DE רוצה להודות לד&quot;ר הסתר Akutsu לשיתוף NT הטריקים שלו, ד&quot;ר סטפן סאליבן גארט Birkhoff על קריאה ביקורתית של הפרוטוקול.

הכנות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="jove_step" style=";text-align:right;direction:rtl"> תיאור מפורט של superovulation ותרבות העובר microdrop ניתן למצוא במקום אחר 2. </li><li class="jove_step" style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו צלחת פטרי עם microdrops של המדיום תרבות העובר (למשל KSOM, Chemicon). מכסים עם שמן מינרלי (שמן מינרלי קבוצות יש לבדוק תאימות עם תרבות העובר). לאזן ב 37 מעלות צלזיוס באוויר בתוספת 5% CO 2. (ב-Thermo Electron 3110 מים בחממה במעיל או שווה ערך) </li><li class="jove_step" style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת עבור בידוד של ביציות: טיפות המקום hepes שנאגרו CZB &amp; hyaluronidase (0.1% w / v, Sigma) במחצית אחת צלחת ו HCZB במחצית השנייה. מכסים עם שמן מינרלי. שמור את המנה החמה על הבמה סוער של מיקרוסקופ לנתיחה. </li><li class="jove_step" style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המיקרוסקופ: מקום פיפטה החזקת בקוטר חיצוני של כ 50 מ &#39;μ (מעט קטן יותר מאשר קוטר של הביצית) ולאחר הפתיחה של כ 20 מ&#39; μ בעריסה one פיפטה. Pipettes אחזקות קל לעשות עם הציוד הדרוש, מחט חולץ (סאטר מכשירים) ו microforge (Narishige), אך הם עשויים גם להיות שנרכשו Humagen. טען 3-5 l כספית μ לזנב של micropipette (קוטר פנימי 8 מ μ). הימנע נשפך כספית. להכין צלחת עם כמה טיפות קטנות של 11% כל אחד w / v PVP (polyvinylpyrrolidone) ב HCZB ו 5 μ g / ml cytochalasin ב &#39;HCZB. השתמש מכסה של צלחת פטרי ולא את המנה עצמה המכסה יש שפה קצר כי לא יתערב עם התנועה של החזקת ואת pipettes enucleation. יישר את פיפטה מחזיקה את פיפטה enucleation לירידה HCZB. לשאוב HZCB מעט לתוך קצה פיפטה מחזיקה. </li><li class="jove_step" style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת התאים התורם תלוי בעיקר בסוג התא הניסוי החוקר מתכוון לבצע. באופן כללי, התאים התורם צריך להיות מטופלים עם אנזים פרוטאוליטי כגון טריפסין ושמר על קרח כדי להפחית את הדביקות עד ההעברה. </li><li class="jove_step" style=";text-align:right;direction:rtl"> הומני להרדים עכברים 14-15 שעות לאחר מתן של hCG. קציר oviducts ולנתח אותם ב-HCZB hyaluronidase טיפות חמות. לאחר כ. 5 דקות, ביציות יהיו חופשיים בעיקר מתאי קומולוס. הם צריכים ואז לשטוף מספר פעמים HCZB, שטף אז נוספת מראש equilibrated טיפות KSOM, והמשיך בחממה עד enucleation. </li></ol> Enucleation מניפולציות נעשות עם micromanipulators הידראולי, (Narishige) על מיקרוסקופ הפוכה, כגון ניקון TE200. Micromanipulator piezo (Primetech) משמש לקידוח pellucida zona. שקצהו שטוח enucleation ו pipettes העברת ניתן לרכוש Humagen. נקו לשמן את פיפטה enucleation את טיפות PVP ידי גירוש טיפות כספית מיקרוסקופיים ידי aspirating וגירוש PVP. כדי למנוע את הדביקות של המחט, ההליך אותו יש לעשות בין כל קבוצה של ביציות, כי הם enucleated או הועברו. מקום קבוצה קטנה של ביציות לתוך הירידה ב-HCZB cytochalasin. גודל הקבוצה צריך להיות מותאם לרמת הניסיון של החוקר. ביציות לא צריך להיות כל הזמן על הבמה יותר מ 20-30 דקות. הזזת מכשירים HCZB-B cytochalasin טיפות. פיפטה מחזיקה את פיפטה enucleation צריך להביא לכדי היערכות עם קו המשווה של הביצית. זה יהיה אפשרי אם פיפטה מחזיק בעל קוטר חיצוני כי הוא מעט קטן יותר הביצית עצמה. סיבוב הביצית עד ציר metaphase השבירה אחרת ניתן לראות. אם מתחיל לא יכול לראות את ציר, הצלחת metaphase ניתן לזהות באמצעות לצבוע DNA Hoechst תאורה UV, עם זאת, כי אינה תואמת ההתפתחות העוברית יעיל. מקם את ציר metaphase ב 03:00 והחזק אותו היטב עם פיפטה מחזיקה. החל פולסים piezo לחדור pellucida zona. גע צלחת metaphase עם פיפטה enucleation. לאחר התנגדות של ציר metaphase יכול להיות &quot;הרגיש&quot;, לשאוב ציר ולמשוך את המחט. הציטופלסמה היא נוזל הביצית, ציר metaphase אולם מהלכים כמו גוש כאשר נגע עם פיפטה. נסו להפחית את כמות הציטופלסמה כי יוסר עם ציר. אחרי קבוצה של ביציות כבר enucleated, לשטוף אותם באמצעות מדיום תרבות העובר ולהכניס אותם לתוך החממה עד ההעברה. כמה ביציות enucleated לא צריך להיות מועבר אך צריך להיות מופעל לשמש מלאה עבור enucleation. ביציות אלו שבר בתוך כמה שעות, המציין enucleation מוצלח. העברת גרעיני המקום התאים לתוך פתרון PVP (11% ב PVP HCZB). אם לעצור שיבוטים רבים בשלב 1-התא, ריכוז PVP צריך להיות הוריד ל 5% או פחות. מערבבים היטב תאים שנינותשעות PVP. איסוף תאים עם טפטפת בקוטר פנימי מעט קטן יותר מאשר קוטר של התא. הממברנה של התא צריך לשבור על השאיפה. במקרים מסוימים, גירוש חוזרות השאיפה כמו גם את היישום של פולסים עדין piezo ניתן להשתמש כדי לשבור את התא התורם. ירידה חדשה של תאים התורם צריך להיעשות עם כל קבוצה של ביציות המועברים, כמו תאים התורם להיות דביק לאחר זמן מה. להזריק את התא התורם שבור זמן קצר לאחר שבירת הממברנה. עבור ההעברה, להתמקד קו המשווה של הביצית עצמה ולא את המטוס המשווני של pellucida zona, ולמקם את ההעברה פיפטה מחזיקה באותו המטוס. החזק את הביצית כולל חלק בציטופלסמה שלה בנחישות. לחדור pellucida zona באמצעות פולסים piezo. תביאו את גרעין התורם אל קצה פיפטה, ואז לדחוף את קצה פיפטה כמעט בצד השני של הביצית enucleated, קרוב פיפטה מחזיקה, מה שהופך תלם עמוק בתוך הביצית. לשאוב כמות קטנה מאוד של הציטופלסמה לתוך הביצית פיפטה, להחיל הדופק יחיד חלש piezo לשבור את קרום הביצית, להוציא את הגרעין התורם, לשלוף את המחט במהירות תוך aspirating על הממברנה cytoplasmic בקצה הימני של התלם. בו זמנית על ידי משיכת המחט aspirating, זה צריך להיות אפשרי כדי לסגור את החור שהותירו NT. זה &quot;הסרת טכניקה חור תפחית את מספר ביציות כי lyse במהלך NT. שטפו את ביציות לשחזר KSOM ולהחזיר אותם בחממה במשך שעות 1-3. הביצית הפעלה הכן חצי צלחת עם טיפות MCZB סידן חופשי את החצי השני עם טיפות של סידן MCZB חינם פלוס 10mm Sr 2 + ו - 5 μ g / ml cytochalasin B לעכב שחול הגוף הקוטב. לאזן למשך 30 דקות. לפי 5% CO 2 באוויר. לשטוף היטב עוברים NT-MCZB סידן חינם ולאחר מכן למקם אותם בקבוצות קטנות בטיפות שונות של MCZB-סידן חופשי. מחזירים את המנה אל האינקובטור והתרבות של 5-6 שעות. כדי לשלוט על פרוטוקול ההפעלה מלאכותיים התנאים תרבות העובר, ללא enucleated ביציות יש להשתמש. הם יפתחו כמו עוברי parthenogenetic. לאחר ההפעלה, לשטוף את עוברי דרך עוברי KSOM מקום בחממה לתרבות לטווח ארוך. Pronuclei צריך להיות גלוי בנקודה זו בזמן, המעיד על העברת מוצלח. תרבות העובר מדיה Cookbook מאסטר מלחים התחילו עם 980 מ&quot;ל ultrapure H 2 O בבקבוק 1 ליטר סטרילית הוספת מרכיבים יבשים: NaCl 4760 מ&quot;ג (81 מ&quot;מ) סיגמא S-5886 KCl 360 מ&quot;ג (5mm) סיגמא P-5405 MgSO 4 • 7H 2 O 290 מ&quot;ג (1.18mM) סיגמא M-2773 KH 2 PO 4 160 מ&quot;ג (1.17mM) סיגמא P-5655 EDTA 2NA 40 מ&quot;ג (0.1mm) סיגמא E-6635 (ד) 1000 מ&quot;ג גלוקוז (5.5mm) סיגמא G-6152 הוספת רכיבי נוזלי Na-חומצת חלב (חומצה לקטית) 5.3 מ&quot;ל &amp; nbsp; Sigma 44263 Pen&#39;Strep 10 מ&quot;ל Gibco 15140-122 עבור מלחים MCZB במלאי: סנן לעקר 500 מ&quot;ל מלחי מאסטר (טוב 3-4 חודשים; חנות ב 4 ° C) עבור מלחים HCZB במלאי: התחל עם 500 מ&quot;ל מלחי מאסטר הוסף 50 מ&quot;ג PVA (קר מסיסים; Sigma P-8136) מערבבים במשך 30-60 דקות ועקר המסנן (טוב במשך 3 חודשים; חנות ב 4 ° C) Ca + + חינם MCZB (להפעלת ביציות של 5% CO 2) התחל עם 99 מ&quot;ל מלחי MCZB מניות הוספת מרכיבים יבשים: NaHCO 3 211 מ&quot;ג Sigma S-5761 Na-pyruvate (חומצה pyruvic) 3 מ&quot;ג Sigma P-4562 L-גלוטמין 15mg Sigma-G-8540 שור בסרום אלבומין (BSA) 500 מ&quot;ג Sigma A-3311 מערבולת עד כל הרכיבים מומס, מסנן סטרילי. HCZB (עבור המיקרומניפולציה באווירה הסביבה) התחל עם 99 מ&quot;ל מלחי HCZB מניות הוספת מרכיבים יבשים: Hepes Na-520 מ&quot;ג Sigma H-3784 NaHCO 3 42 מ&quot;ג Sigma S-5761 הוספת רכיבים נוזליים: 128 mM CaCl 2 (18.8g / l) 1 מ&quot;ל Sigma C-7902 התאם ל-pH 7.5 עם 1 N HCl מערבולת עד מומס, מסנן סטרילי.

<ol>
	<li>Eggan, K., Jaenisch, R., Pease, S., Lois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mammalian and Avian Transgenesis- New Approaches. , (2006).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R., Press, C. S. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo. , (2003).</li><li>Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-term+development+of+mice+from+enucleated+oocytes+injected+with+cumulus+cell+nuclei.">Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei.</a> Nature. 394, 369-374 (1998).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

מזל טוב!

אנא בדוק קומפוזיציות מאגרים נוספים בחלק פרוטוקול.

nuclear transfer into mouse oocytes

העברת הגרעין אל תוך הביצית מופרית ניתן לשחזר את הפוטנציאל ההתפתחותי לתא מובחן. זה מוכיח כי התהליכים הבסיסיים, פיתוח הבחנה והזדקנות הם epigenetic ולא תהליכים גנטיים. הפיכות של תהליכים אלה פותחת אופקים מרגש במחקר בסיסי, ובעתיד הרחוק יותר, ברפואה רגנרטיבית. בשנת העכבר, בתאי גזע עובריים ניתן לגזור מעוברים משובטים preimplantation הבמה. אלה בתאי גזע עובריים יש את היכולת להצמיח את כל סוגי התאים של האורגניזם הבוגר. חשוב לציין, התאים האלה זהים מבחינה גנטית לתורם. אם החלים על האדם, זו תאפשר גזירת בתאי גזע מחולה. תאים אלה ניתן יהיה סוג מובחן לתוך התא הפגוע של החולה ולמד במבחנה, או להשתמש בו כדי להחליף תאים פגומים או חסרים. המחקר של העברת גרעיני העכבר נשאר חשוב כפי שהוא יכול להודיע ​​לנו על עקרונות תכנות מחדש של גרעיני. זה סרט המלווה את הפרוטוקול נועדו לסייע למידה העברת גרעיני העכבר, שיטה שפותחה לראשונה בקבוצה של פרופ &#39;Yanagimachi (וואקאיאמה et al. 1998).

Watch this Scientific Journal Video about Nuclear Transfer into Mouse Oocytes at JoVE.com

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

הסרט הזה ואת פרוטוקול נועדו לסייע למידה העברת גרעיני.

העברת גרעין לתוך ביציות עכבר

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Research

JoVE Journal

Biology

17.7K Views.  Harvard. הסרט הזה ואת פרוטוקול נועדו לסייע למידה העברת גרעיני.

Video: Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Retrieval of Mouse Oocytes

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus Genetic Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), we are characterizing the salient differences needed to develop this system.  A primary goal has been to optimize oocyte/early embryo retrieval.

This protocol illustrates the technique for extracting oocytes or early-stage fertilized embryos from the oviduct of mice. The ability to identify the infindibulum and insert a blunt end needle into it is essential to correctly performing the procedure.

איחזור של ביציות עכבר

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

איסוף cryopreservation של ביציות ועוברים אוגר עכבר

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

הדמיה ב-RNA לוקליזציה Xenopus ביציות

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

הפריה של Xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Direct Tracheal Instillation of Solutes into Mouse Lung

Intratracheal instillations deliver solutes directly into the lungs. This procedure targets the delivery of the instillate into the distal regions of the lung, and is therefore often incorporated in studies aimed at studying alveoli. We provide a detailed survival protocol for performing intratracheal instillations in mice. Using this approach, one can target delivery of test solutes or solids (such as lung therapeutics, surfactants, viruses, and small oligonucleotides) into the distal lung. Tracheal instillations may be the preferred methodology, over inhalation protocols that may primarily target the upper respiratory tract and possibly expose the investigator to potentially hazardous substances. Additionally, in using the tracheal instillation protocol, animals can fully recover from the non-invasive procedure. This allows for making subsequent physiological measurements on test animals, or reinstallation using the same animal. The amount of instillate introduced into the lung must be carefully determined and osmotically balanced to ensure animal recovery. Typically, 30-75 &mu;L instillate volume can be introduced into mouse lung.

Intratracheal instillations deliver solutes directly into the lungs. This procedure targets the delivery of the instillate into the distal regions of the lung, and is therefore often incorporated in studies aimed at studying alveoli. We provide a detailed survival protocol for performing intratracheal instillations in mice.

החדרה ישירה של קנה הנשימה אל הריאות מומסים עכבר

Intratracheal instillations deliver solutes directly into the lungs.  This procedure targets the delivery of the instillate into the distal regions of the ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

ין העברת לעוברי עוף מבוגרים יותר על ידי<em&gt; לג&#39;ימי לשעבר</em&gt; Electroporation

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...

Utero-tubal Embryo Transfer and Vasectomy in the Mouse Model

The transfer of preimplantation embryos to a surrogate female is a required step for the production of genetically modified mice or to study the effects of epigenetic alterations originated during preimplantation development on subsequent fetal development and adult health. The use of an effective and consistent embryo transfer technique is crucial to enhance the generation of genetically modified animals and to determine the effect of different treatments on implantation rates and survival to term. Embryos at the blastocyst stage are usually transferred by uterine transfer, performing a puncture in the uterine wall to introduce the embryo manipulation pipette. The orifice performed in the uterus does not close after the pipette has been withdrawn, and the embryos can outflow to the abdominal cavity due to the positive pressure of the uterus. The puncture can also produce a hemorrhage that impairs implantation, blocks the transfer pipette and may affect embryo development, especially when embryos without zona are transferred. Consequently, this technique often results in very variable and overall low embryo survival rates. Avoiding these negative effects, utero-tubal embryo transfer take advantage of the utero-tubal junction as a natural barrier that impedes embryo outflow and avoid the puncture of the uterine wall. Vasectomized males are required for obtaining pseudopregnant recipients. A technique to perform vasectomy is described as a complement to the utero-tubal embryo transfer.

Utero-tubal embryo transfer uses the utero-tubal junction as a barrier to prevent the embryo outflow that may occur when performing uterine transfer. Vasectomized males are required to obtain pseudopregnant recipients for embryo transfer. Both techniques are discussed.

העברת רחם-תובל עובר ועיקור במודל העכבר

The transfer of preimplantation embryos to a surrogate female is a required step for the production of genetically modified mice or to study the effects ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

מדידת נזק לדנ&quot;א ותיקון בSplenocytes העכבר לאחר כרוני<em&gt; In vivo</em&gt; חשיפה למינונים נמוכים מאוד של בטא וגמא-קרינה

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...