Dieses Projekt wurde von der CIHR und NSERC finanziert. Wir möchten Barb Jusiak für einen Beitrag zur Schaffung der Fliege-Stämme, dsRed gekennzeichnet SSR (BJ Linie), und der UBC Bio-Imaging-Anlage bestätigen.

Teil 1: Tissue Vorbereitung <ol><li> Unser Ziel ist ein Gewebe Vorbereitung von Fliegenlarven, wo das Nervensystem intakt ist, aber die innere Oberfläche des Körpers Wand Muskel ist, um eine künstliche Hämolymphe ausgesetzt sind, und schließen kann, ein Mikroskop Deckglas für eine gute Optik positioniert werden. In anderen Worten, eine von innen nach außen Larven Vorbereitung. Da herkömmliche Gewebe Vorbereitungen Schneiden, Pinning und Dehnen des Körpers Wand Muskeln, und manchmal Entfernen eines Teils des Nervensystems beteiligt, mussten wir einen anderen Ansatz. Wir wollten die Tiere von innen nach außen, weil wir einen guten Blick auf strukturelle Merkmale und strukturelle Veränderungen im Laufe der Zeit in der Synapse zu bekommen wollte, und wir wollten immer das Nervensystem intakt. Wir wollten auch verhindern Dehnung der Gewebe und aktiviert Stretch-Rezeptoren, die die Muskeln zucken und ruinieren unsere Bilder würden. </li> <li> Für den Anfang Bühne der Tiere. Feeding dritten Larven und Wandering dritten Larven sind groß und leicht zu zerlegen, damit wir auf W3-Larven werden zu demonstrieren. Dieses Tier ist, hat die Tubby Phänotyp und breit ist, so ist es leicht, Evert. Wir haben nur Larven, die wir sahen, aktiv kriechen, einschließlich W3 Larven. </li><li> Reinigen Sie die Oberfläche eine Made mit einem sehr weichen Pinsel in einer Petrischale zweifach destilliertem H2O. Saubere Larven haben eine bessere Optik und Reinigung reduziert Bakterien. </li><li> Übertragen Sie die Tiere zu einer kleinen Petrischale von ca. 3 ml eiskaltem HL-6 und künstliche Hämolymphe. Setzen Sie die Schüssel auf Eis, bis das Tier nicht mehr bewegt und entspannt (ca. 5 Minuten). </li><li> Halten Sie sehr feine Spitze Pinzette in der einen Hand und Feder Schere in der anderen. Ich benutze die Schere mit meiner dominanten Hand. Machen Sie ein kleines Loch in die Wand des Körpers mit der Schere, um den Druck über den Körper Wand equlibrate. </li><li> Halten Sie das Tier vorsichtig mit der Pinzette auf den Boden der Schale und schneiden Sie die hinteren beiden Segmenten. Dissect entfernt die Eingeweide und fetten Körper wird wahrscheinlich ausziehen der Körperhöhle. Schneiden Sie dieses Gewebe auch. </li><li> Halten Sie die Larven gegen die Schale unten mit feinen Pinzetten. Halten Sie ein # 0 Insekt pin in (mit einem stumpfen Spitze) und drücken Sie es gegen die Mundwerkzeuge der Larven. Drücken Sie die Mundwerkzeuge durch die Körperhöhle wie Sie drehen eine Socke von innen nach außen sind. </li><li> Die von innen nach außen Gewebe wird wie in Abbildung aussehen: unten. Mit ultra-feinen Sezieren Werkzeug zerlegen das Fett Körper und trachioles aus dem Körper Wand. Schon sehr anstrengen, nicht auf die trachioles ziehen, oder trennen Sie das Nervensystem. Ripping die trachioles wird rip Löcher in die Wand des Körpers Muskeln. Entfernen Sie so viel Fett Körper, wie Sie können. Beide Strukturen stören die optische Qualität Ihres Gewebes. Vielleicht möchten Sie den Kaffee, bevor Sie diese Vorbereitung zu überspringen. </li> <li> Wenn Sie fertig sind die Muskeln werden transparent, nicht deckend oder weiß. Wenn Sie das Gewebe prep setzen in HL-6 ohne Glutamat, bei Raumtemperatur, wird es wahrscheinlich rhythmisch zusammenzuziehen, weil der Motor Pattern-Generatoren in das ZNS arbeiten. Vermeiden Sie die Verwendung preps mit offensichtlich vertraglich oder unregelmäßig kontrahiert Körperwand Muskel. Die intakte innen heraus Körperwand leicht dazu neigt, in der Hälfte entlang der dorsalen und ventralen Mittellinien falten, so dass die Vorbereitung gibt einen nach links oder rechts &quot;Hemi-Tier&quot; zu visualisieren. </li><li> 1,9 Montieren Sie die Gewebe entweder in einem kleinen Volumen Kammer für Handelssachen, wie die Warner Kammer oder einem Mikroskop-Objektträger mit einem Deckglas überbrückt Anordnung. Siehe Teil 3 für Vorschläge zur Montage Gewebe. </li></ol> Teil 2: Neuronale Bouton Markierung mit fluoreszenzmarkierten primären Antikörper gegen HRP. <ol><li> Setzen Sie 50 Mikro Liter fluoreszenzmarkierten primäre Anti-Körper gegen HRP in HL-6 in einem Tropfen auf eine Petrischale. Tauchen Sie die inside-out Körperwand prep in das Farbbad. Sie können Neuron Klemmenbezeichnung nach ca. 5 Minuten zu sehen, aber inkubieren für 10-20 Minuten, für eine vollständige und helle Beschriftung. </li><li> Spülen Sie den Farbstoff ab für 10-30 Sekunden in HL-6 bei Raumtemperatur. Nicht-gebundene Farbstoff spült schnell, so dass der Spülgang nicht brauchen werden aggressiv. </li><li> Variieren Sie die Farbstoffkonzentration und Inkubationszeit nach Bedarf. </li></ol> Teil 3: Perisynaptic Raum Markierung mit Dextran Fluorophor-Konjugat <ol><li> Verdünnen fluoreszierend konjugierte Dextran Farbstoff in HL-6 verdünnt. Eine Konzentration, die gut für unsere Zwecke gearbeitet wurde: </li><li> Wenn Sie nicht über den Zeitpunkt des Farbstoffs Zugang zu Ihren extrazellulären Raum betroffen sind, stellen eine 20 Mikroliter Tropfen Farbe auf einem &quot;überbrückt&quot; Deckglas (siehe Teil 4) und die Hinterlegung der Vorbereitung in das Farbbad. </li></ol> Teil 4: Montage des Gewebes für die Visualisierung (mit der konfokalen Mikroskopie). Wenn Sie nicht brauchen, um Ihre prep (kurze Beobachtungen) perfuse oder Sie wollen das Volumen des Badens HL-6 klein zu halten, verwenden Sie die doppelte überbrückt Dia-Methode Wenn Sie Ihre prep perfuse wollen, versuchen Sie, eine Perfusionskammer. Wir verwendeten eine modified Kammer von Warner Instruments. Details für beide folgen. Montage prep auf einer Doppel-verbrückten gleiten. <ol><li> Verwenden Sie einen sehr sauberen Objektträger. Sekundenkleber zwei quadratische, 18mm (# 1.5) Deckgläschen auf den Objektträger. Leave a 2 mm Abstand zwischen den Rändern der Deckgläser. </li><li> Lassen Sie den Kleber vollständig trocken, oder es wird eine seltsame Film über die wässrigen Medien rund um Ihre prep bilden. </li><li> Position innen heraus Larven zwischen den Rändern der Deckgläser. Möglicherweise müssen Sie die Vorbereitung auf eine diagonale Position, wenn die Larven ist groß und Ihre Bildaufnahme-System verfügt über eine begrenzte Pixel-Array. </li><li> Decken Sie die Gewebe mit einem # 1.5 Deckglas, 18mm (sehr sauber). Halten die &quot;top&quot; Deckglas der Folie angebracht Gewebe flankierenden rutscht, mit minimalem Vaseline. </li><li> Einen Tropfen Cargill eigene Ziel Öl mit einem Brechungsindex von 1,3379 (wenn Sie HL-6 verwenden) auf der Oberseite Deckglas und Flip dieser Versammlung über. </li><li> Position des Gewebes Montage an Ihrem Mikroskop, Öl Seite in Richtung des Ziels, und konzentrieren Sie Ihre Ziele. Montage des Gewebes in einer modifizierten Perfusionskammer. </li><li> Kleben Sie ein 1,5 Deckglas auf dem Boden in der RC 20 Kammer zu bilden. Position des Gewebes in der Kammer als je RC-20 Anleitung. Verwenden Sie ein Stück Nytex Mesh anstelle eines Deckglases, um ein Dach für die Kammer zu bilden. </li></ol> Teil 5: Repräsentative Ergebnisse: <ol><li> Inside-out Gewebeaufbereitung Dissektion Reihenfolge: <img src="/files/ftp_upload/1154/fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> W3-Larven, gewaschen (&quot;Tubby&quot; Phänotyp) (5.1.1). W3-Larven, posterior 2 Segmente zerlegt. Sie können sehen, fetten Körper aus der Leibeshöhle von trans-Körperwand Druck (Pfeil) gedrückt. Versuchen Sie, viszerale &quot;Ausbruch&quot;, indem sie ein kleines Loch in die Wand des Körpers 1 Minute vor ihrer Zerlegung (5.1.2) zu minimieren. Die Vorbereitung mit den Eingeweiden, bevor Sie die Vorbereitung von innen nach außen (5.1.3) seziert. Die Vorbereitung, meist umgestülpt, mit dem Stift (Pfeil) in das Lumen des prep (5.1.4). Der Muskel ist jetzt auf der Außenseite und die Kutikula ist auf der Innenseite mit etwas Fett Körper und trachioles befestigt (5.1.5). Ein voll seziert Gewebeaufbereitung mit nahezu allen fetten Körper und trachioles seziert (5.1.6). <img src="/files/ftp_upload/1154/fig2a.jpg" alt="Abbildung 2" width="600" height="200" /></li><li> Live-Kennzeichnung mit anti-HRP auf das Larvenstadium NMJ. Ein Vertreter W3 larvalen Nerv-Muskel-Synapse mit einer Glia-Erweiterung (von innen nach außen-prep). Der Motor Neuron bouton Terminals sind mit einem primären anti-Körper gegen HRP (magenta), die konjugiert Cy5 markiert. Die Glia-Prozesse werden mit GFP (grün) gekennzeichnet. <img src="/files/ftp_upload/1154/fig2b.jpg" alt="Abbildung 3" /></li><li> Perisynaptic Raum Fluoreszenz sichtbar gemacht mit Alexa 680 Dextran in einer von innen nach außen prep. Die Glia-Prozess (grün) ist mit der Membran gezielt GFP-markierten. Die postsynaptischen SSR auf den Muskel Oberfläche (blau) ist markiert mit DsRed. Das Alexa Dextran (rot) bildet konzentriert sich in extrazellulären Bereichen. Die Dextran Farbstoff bildet Donut geformte Pools in der perisynaptic Räume. Die Dextran Kennzeichnung und dsRed gekennzeichnet SSR sind in Graustufen dargestellt. Beachten Sie die vielen Krapfen geformt Farbstoff Pools Hervorhebung der perisynaptic Bereiche (Pfeil). </li></ol>

<ol>
	<li>Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+Vesicles:+Test+for+a+role+in+presynaptic+Calcium+regulation.">Synaptic Vesicles: Test for a role in presynaptic Calcium regulation.</a> J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).</li><li>Macleod, G. T., Hegstro, M., Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Calcium+signals+in+Drosophila+motor+neuron+terminals.">Fast Calcium signals in Drosophila motor neuron terminals.</a> J. Neurophysiology. 88, 2659-2663 (2002).</li><li>Morales, M., Ferrus, A., Martinez-Padron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+calcium-channel+currents+in+normal+and+csp+mutant+Drosophila+peptidergic+terminals.">Presynaptic calcium-channel currents in normal and csp mutant Drosophila peptidergic terminals.</a> Eur J Neurosci. 11, 1818-1826 (1999).</li><li>Stork, T., Engelen, D., Krudewig, A., Silies, M., Bainton, R. J., Kla&#168;mbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+Function+of+the+Blood&#8211;Brain+Barrier+in+Drosophila.">Organization and Function of the Blood&#8211;Brain Barrier in Drosophila.</a> J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).</li></ol>

Dieses Verfahren ermöglicht langfristige Darstellung von Live-markierten Proteine ​​und zelluläre Prozesse. Die in situ Tissue prep beschrieben wir eine intakte und funktionierende ZNS, PNS und Reflex-Schaltungen. Dieses Gewebe prep hat Vorteile gegenüber Standard-Larven fliegen Muskel-Protokolle, in denen die Larven Körperwand Muskel gedehnt (wenn es merken wird). Stretching kann verzerren synaptischen Morphologie und Trigger-Reflex basiert Kontraktionen. Unsere in-und auswendig prep war mechanisch sta...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>HL-6: Artifical Drosophila hemolymph, with 5 mM L-glutamate added, and 2 mM Calcium.</td>
<td>Reagent</td>
<td>NA</td>
<td>NA</td>
<td>5 mM L-glutamate blocked muscle contractions. We used Molecular grade L-Glutamate (Sigma).
2 mM Calcium is close to physiological Calcium levels in natural larval hemolymph.
References: Macleod et al 2002 and Macleod 2004
</td>
</tr>
<tr>
<td>Dextran, Alex Fluor 680; 10,000 MW, anionic, fixable</td>
<td>Reagent</td>
<td>Molecular Probes/Invitrogen</td>
<td>D34680</td>
<td>Use a small volume perfusion chamber to keep the total volume of dye low</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-HRP-CY5 conjugate (goat)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Jackson ImmunoResearc</td>
<td>123-175-021</td>
<td>Dilute 2.0 mg into 1 ml ddH2O; aliquot into 4 microliter aliquots. Freeze at &#x2013;20C. Dilute one aliquot into 100 microliters of HL-6</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa 647 antibody labeling kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Molecular Probes/Invitrogen</td>
<td>A10475</td>
<td>We prepared a total of 80 micro liters of conjugated primary antibody, and stored as 2 microliter aliquots. We diluted each aliquot into 100 microliter of HL-6 for labeling.</td>
</tr>
<tr>
<td>Custom Formulated Objective Oil, refractive index 1.3379</td>
<td>Reagent</td>
<td>Cargill Labs</td>
<td>Custom Formulated</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra Fine Forceps</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tolls</td>
<td>11252-23 or 11295-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spring scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>91500-09</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra fine clipper scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15200-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Perfusion Chamber RC 20 Series</td>
<td>Tool</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>64-02222</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spinning Disc confocal</td>
<td>Microscope</td>
<td>Quorum</td>
<td>Quorum Wave FX</td>
<td>Mounted on a Leica DMI6000 Inverted Microscope</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualizing the live drosophila glial-neuromuscular junction with fluorescent dyes

Unser Projekt identifiziert GFP-markierten Gliazellen Strukturen an der Entwicklung von Larven zu fliegen neuromuskulären Synapse. Um sich die Entwicklung von Live-Glia-Nerv-Muskel-Synapsen, entwickelten wir eine Larvengewebe Vorbereitung, die Features von Live intakten Larven hatte, sondern hatte auch gute optische Eigenschaften. Das neue Präparat auch für den Zugang von Perfusaten zur Synapse erlaubt. Wir verwendeten Fliegenlarven, eingetaucht in diese künstliche Hämolymphe, und entspannt ihre normale rhythmische Kontraktionen Körper durch Kälte ihnen. Als nächstes werden wir aus der hinteren Segmente der einzelnen Tiere seziert und mit einem stumpfen Insekten pin schob die Mundwerkzeuge rückwärts durch die Leibeshöhle. Diese umgestülpt die Larven Körper Wand, wie aus einer Socke von innen nach außen. Wir haben die Dissektion mit ultra-feinen Sezierung Schere und somit ausgesetzt der viszeralen Seite des Körpers Wand Muskeln. Die Glia-Strukturen an der NMJ ausgedrückt Membran gezielt GFP unter der Kontrolle von Glia-spezifische Promotoren. Die postsynaptischen Membran, die SSR (subsynaptischen Reticula) im Muskel ausgedrückt synaptisch gezielte dsRed. Wir mussten akut Etikett der Motor Neuron-Terminals, der dritte Teil der Synapse. Dazu wandten wir primäre Antikörper gegen HRP, konjugiert mit einem weit rot emittierenden Fluorophor. Zur Prüfung auf Farbstoffdiffusion Eigenschaften in die perisynaptic Raum zwischen den Motoneuronen-Terminals und der SSR, verwendeten wir eine Lösung der großen Dextran-Moleküle konjugiert weit rot emittierenden Fluorophor und sammelte Bilder.

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Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Wir beschriebenen strukturellen Merkmale der Glia-neuromuskuläre Synapsen in einem Roman Inside-out Gewebe Vorbereitung der Live-Larven unter Verwendung von fluoreszierenden Farbstoffen mit der konfokalen Mikroskopie. Wir gekennzeichnet leben Neuronenendigungen mit fluoreszierenden primären Antikörper gegen HRP und auch visualisiert die perisynaptic Raum mit fluoreszierenden Dextrane.

Visualisierung der Live- Drosophila Glial-neuromuskulären Synapse mit Fluoreszenzfarbstoffen

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

visualizing-live-drosophila-glial-neuromuscular-junction-with

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Pharmacology

Biology

Unit 1

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Skeletal Muscle Relaxants

SCIENTISTS IN ACTION

10.7K Aufrufe.  University of British Columbia - UBC. Wir beschriebenen strukturellen Merkmale der Glia-neuromuskuläre Synapsen in einem Roman Inside-out Gewebe Vorbereitung der Live-Larven unter Verwendung von fluoreszierenden Farbstoffen mit der konfokalen Mikroskopie. Wir gekennzeichnet leben Neuronenendigungen mit fluoreszierenden primären Antikörper gegen HRP und auch visualisiert die perisynaptic Raum mit fluoreszierenden Dextrane.

Serie: Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Forschung

Biologie

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

Fluoreszenzmarkierung Drosophila Herz Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Visualisierung des schlagenden Herzens in Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

Visualisierung Bakterien in Nematoden durch Fluoreszenzmikroskopie

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

Die Tomate / GFP-FLP / FRT Verfahren zur Live-Imaging von Mosaic Erwachsene<em&gt; Drosophila</em&gt; Sehzellen

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualizing Stromulus Frequenz mit Fluoreszenzmikroskopie

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents in the treatment of several diseases. The development of new, innovative strategies for miRNA/siRNA therapy is based on an extensive knowledge of the underlying mechanisms. Recent data suggest that small RNAs are exchanged between cells in a gap junction-dependent manner, thereby inducing gene regulatory effects in the recipient cell. Molecular biological techniques and flow cytometric analysis are commonly used to study the intercellular exchange of miRNA. However, these methods do not provide high temporal resolution, which is necessary when studying the gap junctional flux of molecules. Therefore, to investigate the impact of miRNA/siRNA as intercellular signaling molecules, novel tools are needed that will allow for the analysis of these small RNAs at the cellular level. The present protocol describes the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) microscopy to elucidating the gap junction-dependent exchange of miRNA molecules between cardiac cells. Importantly, this straightforward and non-invasive live-cell imaging approach allows for the visualization and quantification of the gap junctional shuttling of fluorescently labeled small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution. The data obtained by 3D-FRAP confirm a novel pathway of intercellular gene regulation, where small RNAs act as signaling molecules within the intercellular network.

Here, we describe the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) for the analysis of the gap junction-dependent shuttling of miRNA. In contrast to commonly applied methods, 3D-FRAP allows for the quantification of the intercellular transfer of small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution.

Analyse der Gap-Junction-abhängigen Übertragung von miRNA mit 3D-FRAP-Mikroskopie

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

Visualisierung und Verfolgung endogenes mRNAs in Live Drosophila melanogaster Eierkammern

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...