שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות להתבוננות באותות מחלבונים פלואורסצנטיים אחרים או לשמש לאקסונים תמונה במבוגר אחר היתרון העיקרי של טכניקה זו להקל על שחזור תלת מימדי מעולה הדמיה של האקסונים ואת הסרבורים סופניים שלהם. התחל על ידי מילוי המספר המתאים של בארות בצלחת זכוכית רב באר עם 70% אתנול. השתמש במברשת כדי להוסיף 15 עד 20 זבובים הרדמה פחמן דו חמצני בכל גיל או מין לכל באר בעדינות לטבול את הזבובים לתוך האתנול עד שהם שקועים לחלוטין.
לאחר לא יותר מדקה אחת, יש לשטוף את הזבובים שלוש פעמים בתמיסת דטרגנט לא יונית למשך 10 דקות לפחות. לאחר הכביסה האחרונה, השתמש במטליות כדי להסיר את הראש והבטן של כל זבוב מבלי לפגוע בקטע בית החזה או ברגליים ולהשתמש בקצה של זוג מדפים עדין כדי להפעיל בעדינות אך בתקיפות לחץ על צומת coxa-thorax לנתק רגל אחת מקטע בית החזה. מניחים את הרגליים באר אחת של צלחת רב באר חדשה המכילה טרי מוכן 4% paraformaldehyde על קרח עבור דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס.
חשוב לדחוף את הרגליים בעדינות לתוך חיץ קיבוע מבלי לתת להם לצוף כדי לקבל רגליים קבועות היטב. למחרת, לשטוף את הרגליים חמש פעמים טרי 0.3% פתרון דטרגנט פעילי שטח לא יוני במשך 20 דקות לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, להחליף את חומר הניקוי עם מדיום הרכבה ולשמור את הרגליים במדיום הרכבה לפחות 24 שעות.
למחרת, להוסיף כ 20 microliters של 70% גליצרול ליד הקצה הציפוי של מגלשת מיקרוסקופ זכוכית לכסות את גליצרול עם 22 על ידי 22 מילימטר coverslip. לאחר מכן, להוסיף כ 10 קו microliter של מדיום הרכבה בצד ימין של coverslip ולהחיל קו שני 30 microliter של מדיום הרכבה בצד ימין של קו 10 microliter. בעזרת מדפים עדין, מעבירים רגל אחת מהצלחת הרב-בארית בירידה של מדיום לרצועת 10 מיקרוליטר של מדיום הרכבה בצד חיצוני למעלה או למטה.
חוזרים על הפעולה עד שש עד שמונה רגליים הורכבו ומיושרות וה מניחים כיסוי שני על הרגליים כך שהכיסוי השני נשען מעט על הכיסוי הראשון. לאחר מכן השתמש לק בכל פינה של coverslips כדי לאבטח אותם במקום. כדי לדמיין את הרגליים, השתמש בלייזר 488 ננומטר ושני גלאים בו זמנית כדי להגדיר את המסלול הראשון להשגת פלואורסצנטיות אוטומטית GFP ו- cuticle.
בחר יעד טבילת שמן של פי 20 עד 25 והגדר את הרזולוציה ל- 1024 על 1024 פיקסלים בעומק של 12 סיביות והגדר את המרווח למיקרומטר אחד. לטעון את השקופית על שלב המיקרוסקופ באמצעות כוח לייזר זהה עבור שני הגלאים, להתאים את הרווח של הגלאי הראשון כדי לקבל אות GFP בהיר ולהתאים את הגלאי השני כדי להבטיח כי אזורים מסוימים עם אות קוטיקל גבוה לייצר אות רווי בגלאי זה. לאחר מכן צלם את הרגליים באמצעות אפשרויות האריח או המיקום כדי ללכוד את הרגל כולה אם רגל מורחבת או גדולה מכדי שניתן יהיה לדמיין אותה במסגרת אחת.
לעיבוד תמונה, פתחו את מחסנית הקונפוקלים ב- ImageJ Fiji ולהשתמש בתוסף Bio-Formats כדי לפתוח תמונות שאינן בתבנית TIFF. לפיצול הערוצים, בחרו 'תמונה', 'צבע' ו'פיצול ערוצים'. כדי להחסיר את אות החיתוך מאות GFP, פתחו את 'מחשבון תהליך' ו'תמונה' ובחרו בערימה מהגלאי 1 כתמונה 1.
בחלון הפעולה, בחר חיסור ובחר את המסלול מהגלאי 2 כתמונה 2 כך שרק אות GFP אנדוגני יושג. השתמש בתמונה, ערימות, Z Protect כדי ליצור הקרנה בעוצמה מרבית עבור אות GFP אנדוגני. השתמש בפקדים בחלון בקרת הבהירות כדי לכוונן את הבהירות והחדות.
לאחר מכן צור עוצמה ממוצעת עבור קוטיקל, ואחריו תמונה, צבע, וערוצי מיזוג כדי למזג את מחסנית GFP בחזרה עם מחסנית קוטיקל בלבד שנרכש גלאי 2. זה יגרום תמונת RGB המורכב אות GFP ספציפי לרקמות, כמו גם אות קוטיקל כדי לעזור לזהות את arbors אקסון בתוך מקטעי הרגל. כדי להשתמש במאקרו, פתח את מחסנית הקונפוקל ולחץ על תמונה, כוונון ובהירות/חדות.
לאחר מכן לחץ על תוסף ועל הפעל מאקרו כדי להפעיל את המאקרו ובצע את ההוראות. כאשר התבקשו לציין את הפעולה בחלון מחשבון התמונה, בחרו תמונה אחת כמחסנית אחת. בחלון הפעולה, בחר חיסור.
בחר תמונה 2 כערימה 2. כאשר התבקשו להתאים את החדות, השתמשו בפקדים בחלון בקרת הבהירות כדי לכוונן את ניגודיות הבהירות של תמונת ההקרנה המקסימלית של GFP ואת ההקרנה הממוצעת של הקוטיקל כדי ליצור תמונה ממוזגת של RGB של שני האותות המציגים את ה- GFP בירוק ואת הקוטיקל באפור. לאחר מכן מזג את התוצאות של מחסנית אחת וערימה 2 כדי ליצור מחסנית GFP ו cuticle משולבת שניתן להשתמש בה בשלב הבא.
כדי להמחיש את הרגליים בשלושה ממדים, פתח את מחסנית RGB בתוכנה תלת-ממדית מתאימה. בחלון הדו-שיח המוקפץ, בחר את כל הערוצים במקטע המרת המצב והזן את גודל הווקסל שהתקבל מהניתוח הקודם. במודול ערוץ אחד, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר תצוגה וולרן.
ואז לחץ שמאלה על מודול Volren. במקטע מאפיינים, לחץ שמאלה על מתקדם ובחר DDR. לאחר מכן התאימו את ערך הגמא כדי לראות את רקע החיתוך.
במודול ערוץ 2, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר הצג Volren. לאחר מכן לחץ שמאלה על מודול Volren, לערוך ולבחור volrenGreen.col. באמצעות הליך זה, האות מן cuticle ניתן לשלב עם אות GFP כדי לזהות את המיקום של האקסונים בתוך הרגליים.
חשוב מאוד להשיג רגליים קבועות היטב. ברגליים קבועות כראוי, המבנים הפנימיים בתוך הרגליים הם בצבע אחיד ואת קנה הדרך, אשר כהים, גלויים. ברגליים קבועות בצורה גרועה, חומר כהה קיים בטרסוס ובטיביה ומערכת קנה הנשימה אינה נראית בבירור בעצם הירך ובקסה.
ההליך שתיארנו כאן מתגבר על האתגר של גילוי ביטוי פלואורסצנטי באקסונים נוירונים מוטוריים דרך קוטיקל פלואורסצנטי עבה ומותחת ברזולוציה גבוהה. אז אות פלואורסצנט נקי ומפורט שהושג מאפשר לנו לדמיין ולכומת את התכונה התלת מימדית של arbors אקסון באמצעות תוכניות הדמיה 3D. אז טכניקה זו תאפשר לנו להשתמש Drosophila למבוגרים כמודל לא רק כדי ללמוד את הפיתוח של נוירון מוטורי, אלא גם כדי ללמוד, כדי להבין את ההשפעה של מחלה ניוונית כגון ERAS על מערכת לוקומוטור משולב.
