עבודה זו נערך במעבדה שולץ ריצ&#39;רד מ &#39;s. המחברים רוצה גם להודות מיכאל לאמפסון על המשגה של assay-centromere לספור גישה מיקרוסקופ confocal שלו. תרזה צ&#39;אנג ופרנצ&#39;סקה דאנקן סייע אופטימיזציה של assay centromere-הספירה. פאולה שטיין נתמך על ידי HD022681 (כדי RMS) וקארן שינדלר נתמך על ידי HD055822.

1. הביצית עכבר אוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למקסם את מספר הזקיקים antral מבודד כל עכבר, intraperitoneally להזריק נקבות עכברים בוגרים מינית (אנו משתמשים 6 שבועות בן CF-1 עכברים מן הארלן) עם 5 IU של נסיוב סוסה בהריון של גונדוטרופין (PMSG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את אוסף בינוני (ממ / PVP) (3 מ&quot;ל / עכבר) על ידי הוספת milrinone עד 2.5 מיקרומטר וחם אותו 37 ° C. Milrinone הוא מעכב phosphodiesterase המקיימת מעצר meiotic פעם ביציות יוסרו זקיקים. לחילופין, 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) (0.2 מ&quot;מ) או dibutyryl-monophosphate מחזורי אדנוזין (dbcAMP) (100 מיקרוגרם / מ&quot;ל) יכול לשמש. הכן את המדיום התרבות ידי הוספת גלוטמין (1 מ&quot;מ) milrinone (2.5 מיקרומטר) ל 1 מ&quot;ל של CZB ולאפשר לו לאזן בחממה במשך שעה לפחות. הגדרת microdrops של כל צלחת פטרי עם שכבת שמן מינרלי. המנה CZB מושם לתוך החממה בעוד צלחת ממ / PVP נשאר בחוץ בשקופית חם. אוסף אחרים בינוני תרבות כי הם זמינים מסחרית (M2 ו M16 מן התקשורת מיוחדים או סיגמא) גם בשימוש שגרתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 48 שעות לאחר PMSG תחול, להקריב את העכבר באמצעות CO 2 הרגעה בעקבות נקע בצוואר הרחם, השחלות לנתח ולהכניס אותם לתוך watchglass המכיל מראש חימם ממ / PVP + milrinone (ממ / PVP + M). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק אינסולין 1 מ&quot;ל, לעגן את השחלות כדי בצלחת ולשחרר את זקיקי antral על ידי ניקוב אותם מספר פעמים עם מד-27 (או תפירה) מחטים כי הם מהודקים יחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד להביט דרך מיקרוסקופ לנתיחה, לאסוף קומולוס-הביצית מתחמי באמצעות הפה המופעלים פיפטה מזכוכית. זה עוזר לי מיקרוסקופ עם הרבה ניגודיות. לחלופין, המדיום המכיל את רקמות תאים ניתן pipetted על מכסה של צלחת פטרי מפלסטיק. רק לאסוף גדול, זקיקי antral ולא קטן מראש antral זקיקים או ביציות הערומים. אסף פעם, כדי להעביר את מתחמי microdrop של ממ / PVP + M זה בשקופית חם תחת שמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה קטנה (מעט גדול יותר מאשר קוטר של הביצית), פיפטה במעלה ובמורד מתחמי לנתק את התאים קומולוס. מעבירים את ביציות הערומים עם טפטפת לתוך microdrop גדול של CZB + milrinone (CZB + M) ומקום בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר ביציות להתאושש במשך שעות לפחות 1 בחממה לפני מניפולציה. </li></ol> 2. הביצית microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את pipettes הזרקת ידי משיכת בורוסיליקט זכוכית צינור נימי ב חולץ מכני. אנו משתמשים Flaming-micropipette חולץ בראון (דגם P-97) עם ההגדרות הבאות: P = 500, חום = 300, משוך = 150, לוול ךיב = 100, זמן = 150. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו את הפלטפורמה microinjection ידי הצבת ירידה של 5 μl ממ / PVP + M קרוב ככל האפשר לירידה 0.5 μl של חומר הזרקה של בחירה (למשל siRNA, קרנה, oligonucleotide morpholino, וכו &#39;) בשקופית 1-גם תא זה יש את תא התקשורת יוסרו. מכסים עם שמן מינרלי מקום על הבמה מיקרוסקופ (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום ההזרקה pipettes מחזיק לתוך מחזיקי ואת המיקום לתוך ירידה של ממ / PVP + M. הפעל את הטנקים חנקן המחוברים picoinjector ואנטי רטט השולחן. פתח את קצה פיפטה את הזריקה בעדינות על ידי הקשה עליו מפני פיפטה מחזיקה בעוד ממלא אותו בינוני. אם הפתח גדול מדי, המדיום יעברו פנימה והחוצה במהירות המחט יהרוג את התא. Pipettes עם קטן מדי של פתיחת לעתים קרובות להדביק בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ביציות (10/05) מן החממה עד טיפת ממ / PVP M + על הרציף. לפני הזרקה, ההתקנה picoinjector. אנו משתמשים בפרמטרים הבאים על picoinjector שלנו (דגם PLI-100 מהרווארד Apparatus): PBal = 2.5-3.5 psi, PInj = 7.8 psi, PClear = 10-12 psi, זמן = -3. התוצאה היא נפח זריקה של PL 5-10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד לחיצה שקוף, להעביר את המזרק עד טיפת חומר מילוי. להחזיר אותו טיפה הבינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה מחזיקה ללכוד הביצית וליישר את מחט הזריקה, הביצית ו פיפטה מחזיק לאורך ציר ה-x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת הגדלה גבוהה, לקדם את פיפטה הזרקה באמצעות הביצית להיות זהיר, כדי למנוע את הגרעין. לאחר הממברנה הפלסמטית היא פירסינג, לחץ להזריק. לאחר ההזרקה, למשוך את המחט. שחרור הביצית וחזור. לאחר כל ביציות מוזרקים, להחזיר אותם בחממה. תחזיק ב CZB + M בסכום הרצוי של זמן; הפעם תלוי במטרה הניסוי (כלומר siRNA ו מציאה morpholino (עד 24 שעות), overexpression (3-12 שעות)). שים לב incubations יותר מ 24 שעות תתפשר התבגרות meiotic. </li></ol> 3. הביצית הבשלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה לשטוף את ביציות באמצעות מספר טיפות של CZB (בינוני התבגרות) והעברה microdrop של המדיום התבגרות תחת שמן מקום בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר 16 שעות עבור t הבשלה מלאה<html> o metaphase של המיוזה השנייה. </li></ol> 4. Ploidy ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן CZB + monastrol (100 מיקרומטר) ומקום 750 μl לתוך הבאר של צלחת איבר תרבות כי יש מים בטבעת החיצונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ביצים באמצעות מספר טיפות של CZB + monastrol ולהעביר אותם לתוך צלחת התרבית איברים. מקום בחממה עבור ח 1 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הביצים על ידי העברת אותם watchglass המכיל paraformaldehyde 2% PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. העברת לתוך watchglass אחר עם חסימת פתרון. מנה זו ניתן לאחסן על 4 מעלות צלזיוס עד מעובד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה פתרון permeabilization (PBS + 0.3% + BSA TritonX-100 0.1% + 0.02% NaN 3) ב watchglass במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף באמצעות כמויות גדולות של מספר חסימת פתרון (PBS + 0.3% + 0.01 BSA Tween-20 + NaN 0.02% 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שאר ההליך מבוצע על מכסה של צלחת 96-היטב בתא humidified בטמפרטורת החדר המוגן מן האור. טיפות (~ 25 μl) ממוקמים בתוך החריצים מעגלית. העברת ביצים לחסימת פתרון במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי תווית centromeres, ביצים להעביר ירידה של פתרון חסימת המכיל CREST אנטי סרום בשעה 01:40. דגירה של לפחות 1 ח לשטוף באמצעות 3 טיפות של תמיסת חסימה, דוגרים 15 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ביצים ירידה של פתרון חסימת המכיל Cy5 או Alexa-פלואוריד-594-מצומדות אנטי אנושי IgG (1:200) ו דגירה עבור 1h. חזור על הצעדים לעיל כביסה למעט השלב האחרון, כולל Sytox הירוק (1:5,000) בפתרון חסימת לזהות כרומוזומים. הר ב μl 5 של Vectashield. כדי למנוע ריסוק של הביצים, לשים 4 נקודות קטנה של וזלין בפינות היכן coverslip יהיה. מניחים coverslip על גבי חותמת עם לק. חנות בתוך קופסת שקופיות על 4 מעלות צלזיוס עד עיבוד באמצעות מיקרוסקופיה confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הדמיה עם מטרה 100x, ללכוד 0.4 מיקרומטר צעדים במישור-Z ואת התמונה של האזור כולו ציר metaphase. הרוזן centromeres באמצעות תוכנת הדמיה כגון תמונה J (NIH). </li></ol> 5. נציג תוצאות: איור 2 הוא השלכה Z-מביצית euploid. בשלב metaphase של MII, ביצים euploid עכבר מכילים 20 זוגות של כרומוזומים, ולכן יש 40 centromeres. מדי פעם הכרומוזומים להיכשל להפיץ למרות הטיפול monastrol. מצב זה מקשה על ספירת centromeres אמין ולכן אנו לא כוללים את הביצים הניתוחים שלנו. מדי פעם, יכול להיות אתגר כדי לקבוע אם CREST-immunoreactive &quot;כתם&quot; היא 1 או 2 centromeres. שימוש בתוכניות כגון J תמונה שימושית כי אפשר לנתח כל Z-סעיף תוך הקפדה לציין את הכיוון של כרומוזומים, מספר סעיפים בו &quot;כתם&quot; היא לאתר את עוצמת הפיקסל &quot;נקודות&quot; יש. בהתאם שבו ציר meiotic ממוקם ביחס לגוף קוטב, אזורים של DNA יכולים לחפוף אלה דגימות לא צריך להיכלל בניתוח. Unmanipulated, בביצים הביוץ vivo מעכברים reproductively צעירים יש שיעור נמוך של aneuploidy (~ 1-2%). עם זאת, מסיבות לא מובנות, microinjection ובשיטות חוץ גופית ההתבגרות יכולים להגדיל את זה כלפי מעלה בשיעור של 10%. לכן, זה קריטי, כי ביציות לשלוט מוזרק כלולים בכל מחקר microinjection. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. צלחת Microinjection להגדיר. שקופית קאמרית עם 5 טיפות של μl ממ / PVP + M מעל 0.5μl טיפות של תמיסת ההזרקה. מכסים עם שמן מינרלי. בדוגמה זו יש 3 טיפות 3 פתרונות הזרקה שונים והחלק את יושב על הבמה של מיקרוסקופ. משמאל את המחט microinjection וימינה הוא פיפטה מחזיקה. שים לב שיש השתקפות של מחזיקי מחט. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. Ploidy התוצאות. Z-השלכה של ביצה euploid II metaphase. DNA הוא בצבע ירוק kinetochores נצבעים באדום. החיצים מצביעים על 2 זרועות chromatid ברורים המעידים כי kinetochores (# 17 ו # 18) חופפים. ביצים עכבר Euploid מכילים 20 זוגות kinetochore (40 בסך הכל &quot;נקודות&quot;). ביצה aneuploid היה להכיל כל וריאציה על המספר הזה. אם הליך זה נערכו על ביציות metaphase MI, יהיו 40 זוגות kinetochore (80 בסך הכל &quot;נקודות&quot;). <img src="/files/ftp_upload/2851/2851table1.jpg" alt="טבלה 1"/> טבלה 1. מתכון בינוני איסוף microinjection (ממ / PVP + M). כל החומרים העובר תרבות כיתה ו מבית סיגמא אולדריץ. סנן לעקר דרך 0.22μm מסננים PVDF (אנו משתמשים Stericups Milipore) ולאחסן ב 4 ° C. iles/ftp_upload/2851/2851table2.jpg &quot;alt =&quot; טבלה 2 &quot;/&gt; טבלה 2. מתכון בינוני CZB. כל החומרים העובר תרבות כיתה ו מבית סיגמא אולדריץ. סנן לעקר דרך 0.22μm מסננים PVDF (אנו משתמשים Stericups Milipore) ולאחסן ב 4 ° C.

<ol>
	<li>Hunt, P. A., Hassold, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science. 296 (5576), 2181-2181 (2002).</li><li>Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hum Mol Genet. 16 Spec No. 2, R203-R203 (2007).</li><li>Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Journal of reproduction and fertility. 86 (2), 679-679 (1989).</li><li>Schultz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Oogenesis and the control of meiotic maturation. , (1986).</li><li>Moore, G. P., Lintern-Moore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biol Reprod. 18 (5), 865-865 (1978).</li><li>Hodges, C. A., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chromosoma. 111 (3), 165-165 (2002).</li><li>Schindler, K., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Cycle. 8 (7), 1090-1090 (2009).</li><li>Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 20 (17), 1522-1522 (2010).</li><li>Mayer, T. U., Kapoor, T. M., Haggarty, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science. 286 (5441), 971-971 (1999).</li><li>Stein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2009 (1), pdb prot5135-pdb prot5135 (2009).</li><li>Stein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2009 (1), pdb prot5132-pdb prot5132 (2009).</li><li>Reis, A., Chang, H. Y., Levasseur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Cell Biol. 8 (5), 539-539 (2006).</li><li>Schuh, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell. 130 (4), 484-484 (2007).</li><li>Backs, J., Stein, P., Backs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (1), 81-81 (2010).</li><li>Schindler, K., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biol Reprod. 80 (4), 795-795 (2009).</li><li>Kudo, N. R., Wassmann, K., Anger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell. 126 (1), 135-135 (2006).</li><li>Shoji, S., Yoshida, N., Amanai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The EMBO Journal. 25 (4), 834-834 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Microinjection של ביציות היא שיטה חזקה ללמוד המנגנונים המווסתים התבגרות meiotic 10,11, 12, 13. שיטה זו מספקת דרך חסכונית לבחון השערות לפני ביצוע ההשקעה הגדולה בפיתוח מודלים עכבר מהונדס ממוקד. אוסף הביצית וטכניקות microinjection דורשים זמן רב יותר מאשר הורים נהלים ביולוגיה אופייני התא. מכשולים ספציפיים עם אוסף לעיתים קרובות כוללים שליטה על פיפטה בפה, מושך את פיפטה זכוכית בגודל מתאים לאיסוף הפשטה של ​​תאים סומטיים והגדלת מהירות אוסף כדי לצמצם את הזמן שבו ביציות הן מחוץ לחממה. מומלץ לתרגל פעמים רבות לפני ביצוע הניסויים. העברת ביציות בין microdrops תוך שמירה על אותו מספר של תאים היא דרך מצוינת להיות נוח עם שיטה זו. מוות של תאים נפוצה בזמן למידה microinjection. זה יכול לקרות מכמה סיבות, כולל הזרקת גדול מדי של אמצעי אחסון של חומר (כלומר פתיחת מחט הזרקה גדול מדי), להכות את הגרעין עם מחט הזריקה, פירסינג הצד הנגדי של הביצית או שהחומר המוזרק רעיל הביצית. תרגול עם הזרקה לתוך ביציות חיץ עד שיעור ההישרדות שלך היא לפחות 50% היא המפתח שליטה בטכניקה זו. אם ביציות אינם בשלים סביר להניח כי milrinone לא מדולל מספיק. אנו ממליצים על שטיפת ביציות באמצעות טיפות גדולות רבות CZB milrinone חופשי לפני ההבשלה. Microinjection ploidy בעקבות הניתוח היא אחת מבחני רבים להעריך התבגרות meiotic. ניתוח שגרתי אחר אנו משתמשים במעבדה כוללים מעקב אחר קינטיקה שבאמצעותו התקדמות ביציות דרך המיוזה, immunofluorescence לנתח את היווצרות ציר ויישור כרומוזום והפעלה ביצה או הפריה חוץ גופית על מנת להעריך את ההשלכות התפתחותיות של מניפולציה הביצית 14,15, 16, 17.

טבלה של חומרים כימיים מסוימים: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> Milrinone </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> M4659 </td><td> Resuspend ב DMSO ב 2.5mm </td></tr><tr><td> שמן מינרלי </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> M5310 </td><td> השתמש רק עובר במבחן, סטרילי, מסונן </td></tr><tr><td> CREST autoserum </td><td> Immunovision </td><td> HCT-0100 </td><td></td></tr><tr><td> Sytox גרין </td><td> Invitrogen </td><td> 57020 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי אלקסה 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A-11014 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> וקטור מעבדות </td><td> H-100 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Polysciences </td><td> 577773 </td><td></td></tr><tr><td> אלבומין בסרום שור מ </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> A3294 </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> Monastrol </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> M8515 </td><td> Resuspend ב DMSO ב 100mm </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 274348 </td><td></td></tr><tr><td> TritonX-100 </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> X-100 </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה של ציוד ספציפי: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> פומית </td><td> Biodiseno </td><td> MP-001-Y </td><td></td></tr><tr><td> Watchglass </td><td> מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים </td><td> 70543-30 </td><td></td></tr><tr><td> מזרק </td><td> BD </td><td> 309623 </td><td> 1ml, 27G 1 / 2 </td></tr><tr><td> 60 מ&quot;מ צלחת פטרי </td><td> בז </td><td> 351007 </td><td></td></tr><tr><td> זכוכית פסטר pipets </td><td> פישר מדעי </td><td> 13-678-200 </td><td></td></tr><tr><td> צד חם יותר </td><td> פישר מדעי </td><td></td><td> כל מודל סטנדרטי </td></tr><tr><td> Dissection מיקרוסקופ </td><td></td><td></td><td> כל מודל סטנדרטי </td></tr><tr><td> לשכת שקופיות </td><td> Nunc </td><td> 177372 </td><td></td></tr><tr><td> נימי Tubing </td><td> דראמונד </td><td> 1-000-0500 </td><td> microcaps </td></tr><tr><td> פיפטה פולר </td><td> Flaming-בראון micropipette חולץ </td><td></td><td> דגם P-97 </td></tr><tr><td> הפוך מיקרוסקופ </td><td> ניקון </td><td></td><td> כל מודל סטנדרטי </td></tr><tr><td> Micromanipulators </td><td> Eppendorf </td><td></td><td> כל מודל סטנדרטי </td></tr><tr><td> Picoinjector </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> דגם PLI-100 </td><td> כל מודל סטנדרטי </td></tr><tr><td> CO 2 טנקים </td><td></td><td></td><td> עבור חממה </td></tr><tr><td> N2 טנק </td><td></td><td></td><td> עבור שולחן מזרק </td></tr><tr><td> נגד רעידות השולחן </td><td> טכני ייצור </td><td></td><td> כל מודל סטנדרטי </td></tr><tr><td> מדגרה </td><td></td><td></td><td> כל מודל סטנדרטי </td></tr><tr><td> אחזקות pipettes </td><td> Eppendorf </td><td> 930001015 </td><td> Vacutip </td></tr><tr><td> Confocal מיקרוסקופ </td><td> לייקה </td><td></td><td> כל מודל סטנדרטי </td></tr><tr><td> Dissection כלים </td><td> המדע כלים פיין </td><td></td><td> כל מודל סטנדרטי </td></tr><tr><td> Humidified קאמרית </td><td></td><td></td><td> אנו משתמשים טאפרוור </td></tr><tr><td> ליד צלחת 96 טוב </td><td> Nunc </td><td> 263339 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ שקופיות </td><td> פישר מדעי </td><td> 12-544-3 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> תומאס מדעי </td><td> 6663-F10 </td><td> עובי ישתנו עבור מיקרוסקופים מסוים </td></tr><tr><td> מרכז תרבות איבר גם צלחת </td><td> פישר מדעי </td><td> 353037 </td><td> 60 X 15mm </td></tr></tbody></table>

mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment

טעויות הפרדה כרומוזום להוביל תאים aneuploid. בתאים סומטיים, aneuploidy קשורה לסרטן אך הגמטות, aneuploidy מוביל, הפלות פוריות או הפרעות התפתחותיות כמו תסמונת דאון. הגמטות הפלואידים טופס באמצעות מינים ספציפיים תוכניות התפתחותיות, כי הם מצמידים את המיוזה. החלוקה meiotic הראשון (MI) היא ייחודית כי המיוזה chromatids אחותה להישאר מחובר בזמן כרומוזומים הומולוגיים הם נפרדים. מסיבות לא מובנות לגמרי, חלוקה זו reductional נוטה שגיאות הוא הנפוץ יותר את מקור aneuploidy מאשר טעויות מיוזה II (MII) או יותר טעויות 1,2 המיוזה זכר. אצל יונקים, ביציות מעצר בבית prophase אמ&quot;ן עם שלפוחית ​​גדולה נבטי שלם (GV; הגרעין) ורק קורות חיים המיוזה כאשר הם מקבלים רמזים הביוץ. לאחר המיוזה קורות חיים, ביציות MI שלם לעבור חלוקת התא סימטרית, לעצור שוב metaphase של MII. ביצים לא להשלים MII עד שהם מופרית על ידי הזרע. ביציות גם יכול לעבור התבגרות meiotic באמצעות הוקמה בשנת תנאים במבחנה תרבות 3. בגלל דור של מוטנטים עכבר מהונדס גנטי ו במיקוד יקר יכול לקחת פרקי זמן ארוכים, מניפולציה של גמטות נשים במבחנה היא אסטרטגיה חסכוני יותר חוסך זמן. כאן אנו מתארים שיטות לבודד prophase, נעצר ביציות מעכברים עבור microinjection. כל חומר הבחירה עשויה להיות מוחדר הביצית, אלא בגלל meiotically-המוסמכת ביציות שותקות transcriptionally Crna 4,5, ולא דנ&quot;א, חייב להיות מוזרק ללימודי ביטוי חוץ רחמי. כדי להעריך ploidy, אנו מתארים התנאים שלנו ב ההבשלה חוץ גופית של ביציות לביצים MII. מבחינה היסטורית, כרומוזום הפצת טכניקות המשמשות ספירת כרומוזום מספר 6. שיטה זו מאתגרת מבחינה טכנית מוגבלת רק לזיהוי hyperploidies. כאן אנו מתארים שיטה כדי לקבוע תת ו hyperploidies באמצעות ביצים שלמות 7-8. שיטה זו משתמשת monastrol, מעכב kinesin-5, אשר קורסת ציר דו קוטבית לתוך ציר monopolar 9 כרומוזומים ובכך להפריד כזה kinetochores אדם יכול בקלות להיות מזוהה וספר באמצעות נסיוב אנטי CREST אוטואימוניות. בגלל שיטה זו מבוצעת ביצים שלמות, הכרומוזומים לא הולכים לאיבוד בשל טעות של המפעיל.

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment at JoVE.com

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

ביציות נוטים aneuploidy בשל טעויות הפרדה כרומוזום במהלך ההבשלה meiotic. ביצים Aneuploid יכול לגרום לבעיות פוריות הפלות או הפרעות התפתחותיות כמו תסמונת דאון. כאן אנו מתארים שיטות להציג חומרים הבחירה לתוך ביציות ושיטות מחקר התבגרות meiotic ולהעריך ploidy.

הביצית Microinjection עכבר, הבשלה ו Ploidy הערכה

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

mouse-oocyte-microinjection-maturation-and-ploidy-assessment

Research

JoVE Journal

Biology

29.7K Views.  University of Pennsylvania. ביציות נוטים aneuploidy בשל טעויות הפרדה כרומוזום במהלך ההבשלה meiotic. ביצים Aneuploid יכול לגרום לבעיות פוריות הפלות או הפרעות התפתחותיות כמו תסמונת דאון. כאן אנו מתארים שיטות להציג חומרים הבחירה לתוך ביציות ושיטות מחקר התבגרות meiotic ולהעריך ploidy.

Video: Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinjection עוברים א aegypti לקבל יתושים טראנסגנטי

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for regulating gene transcription1. DNA methylation is an epigenetic modification that acts predominantly as a repressive mark. Through the covalent addition of a methyl group onto cytosines in CpG dinucleotides, it can recruit additional repressive proteins and histone modifications to initiate processes involved in condensing chromatin and silencing genes2. DNA methylation is essential for normal development as it plays a critical role in developmental programming, cell differentiation, repression of retroviral elements, X-chromosome inactivation and genomic imprinting.
One of the most powerful methods for DNA methylation analysis is bisulfite mutagenesis. Sodium bisulfite is a DNA mutagen that deaminates cytosines into uracils. Following PCR amplification and sequencing, these conversion events are detected as thymines. Methylated cytosines are protected from deamination and thus remain as cytosines, enabling identification of DNA methylation at the individual nucleotide level3. Development of the bisulfite mutagenesis assay has advanced from those originally reported4-6 towards ones that are more sensitive and reproducible7. One key advancement was embedding smaller amounts of DNA in an agarose bead, thereby protecting DNA from the harsh bisulfite treatment8. This enabled methylation analysis to be performed on pools of oocytes and blastocyst-stage embryos9. The most sophisticated bisulfite mutagenesis protocol to date is for individual blastocyst-stage embryos10. However, since blastocysts have on average 64 cells (containing 120-720 pg of genomic DNA), this method is not efficacious for methylation studies on individual oocytes or cleavage-stage embryos.
Taking clues from agarose embedding of minute DNA amounts including oocytes11, here we present a method whereby oocytes are directly embedded in an agarose and lysis solution bead immediately following retrieval and removal of the zona pellucida from the oocyte. This enables us to bypass the two main challenges of single oocyte bisulfite mutagenesis: protecting a minute amount of DNA from degradation, and subsequent loss during the numerous protocol steps. Importantly, as data are obtained from single oocytes, the issue of PCR bias within pools is eliminated. Furthermore, inadvertent cumulus cell contamination is detectable by this method since any sample with more than one methylation pattern may be excluded from analysis12. This protocol provides an improved method for successful and reproducible analyses of DNA methylation at the single-cell level and is ideally suited for individual oocytes as well as cleavage-stage embryos.

Bisulfite mutagenesis is the gold standard for analyzing DNA methylation. Our modified protocol allows for DNA methylation analysis at the single-cell level and was specifically designed for individual oocytes. It can also be used for cleavage-stage embryos.

ביצית אחת bisulfite mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including by mechanical forces. Certain TRPV4 mutations cause complex hereditary bone or neuronal pathologies in human. Wild-type or mutant TRPV4 transgenes are commonly expressed in cultured mammalian cells and examined by Fura-2 fluorometry and by electrodes. In terms of the mechanism of mechanosensitivity and the molecular bases of the diseases, the current literature is confusing and controversial. To complement existing methods, we describe two additional methods to examine the molecular properties of TRPV4. (1) Rat TRPV4 and an aequorin transgene are transformed into budding yeast. A hypo-osmtic shock of the transformant population yields a luminometric signal due to the combination of aequorin with Ca2+, released through the TRPV4 channel. Here TRPV4 is isolated from its usual mammalian partner proteins and reveals its own mechanosensitivity. (2) cRNA of TRPV4 is injected into Xenopus oocytes. After a suitable period of incubation, the macroscopic TRPV4 current is examined with a two-electrode voltage clamp. The current rise upon removal of inert osmoticum from the oocyte bath is indicative of mechanosensitivity. The microAmpere (10-6 to 10-4 A) currents from oocytes are much larger than the subnano- to nanoAmpere (10-10 to 10-9 A) currents from cultured cells, yielding clearer quantifications and more confident assessments. Microscopic currents reflecting the activities of individual channel proteins can also be directly registered under a patch clamp, in on-cell or excised mode. The same oocyte provides multiple patch samples, allowing better data replication. Suctions applied to the patches can activate TRPV4 to directly assess mechanosensitivity. These methods should also be useful in the study of other types of TRP channels.

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

To complement commonly used methods to study TRPV4&#8217;s, two methods are described: Its mechanosensitivity can be studied by Ca2+-aequorin luminometry in transgenic yeast upon hypo-osmotic challenge. It can also be examined in TRPV4-RNA injected Xenopus oocytes by whole-cell two-electrode voltage clamp or patch clamp in on-cell or excised mode.

Luminometric ושמרים<em&gt; Xenopus</em&gt; ביצית בחינות אלקטרו של Mechanosensitivity המולקולרי של TRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

בVivo Microinjection וElectroporation של אשך העכבר

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

דור של הטרנסגניים<em&gt; הידרה</em&gt; על ידי Microinjection העובר

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

Meiotic ציר ההערכה בעכבר ביציות על ידי השתקה בתיווך siRNA

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

הביצית Microinjection עכבר, הבשלה ו Ploidy הערכה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video