פרויקט זה מומן על ידי CIHR ו NSERC. ברצוננו להודות Jusiak ברב לתרום ליצירת זני לטוס להביע SSR שכותרתו dsRed (קו ב&quot;ג), ואת מתקן ביו הדמיה UBC.

חלק 1: הכנת רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המטרה שלנו היא הכנה רקמה של זחלי זבוב שבו מערכת העצבים לא נפגעה, אך את פני השטח הפנימי של שריר קיר הגוף חשוף hemolymph מלאכותי, והוא יכול להיות ממוקם קרוב לחמוק מיקרוסקופ לחפות על אופטיקה טובה. במילים אחרות, לפני ולפנים הכנה הזחל. מאז ההכנות לערב חיתוך הרקמה קונבנציונאלי, מרתק ומותח את השריר קיר הגוף, ולפעמים הסרת חלק של מערכת העצבים, אנחנו צריכים גישה שונה. רצינו את החיות מבפנים החוצה כי רצינו לקבל מבט טוב על תכונות מבניות ושינויים מבניים לאורך זמן בסינפסה, ורצינו לשמור על מערכת העצבים ללא פגע. רצינו גם כדי למנוע מתיחת הרקמה, והפעלת קולטני המתיחה, אשר יגרום לשרירים עווית ולהרוס התמונות שלנו. </li> <li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתור התחלה, בשלב החיות. האכלת הרימות השלישי הנודד הזחלים שלישי גדול קל לנתח כך נצטרך להוכיח על זחלים W3. חיה זו היא בעלת פנוטיפ טאבי, והוא רחב, ולכן קל אוורט. אנו נעשה שימוש רק זחלים שראינו פעיל זחילה, כולל הזחלים W3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את פני השטח של תולעת עם מברשת צבע רך מאוד בצלחת פטרי של פעמיים מזוקקים H2O. הזחלים נקי יש אופטיקה טובה יותר וניקוי מפחית חיידקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את החיה כדי בצלחת פטרי קטנה של כ 3 מ&quot;ל קרח קר HL-6 ו hemolymph מלאכותית. שים את צלחת על הקרח עד שהחיה מפסיק לנוע, מרגיע (כ -5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק מלקחיים טיפ מצוין ביד אחת ומספריים האביב השני. אני משתמש במספריים ביד הדומיננטית שלי. עושים חור קטן בקיר גוף עם מספריים כדי equlibrate את הלחץ על הקיר הגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את החיה בעדינות עם מלקחיים על החלק התחתון של התבשיל ומנותקים האחורי שני קטעים. לנתח משם את הקרביים ואת השומן בגוף צפוי לעזוב את חלל הגוף. גזור משם זה גם רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את הזחלים נגד תחתית צלחת עם מלקחיים בסדר. החזק סיכה # 0 חרק (עם קצה קהה) ולדחוף אותו כלפי חלקי הפה של הזחלים. לחצו על חלקי הפה דרך חלל הגוף כמו שאתה מפנה גרב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ולפנים רקמות תיראה דמות: להלן. בעזרת כלי אולטרה בסדר לנתח, לנתח משם את שומן הגוף ואת trachioles מהקיר הגוף. נסה באמת קשה לא למשוך את trachioles, או לנתק את מערכת העצבים. קורעת trachioles יהיה לקרוע חורים בקיר השריר בגוף. הסרה של שומן הגוף כמה שאתה יכול. שני מבנים אלה לשבש את איכות אופטית של רקמה שלך. אולי כדאי לוותר על הקפה לפני ההכנה עושה את זה. </li> <li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשתסיים השריר יהיה שקוף, לא אטום או לבן. אם אתה מכין את הרקמות לתוך HL-6 ללא גלוטמט, טמפ &#39;חדר בבית, סביר להניח כי חוזה בקצב גנרטורים דפוס המנוע CNS פועלים. הימנע משימוש preps עם שרירים מכווצים ברור, או חוזה סדיר קיר הגוף. בתוך קיר שלם מחוץ לגוף בקלות נוטה לקפל לשניים לאורך midlines הגבי ו הגחון, ולכן מכין נותן שמאלה או ימינה &quot;חמי חיה&quot; לדמיין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.9 הר רקמות בתא או נפח קטן מסחריים, כגון תא וורנר, או שקופיות מיקרוסקופ עם הסדר כיסוי לגשר להחליק. ראה חלק 3 הצעות על רקמת גובר. </li></ol> חלק 2: תיוג באוטון העצבית עם נוגדן ראשוני שכותרתו fluorescently נגד HRP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 50 מיקרו ליטר של שכותרתו fluorescently גוף אנטי העיקרית נגד HRP ב HL-6 בטיפת על צלחת פטרי. לטבול את החלק הפנימי החוצה קיר הגוף מכין באמבט צבע. אתה יכול לראות תיוג נוירון מסוף לאחר כ -5 דקות, אבל דגירה של 10-20 דקות, עבור תווית מלא ובהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את את צבע עבור 10-30 שניות HL-6 בטמפרטורת החדר. Non-מחויב לצבוע את שטיפות מהר, כך מחזור שטיפה לא צריך להיות אגרסיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנו את צבע ריכוז וזמן הדגירה כנדרש. </li></ol> חלק 3: תיוג מרחב Perisynaptic עם dextran flurophore המצומד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל מצומדות fluorescently dextran צבע מדולל HL-6. ריכוז זה עבד היטב למטרות שלנו: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אתם לא מודאגים עיתוי גישה צבע לתוך לחלל תאיים שלך, לשים טיפה 20 מיקרו ליטר של צבע על coverslip &quot;לגשר&quot; (ראה חלק 4) ו ההפקדה הכנה באמבט צבע. </li></ol> חלק 4: הרכבה רקמת להדמיה (עם מיקרוסקופיה confocal). אם אתה לא צריך perfuse הכנה שלך (תצפיות קצר) או שאתה רוצה לשמור את נפח רחצה HL-6 קטן, השתמש בשיטה הכפולה שקופיות לגישור אם אתה רוצה perfuse הכנה שלך, נסה להשתמש קאמרית זלוף. השתמשנו מולשכת dified ממכשירים וורנר. פרטים עבור שניהם לעקוב. הרכבה הכנה בשקופית פעמיים לגישור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש שקופיות מיקרוסקופ נקי מאוד. הפלא two רבועים, 18mm (# 1.5) coverslips לשקופית. השאירו מרווח 2 מ&quot;מ בין הקצוות של coverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו הדבק יבש לחלוטין, או שזה יהיה בצורת סרט מוזר על התקשורת מימית סביב הכנה שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את ולפנים הזחלים בין הקצוות של coverslips. ייתכן שיהיה עליך למקם את הכנה באלכסון אם הזחלים הוא גדול ורכישת את התמונה למערכת יש מערך פיקסל מוגבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הרקמה עם # 1.5 coverslip, 18mm (נקי מאוד). ציית coverslip &quot;מלמעלה&quot; להחליק את מודבקת תלושי רקמות איגוף, עם וזלין מינימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים טיפת שמן מטרה אישית קרגיל עם מקדם שבירה של 1.3379 (אם אתה משתמש HL-6) על coverslip העליון להעיף זה על הרכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את הרכבה רקמה על מיקרוסקופ בצד שלך שמן, לכיוון המטרה, ולמקד את המטרה שלך. הרכבה רקמת בתא זלוף שונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דבק coverslip 1.5 להקים הרצפה בחדר RC 20. מקם את רקמת בתא לפי RC-20 הוראות. השתמש חתיכת Nytex רשת במקום coverslip להקים גג החדר. </li></ol> חלק 5: תוצאות נציג: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Inside-out הכנה רקמות לנתיחה רצף: <img src="/files/ftp_upload/1154/fig1.jpg" alt="איור 1" /> W3 זחלים, שטף (פנוטיפ &quot;טאבי&quot;) (5.1.1). W3 זחלים, האחורי 2 פלחי גזור. אתה יכול לראות את שומן הגוף נדחף מתוך חלל הגוף על ידי טרנס גוף הלחץ קיר (חץ). נסו לצמצם את &quot;התפרצות&quot; הקרביים על ידי יצירת חור קטן בגוף ברגע קיר 1 לפני דיסקציה (5.1.2). הכנה עם הקרביים גזור לפני הפעלת הכנה ולפנים (5.1.3). הכנה, everted בעיקר, עם סיכה (חץ) בתוך לומן של הכנה (5.1.4). השריר הוא עכשיו מבחוץ לציפורן היא מבפנים, עם הגוף קצת שומן trachioles המצורפת (5.1.5). הכנת רקמות גזור באופן מלא עם הגוף כמעט כל שומן trachioles גזור (5.1.6). <img src="/files/ftp_upload/1154/fig2a.jpg" alt="דמות 2" width="600" height="200" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיים תיוג באמצעות אנטי HRP בבית NMJ הזחל. נציג W3 סינפסה הזחל עצב שריר עם סיומת גליה (מבפנים החוצה, הכנה). הנוירון המוטורי מסופי באוטון מסומנים עם ראשוני נגד הגוף מפני HRP (מג&#39;נטה), אשר מצומדות כדי Cy5. התהליכים גליה מסומנים עם GFP (ירוק). <img src="/files/ftp_upload/1154/fig2b.jpg" alt="דמות 3" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרחב Perisynaptic fluorescently דמיינו עם אלכסה 680 dextran בפנים החוצה הכנה. התהליך גליה (ירוק) מסומן עם GFP קרום ממוקדות. SSR הפוסט סינפטי על פני השריר (כחול) התווית dsRed. Dextran אלקסה (אדום) צורות מתרכז באזורים תאיים. לצבוע dextran צורות בריכות בצורת סופגנייה בחללים perisynaptic. תיוג dextran ו SSR שכותרתו dsRed יוצגו בגווני אפור. שים לב מרובים בצורת סופגנייה לצבוע בריכות המדגיש את החללים perisynaptic (חץ). </li></ol>

<ol>
	<li>Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+Vesicles:+Test+for+a+role+in+presynaptic+Calcium+regulation.">Synaptic Vesicles: Test for a role in presynaptic Calcium regulation.</a> J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).</li><li>Macleod, G. T., Hegstro, M., Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Calcium+signals+in+Drosophila+motor+neuron+terminals.">Fast Calcium signals in Drosophila motor neuron terminals.</a> J. Neurophysiology. 88, 2659-2663 (2002).</li><li>Morales, M., Ferrus, A., Martinez-Padron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+calcium-channel+currents+in+normal+and+csp+mutant+Drosophila+peptidergic+terminals.">Presynaptic calcium-channel currents in normal and csp mutant Drosophila peptidergic terminals.</a> Eur J Neurosci. 11, 1818-1826 (1999).</li><li>Stork, T., Engelen, D., Krudewig, A., Silies, M., Bainton, R. J., Kla&#168;mbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+Function+of+the+Blood&#8211;Brain+Barrier+in+Drosophila.">Organization and Function of the Blood&#8211;Brain Barrier in Drosophila.</a> J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).</li></ol>

הליך זה מאפשר לטווח ארוך הדמיה של חלבונים שכותרתו לחיות תהליכים בתא. הכנה ברקמות באתרו שתיארנו יש CNS שלם ומתפקד, PNS ומעגלים רפלקס. זו הכנה רקמה יש יתרונות על פני תקן הזחל שריר פרוטוקולים לעוף, שבו השריר הזחל קיר הגוף נמתח (כאשר הוא ניצח בחוץ). מתיחה יכול לעוות מורפו?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>HL-6: Artifical Drosophila hemolymph, with 5 mM L-glutamate added, and 2 mM Calcium.</td>
<td>Reagent</td>
<td>NA</td>
<td>NA</td>
<td>5 mM L-glutamate blocked muscle contractions. We used Molecular grade L-Glutamate (Sigma).
2 mM Calcium is close to physiological Calcium levels in natural larval hemolymph.
References: Macleod et al 2002 and Macleod 2004
</td>
</tr>
<tr>
<td>Dextran, Alex Fluor 680; 10,000 MW, anionic, fixable</td>
<td>Reagent</td>
<td>Molecular Probes/Invitrogen</td>
<td>D34680</td>
<td>Use a small volume perfusion chamber to keep the total volume of dye low</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-HRP-CY5 conjugate (goat)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Jackson ImmunoResearc</td>
<td>123-175-021</td>
<td>Dilute 2.0 mg into 1 ml ddH2O; aliquot into 4 microliter aliquots. Freeze at &#x2013;20C. Dilute one aliquot into 100 microliters of HL-6</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa 647 antibody labeling kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Molecular Probes/Invitrogen</td>
<td>A10475</td>
<td>We prepared a total of 80 micro liters of conjugated primary antibody, and stored as 2 microliter aliquots. We diluted each aliquot into 100 microliter of HL-6 for labeling.</td>
</tr>
<tr>
<td>Custom Formulated Objective Oil, refractive index 1.3379</td>
<td>Reagent</td>
<td>Cargill Labs</td>
<td>Custom Formulated</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra Fine Forceps</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tolls</td>
<td>11252-23 or 11295-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spring scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>91500-09</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra fine clipper scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15200-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Perfusion Chamber RC 20 Series</td>
<td>Tool</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>64-02222</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spinning Disc confocal</td>
<td>Microscope</td>
<td>Quorum</td>
<td>Quorum Wave FX</td>
<td>Mounted on a Leica DMI6000 Inverted Microscope</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualizing the live drosophila glial-neuromuscular junction with fluorescent dyes

הפרויקט שלנו זיהו מבנים GFP גליה שכותרתו בבית סינפסה בפיתוח לטוס הזחל neuromuscular. כדי להסתכל על ההתפתחות של עצב גליה-שרירים וסינפסות לחיות, פיתחנו הכנה רקמות הזחל כי היו תכונות של זחלים חיים שלמים, אך גם תכונות אופטיות טובות. זו הכנה החדשה אפשרה גישה של perfusates כדי הסינפסה. השתמשנו זחלי זבוב, טובל אותם hemolymph מלאכותי, רגוע הצירים הרגילים שלהם על ידי גוף קצבית מצמררת אותם. לאחר מכן ניתחנו את פלחי האחורי של כל חיה עם סיכה חרקים בוטה דחף את חלקי הפה לאחור דרך חלל הגוף. זה everted הקיר גוף הזחל, כמו הפיכת גרב מבפנים החוצה. סיימנו את דיסקציה עם Ultra-בסדר מספריים לנתיחה וחשוף ולכן הצד הקרביים של שרירי הגוף הקיר. המבנים גליה ב NMJ הביע GFP קרום ממוקד בשליטת היזמים ספציפי גליה. הממברנה הפוסט סינפטית, SSR (Reticula Subsynaptic) בשריר הביע ממוקד synaptically dsRed. היינו צריכים בחריפות התווית מסופי הנוירון המוטורי, החלק השלישי של הסינפסה. כדי לעשות זאת אנחנו מוחלים נוגדנים העיקרי HRP, מצומדות כדי flurophore מרחיקות אדום פולטות. כדי לבדוק תכונות דיפוזיה צבע לחלל perisynaptic בין מסופי הנוירון המוטורי ואת SSR, אנו ליישם פתרון של מולקולות גדולות dextran מצומדות כדי flurophore מרחיקות אדום פולטות ותמונות שנאספו.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes at JoVE.com

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

אנו תיאר תכונות מבניות של גליה-neuromuscular הסינפסות הכנה בתוך-out רקמת הרומן של זחלי זבוב חי באמצעות צבעי ניאון עם מיקרוסקופיה confocal. אנחנו שכותרתו מסופי נוירון לחיות עם נוגדנים העיקרי ניאון HRP, וגם דמיינו את החלל perisynaptic עם Dextrans ניאון.

לדמיין את חיים תסיסנית גליה-neuromuscular צומת עם צבעי ניאון

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

visualizing-live-drosophila-glial-neuromuscular-junction-with

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Biology

Unit 1

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Skeletal Muscle Relaxants

SCIENTISTS IN ACTION

10.7K Views.  University of British Columbia - UBC. אנו תיאר תכונות מבניות של גליה-neuromuscular הסינפסות הכנה בתוך-out רקמת הרומן של זחלי זבוב חי באמצעות צבעי ניאון עם מיקרוסקופיה confocal. אנחנו שכותרתו מסופי נוירון לחיות עם נוגדנים העיקרי ניאון HRP, וגם דמיינו את החלל perisynaptic עם Dextrans ניאון.

Video: Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

תיוג בתאי גזע עם צבעי ניאון על איתור פולשני עם דימות אופטי

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

הכנת תסיסנית עוברים Live-הדמיה באמצעות פרוטוקול Drop Hanging

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

תיוג של פלורסנט תסיסנית לב מבנים

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

לדמיין את הלב הפועם תסיסנית</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

Visualizing חיידקים בנמטודות באמצעות מיקרוסקופיה פלורסנט

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

חזותי תדר Stromule עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

מדידה בו זמנית של סידן מיטוכונדריאלי מיטוכונדריאלי ממברנה פוטנציאלית בתאים חיים באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents in the treatment of several diseases. The development of new, innovative strategies for miRNA/siRNA therapy is based on an extensive knowledge of the underlying mechanisms. Recent data suggest that small RNAs are exchanged between cells in a gap junction-dependent manner, thereby inducing gene regulatory effects in the recipient cell. Molecular biological techniques and flow cytometric analysis are commonly used to study the intercellular exchange of miRNA. However, these methods do not provide high temporal resolution, which is necessary when studying the gap junctional flux of molecules. Therefore, to investigate the impact of miRNA/siRNA as intercellular signaling molecules, novel tools are needed that will allow for the analysis of these small RNAs at the cellular level. The present protocol describes the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) microscopy to elucidating the gap junction-dependent exchange of miRNA molecules between cardiac cells. Importantly, this straightforward and non-invasive live-cell imaging approach allows for the visualization and quantification of the gap junctional shuttling of fluorescently labeled small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution. The data obtained by 3D-FRAP confirm a novel pathway of intercellular gene regulation, where small RNAs act as signaling molecules within the intercellular network.

Here, we describe the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) for the analysis of the gap junction-dependent shuttling of miRNA. In contrast to commonly applied methods, 3D-FRAP allows for the quantification of the intercellular transfer of small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution.

ניתוח של המעבר צומת הפער תלוי מירנה עם מיקרוסקופיה 3D-FRAP

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

חזותי ומעקב אחר mRNAs בשידור חי דרוזוסופילה מלאנוגסטר צ'יימברס

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...