	10^-2	10^-3	10^-4	10^-5
T₅	10^-1	10^-2	10^-3	10^-4	10^-5	10^-6
T₆	10^-1	10^-2	10^-3	10^-4	10^-5	10^-6	10^-7
T₇	10^-1	10^-2	10^-3	10^-4	10^-5	10^-6
T₈	10^-1	10^-2	10^-3	10^-4	10^-5	10^-6

טבלה 2. סדרת דילול הנדרשת עבור כל תרבות אי-קולי.

3. ציפוי

שלושה דילולים עבור כל נקודת זמן תרבות E. coli יהיה מצופה, על פי טבלה 3. תוויות לוחיות עם נקודת הזמן (T₁ עד T₈), גורם הדילול ונפח ההוספה. השתמש בצלחות משולשות לכל דילול.
הוסיפו 100 μL של כל דילול לצלחת על ידי צנרת הסכום למרכז צלחת אגר(איור 3). מיד להפיץ את aliquot על ידי שימוש במוט זכוכית בצורת "L" מעוקר להבה. אם aliquot אינו מתפשט מיד, זה סורבים במקום על הצלחת, וכתוצאה מכך גידול יתר חיידקי במקום של חיסון ראשוני.
חזור על ה ציפוי עבור כל סדרת דילול עבור נקודות זמן T₁ עד T₈. זכור לחטא את המוט בין הצלחות ובמיוחד בין דילולים שונים.
לאחר צלחות התייבשו במשך כמה דקות, הפוך ומניחים 37 °C חממה לילה. היפוך הצלחות מונע עיבוי מנפילה על צלחת אגר. לאחר הדגירה הלילית, יש לאחסן צלחות במקרר.

תרבות *אי-קולי*	דילול שיש לציפוי
T₀	10^-1	10^-2	10^-3
T₁	10^-1	10^-2	10^-3
T₂	10^-2	10^-3	10^-4
T₃	10^-3	10^-4	10^-5
T₄	10^-4	10^-5	10^-6
T₅	10^-5	10^-6	10^-7
T₆	10^-6	10^-7	10^-8
T_7*	10^-5	10^-6	10^-7
T_8*	10^-4	10^-5	10^-6

^* דילול נמוך יותר לוקח בחשבון אוכלוסיות נמוכות יותר עקב שלב המוות.

טבלה 3. פרוטוקול ציפוי לתרבויות אי-קולי.

4. ספירת מושבות וחישוב זמן הדור הממוצע

לבחון לוחות לאחידות המושבות וחוסר זיהום.
עבור כל נקודת זמן (T₀ עד T₈), לבחור דילול אחד המכיל בין 30 ל 300 מושבות, ולספור לוחות משולשים.
באמצעות גורם הדילול, חשב לאחור את מספר התאים לכל mL של התרבות המקורית בנקודות זמן T₀ עד T₈. לדוגמה, אם מספר המושבות הנובע מדילול של^10-4 הוא 30, 28 ו- 32:
מספר ממוצע של מושבות = 30 מושבות
אלה עלו מ 0.1 מ"ל של דילול 10^-4
מספר מושבות למ"ל = 30 x 10⁴ = 3 x 10⁶
_{התוויית יומן} רישום 10 CFU/mL לעומת זמן (בשעות).
מהגרף, זהה את השלב המעריכי של הצמיחה. באמצעות 2 נקודות זמן בתוך שלב הצמיחה המעריכי ומספרי התאים המתאימים בכל פעם, חשב את זמן הדור הממוצע.

Skip to...

0:00

Overview

1:15

Principles of Bacterial Growth Curve Analysis

3:46

Collection of Bacterial Culture Aliquots

5:09

Serial Dilution Plating to Quantify Bacteria

7:19

Counting Colonies and Calculating Mean Generation Time

9:31

Applications

11:50

Summary

Videos from this collection:

article

Now Playing

ניתוח עקומת גדילה חיידקית והיישומים הסביבתיים שלה

Environmental Microbiology

296.3K Views

article

קביעת תכולת הלחות בקרקע

Environmental Microbiology

359.8K Views

article

טכניקה אספטית במדעי הסביבה

Environmental Microbiology

126.5K Views

article

כתמי גרם של חיידקים ממקורות סביבתיים

Environmental Microbiology

100.5K Views

article

הדמיית מיקרואורגניזמים קרקע באמצעות מצג שקופיות מגע ומיקרוסקופיה

Environmental Microbiology

42.4K Views

article

פטריות נלאמנטיות

Environmental Microbiology

57.7K Views

article

הפקת דנ"א קהילתי ממושבות חיידקים

Environmental Microbiology

28.9K Views

article

זיהוי מיקרואורגניזמים סביבתיים עם תגובת שרשרת פולימראז ואלקטרופורזה ג'ל

Environmental Microbiology

44.6K Views

article

ניתוח RNA של דגימות סביבתיות באמצעות RT-PCR

Environmental Microbiology

40.6K Views

article

כימות מיקרואורגניזמים סביבתיים ווירוסים באמצעות qPCR

Environmental Microbiology

47.9K Views

article

ניתוח איכות מים באמצעות אורגניזמים מחוון

Environmental Microbiology

29.6K Views

article

בידוד חיידקים צואתיים מדגימות מים על ידי סינון

Environmental Microbiology

39.4K Views

article

זיהוי בקטריופאג'ים בדגימות סביבתיות

Environmental Microbiology

40.9K Views

article

פולחן ופירום חיידקים מדגימות קרקע

Environmental Microbiology

184.9K Views

article

1 200 אצות באמצעות מתודולוגיה של Culturable

Environmental Microbiology

13.8K Views

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved