המחברים רוצים להודות לכל חברי מעבדת בלבואלה על עזרתם ודיונים חשובים. המחברים מודים למלינה שו על ששיתפה בחביבות את מבנה mCherry-Cep192. מחקר זה נתמך על ידי R35GM142537 (NIGMS, NIH) ל-AZB.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי אוניברסיטת מיזורי (הבטחת איכות לטיפול בבעלי חיים מספר 9695). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברות בנות 6-8 שבועות של Cep192-eGFP . כדי ליצור עכברי כתב Cep192-eGFP , נעשה שימוש בתיקון מונחה הומולוגיה בתיווך CRISPR/Cas9 כדי לשלב את הגן המדווח EGFP בגנום העכבר CF-1. כתב ה-EGFP התמזג ב-C-terminus של Cep192 (מרכיב אינטגרלי של MTOCs)15. כדי לתחזק את מושבת העכברים, נעשה שימוש בעכברי כתב Cep192-eGfp . כל בעלי החיים הוחזקו בכלובים (עד ארבע חיות / כלוב) ב 21 מעלות צלזיוס ו -55% לחות, עם מחזור אור / חושך של 12 שעות וגישה ad libitum למזון ומים.
1. אוסף ביצית עכבר
<ol><li>הכינו את מדיום התרבית (צ'אטו, זיומק ובאביסטר, CZB19, ראו טבלת החומרים), ודגרו אותו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך הלילה. הערה: ניתן לאחסן את המדיום CZB בטמפרטורה של 4 °C למשך חודש אחד (ראה קובץ משלים 1 להרכב המדיה).</li>
	<li>הוסיפו למדיום CZB גלוטמין (1 מ"מ) ומילרינון (2.5 מ"מ) (CZB + M) (ראו טבלת חומרים), והניחו אותו באינקובטור. הערה: מילרינון הוא מעכב פוספודיאסטראז השומר על הביציות שנעצרו בפרופזה I ומונע חידוש מיוטי20.</li>
	<li>הכן את מדיום האיסוף (מדיום חיוני מינימלי ללא ביקרבונט, MEM) המכיל 3 מ"ג/מ"ל פוליוויניל פירולידון (PVP), 25 mM HEPES (pH 7.3) (קובץ משלים 1), ומילרינון (2.5 mM) (MEM/PVP + M, ראה טבלת החומרים).</li>
	<li>הכינו את כלי האיסוף והתרבית, הכינו ארבע מיקרו-טיפות (100 μL) של מדיום איסוף (MEM/PVP + M) ושתי מיקרו-טיפות (100 μL) של תרבית (CZB + M) בינוניות בצלחות פטרי בקוטר 60 מ"מ ו-35 מ"מ, בהתאמה, וכסו אותן בשמן מינרלי (ראו טבלת חומרים). שמור את צלחת האיסוף על שקופית חמה יותר, והכניס את צלחת התרבית לחממה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2.</li>
	<li>יש להזריק תוך צפק 5 יחב"ל של גונדוטרופין בסרום של סוסה הרה (PMSG, ראו טבלת חומרים) לעכברות בוגרות מינית (בנות 6-8 שבועות) Cep192-eGFP 44-48 שעות לפני איסוף הביציות.</li>
	<li>להקריב את העכברים על ידי נקע צוואר הרחם, לזהות ולהסיר את השחלות21, ולהעביר אותם לתוך זכוכית שעון המכילה אמצעי איסוף מראש (MEM / PVP + M) ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>מקבעים את השחלה על ידי נגיעה במזרק של 1 מ"ל בתחתית זכוכית השעון ומנקבים אותו מספר פעמים (~ 40 פעמים לכל שחלה) באמצעות מחטי תפירה המחוברות יחד כדי לשחרר את הביציות למדיום.</li>
	<li>באמצעות פיפט העברת פלסטיק, מעבירים את כל המדיום המכיל את קומפלקסי הקומולוס-ביצית (COCs) משלב 1.7 לתוך צלחת פטרי פלסטיק ריקה בקוטר 100 מ"מ.</li>
	<li>תחת סטריאומיקרוסקופ, אספו את ה-COCs באמצעות פיפט זכוכית פסטר, והעבירו אותם לצלחת האיסוף המכילה MEM/PVP + M.</li>
	<li>באמצעות פיפט זכוכית פסטר צר (בקוטר של כ-100 מיקרומטר), מפרקים את הביציות באופן מכני על ידי פיפטציה עדינה שחוזרת על עצמה, ולאחר מכן מעבירים ושוטפים אותן בארבע טיפות מיקרו של (100 μL) MEM/PVP + M (צלחת האיסוף) לפני העברתן לצלחת התרבית CZB + M.</li>
	<li>לדגום את הביציות denuded במשך 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% של CO2 באוויר.</li>
</ol>2. מיקרו הזרקת ביציות
<ol><li>הכניסו טיפה של 250 μL של MEM/PVP + M לתוך מכסה צלחת פטרי מפלסטיק בקוטר 100 מ"מ, וכסו אותה בשמן מינרלי. הערה: מכסה צלחת פטרי כולל שפה תחתונה המספקת יותר מקום להתאמת המיקרומניפולטור.</li>
	<li>הפעל את מערכת המיקרו-הזרקות (ראה טבלת החומרים).</li>
	<li>מניחים את צלחת המיקרו-הזרקה על שלב ההתחממות (37 מעלות צלזיוס) של המיקרוסקופ.</li>
	<li>טען את מחט ההזרקה עם 0.5 μL של mCh-Cep192cRNA באמצעות קצוות פיפטה microloader (ראה טבלת חומרים), והצמיד את מחט ההזרקה למיקרומניפולטור.</li>
	<li>מעבירים את הביציות המנודות (שלב 1.11) למיקרודרופ 250 μL (שלב 2.1).</li>
	<li>תחת עדשה אובייקטיבית של 20x או 40x, התאימו את המיקום ואת המיקוד של ההזרקה ומחטי ההחזקה בהתאם לתנוחת הביציות (איור 1).</li>
	<li>הגדר את יחידת המיקרו-הזרקה, והגדר את לחץ ההזרקה (p i), לחץ הפיצוי (pc) וזמן ההזרקה (ti) כך שיוכלו להזריק 5-10 pl של mCh-Cep192 cRNA (כדי לסמן באופן אקסוגני את ה- MTOCs).</li>
	<li>בזהירות להזריק את הביציות מבלי לגעת בגרעין.</li>
	<li>לאחר הזרקת כל הביציות, שטפו אותן בשלוש טיפות מיקרו של CZB + M, העבירו אותן לצלחת התרבית (CZB + M), ודגרו אותן במשך 3 שעות ב-37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר ביטוי mCh-Cep192.</li>
</ol>3. הבשלת ביציות
<ol><li>הכן את מדיום ההבשלה על ידי הוספת גלוטמין (1 מ"מ) למדיום CZB בשיווי משקל מראש באינקובטור עם 5% CO2 באוויר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות לפחות.</li>
	<li>מכינים שתי מיקרו-טיפות (100 μL) של מדיום ההבשלה בצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ, ומכסים אותן בשמן מינרלי (צלחת הבשלה).</li>
	<li>יש לשטוף לפחות שלוש פעמים במיקרו-טיפות CZB נטולות 100 μL כדי להסיר לחלוטין את המילרינון ולאפשר חידוש מיוטי.</li>
	<li>מעבירים את הביציות לצלחת ההבשלה, ודוגרים אותן במשך 5 שעות (שלב Prometaphase I) באינקובטור לח עם 5% CO2 באוויר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>4. הכנת ביציות לאבלציה והדמיה
<ol><li>מעבירים את הביציות של Prometaphase I (שלב 3.4) לצלחת תרבית עם תחתית זכוכית המכילה 100 μL של מדיום הבשלה (שלב 3.1) מכוסה בשמן מינרלי.</li>
</ol>5. הכנת מיקרוסקופ לאבלציה
<ol><li>לפחות 30 דקות לפני אבלציה, הפעל את בקר הטמפרטורה של חממת הבמה (ראה טבלת חומרים) והגדר אותו ל-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הפעל את בקר CO 2 והגדר אותו ל- 5% CO2.</li>
	<li>בחרו מטרה אפוכרומטית של טבילת שמן פי 40, ומרחו טיפה קטנה משמן הטבילה.</li>
	<li>הרכיבו את צלחת התרבית בעלת תחתית הזכוכית עם הביציות על אינקובטור עליון, וכיסו את האינקובטור במכסה גז.</li>
	<li>בתוכנת רכישת התמונה (ראו טבלת חומרים), בחרו אפשרות המאפשרת שמירה של מיקומי במה מרובים (לדוגמה, "הגדר סימן ומצא ניסוי"). באמצעות תאורת אור המועברת, מרכז על הביציות הבודדות ושמור את מיקומן.</li>
	<li>בתוכנת רכישת התמונות, בחר את מצב הסריקה XYZ , הגדר את פורמט התמונה ל- 256 x 256 פיקסלים, הגדר את גורם הזום ל- 2.5x - 3.0x ובחר תדר סריקה של 600 הרץ. זה מתאים לזמן השהייה של פיקסל של כ-1.6 μs.</li>
	<li>הגדר קו לייזר עירור של 488 ננומטר בכ-10% מעוצמת הלייזר (המתאימה ל-4.0 מיקרו-וואט ברמת הדגימה) (ראו טבלת חומרים), והשתמש ברוחב פס ספקטרלי של 500-550 ננומטר כדי לצפות באות GFP מה-MTOCs. לתצפית סימולטנית של פלואורסצנציה מ- Cep192 המתויג mCherry, הגדר קו לייזר עירור של 585 ננומטר בכ-8% מעוצמת הלייזר (המתאימה ל-10.7 μW ברמת הדגימה), והשתמש בגלאי אחר שנקבע לרוחב פס ספקטרלי של 595-645 ננומטר. הערה: כדאי להשתמש בגלאי האור המועבר (TLD) של המיקרוסקופ הקונפוקלי לגילוי גבולות ביציות בו-זמנית.</li>
	<li>באמצעות מצב סריקה חי ושליטה ידנית של כונן z, מסך את הביצית עבור MTOCs.</li>
	<li>לאחר זיהוי mcMTOC, צייר סביבו אזור מרובע של עניין (ROI).</li>
</ol>6. אבלציה של mcMTOCs
<ol><li>הגדר לייזר פמטו-שניות לאורך גל של 740 ננומטר. הערה: ניתן לשנות את אורך גל הלייזר בהתאם למיקרוסקופ ולתנאי הלייזר.</li>
	<li>השתמש במודולטור האלקטרו-אופטי של המיקרוסקופ הרב-פוטוני (ראו טבלת חומרים) כדי להגדיר את עוצמת הלייזר ל-70%-80%, המתאימה להספק של 60-70 mW במישור הדגימה. הערה: אם הלייזר מצויד במפצה דופק femtosecond, השתמש בו כדי לתקן פיזור עיכוב קבוצתי (GDD). תיקון GDD מפחית את כמות כוח הלייזר הנדרשת לאבלציה יעילה של mcMTOC וממזער את הנזק לביצית. בקרת GDD משולבת בדרך כלל עם תוכנת רכישת התמונה של מיקרוסקופים מסחריים מרובי פוטונים.</li>
	<li>השתמש באותו פורמט תמונה, מקדם זום ותדירות סריקה כמו בשלב 5.6. הגדר את הפרמטרים לממוצע של קו ומסגרת ל- 1.</li>
	<li>לחץ על כפתור הסריקה בתוכנה כדי לבצע את האבלציה של mcMTOC על ידי ביצוע סריקת לייזר אחת של החזר ההשקעה שנבחר.</li>
	<li>השתמש בהגדרות הערוץ משלב 5.7 כדי לסקור את תוצאות האבלציה על-ידי השוואת התמונות של המבנים בעלי תווית GFP שצולמו לפני ואחרי החשיפה ללייזר מרובה פוטונים. אם האבלציה מצליחה, עוצמת הפלואורסצנציה של GFP ב-mcMTOC הממוקד יורדת לרמות שנצפו ברקע.</li>
	<li>אם נותרו כמה קטעים ממבנה תיוג GFP, חזור על שלב 6.4 פעם אחת או יותר על-ידי התמקדות במישורי z שונים של ה-mcMTOC.</li>
	<li>השתמש בהגדרות הערוץ משלב 5.7 כדי לאמת את יעילות האבלציה על-ידי אובדן מוחלט של אותות mCherry הקשורים ל-mcMTOC (mCh-Cep192).</li>
	<li>חזור על שלב 5.8 לשלב 6.7 עד שכל ה- MTOCs של ביצית (במישורי מוקד שונים) יתבטלו. הערה: פרוטוקול זה משתמש במיקרו-הזרקה mCh-Cep192 כאסטרטגיה לאישור דלדול mcMTOC בעקבות חשיפה ללייזר מרובה פוטונים ולא כולל את האפשרות שאובדן פלואורסצנציה של GFP נגרם על ידי הלבנת תמונות GFP. עם זאת, המיקרו-הזרקה של בדיקה זו היא אופציונלית ואינה נדרשת להליך האבלציה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bennabi, I., Terret, M. E., Verlhac, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+spindle+assembly+and+chromosome+segregation+in+oocytes.">Meiotic spindle assembly and chromosome segregation in oocytes.</a> Journal of Cell Biology. 215 (5), 611-619 (2016).</li><li>Hashimoto, N., Kishimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+meiotic+metaphase+by+a+cytoplasmic+maturation-promoting+factor+during+mouse+oocyte+maturation.">Regulation of meiotic metaphase by a cytoplasmic maturation-promoting factor during mouse oocyte maturation.</a> Development Biology. 126 (2), 242-252 (1988).</li><li>Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+kinetochore+tracking+reveals+error-prone+homologous+chromosome+biorientation+in+mammalian+oocytes.">Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes.</a> Cell. 146 (4), 568-581 (2011).</li><li>Azoury, J., Verlhac, M. H., Dumont, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filaments:+Key+players+in+the+control+of+asymmetric+divisions+in+mouse+oocytes.">Actin filaments: Key players in the control of asymmetric divisions in mouse oocytes.</a> Biology of the Cell. 101 (2), 69-76 (2009).</li><li>Li, H., Guo, F., Rubinstein, B., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-driven+chromosomal+motility+leads+to+symmetry+breaking+in+mammalian+meiotic+oocytes.">Actin-driven chromosomal motility leads to symmetry breaking in mammalian meiotic oocytes.</a> Nature Cell Biology. 10 (11), 1301-1308 (2008).</li><li>Schuh, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+for+asymmetric+spindle+positioning+in+mouse+oocytes.">A new model for asymmetric spindle positioning in mouse oocytes.</a> Current Biology. 18 (24), 1986-1992 (2008).</li><li>Pimenta-Marques, A., Bettencourt-Dias, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericentriolar+material.">Pericentriolar material.</a> Current Biology. 30 (12), 687-689 (2020).</li><li>Hinchcliffe, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome+and+bipolar+spindle+assembly:+Does+one+have+anything+to+do+with+the+other.">The centrosome and bipolar spindle assembly: Does one have anything to do with the other.</a> Cell Cycle. 10 (22), 3841-3848 (2011).</li><li>Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+centrioles+in+the+first+and+second+meiotic+spindles+of+mouse+oocytes.">Absence of centrioles in the first and second meiotic spindles of mouse oocytes.</a> Journal of Cell Science. 11 (2), 521-541 (1972).</li><li>Schuh, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+MTOCs+replaces+centrosome+function+during+acentrosomal+spindle+assembly+in+live+mouse+oocytes.">Self-organization of MTOCs replaces centrosome function during acentrosomal spindle assembly in live mouse oocytes.</a> Cell. 130 (3), 484-498 (2007).</li><li>Clift, D., Schuh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-step+MTOC+fragmentation+mechanism+facilitates+bipolar+spindle+assembly+in+mouse+oocytes.">A three-step MTOC fragmentation mechanism facilitates bipolar spindle assembly in mouse oocytes.</a> Nature Communications. 6, 7217 (2015).</li><li>Luksza, M., Queguigner, I., Verlhac, M. H., Brunet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+MTOCs+upon+centriole+loss+during+mouse+oogenesis.">Rebuilding MTOCs upon centriole loss during mouse oogenesis.</a> Developmental Biology. 382 (1), 48-56 (2013).</li><li>Balboula, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haspin+kinase+regulates+microtubule-organizing+center+clustering+and+stability+through+Aurora+kinase+C+in+mouse+oocytes.">Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes.</a> Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).</li><li>Breuer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HURP+permits+MTOC+sorting+for+robust+meiotic+spindle+bipolarity,+similar+to+extra+centrosome+clustering+in+cancer+cells.">HURP permits MTOC sorting for robust meiotic spindle bipolarity, similar to extra centrosome clustering in cancer cells.</a> Journal of Cell Biology. 191 (7), 1251-1260 (2010).</li><li>Londo&#241;o-V&#225;squez, D., Rodriguez-Lukey, K., Behura, S. K., Balboula, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+organizing+centers+regulate+spindle+positioning+in+mouse+oocytes.">Microtubule organizing centers regulate spindle positioning in mouse oocytes.</a> Developmental Cell. 57 (2), 197-211 (2022).</li><li>Konig, K., Riemann, I., Fischer, P., Halbhuber, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+nanosurgery+with+near+infrared+femtosecond+laser+pulses.">Intracellular nanosurgery with near infrared femtosecond laser pulses.</a> Cellular and Molecular Biology. 45 (2), 195-201 (1999).</li><li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation.">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).</li><li>Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+of+the+microtubule+cytoskeleton:+Setting+up+and+working+with+an+ablation+system.">Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: Setting up and working with an ablation system.</a> Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).</li><li>Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+culture+medium+supports+development+of+random-bred+1-cell+mouse+embryos+in+vitro.">An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 86 (2), 679-688 (1989).</li><li>Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+maturation+involves+compartmentalization+and+opposing+changes+of+cAMP+levels+in+follicular+somatic+and+germ+cells:+Studies+using+selective+phosphodiesterase+inhibitors.">Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: Studies using selective phosphodiesterase inhibitors.</a> Developmental Biology. 178 (2), 393-402 (1996).</li><li>Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+culture+of+mouse+oocytes.">Isolation and in vitro culture of mouse oocytes.</a> Bio Protocol. 11 (15), 4104 (2021).</li><li>Khodjakov, A., Cole, R. W., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synergy+of+technologies:+Combining+laser+microsurgery+with+green+fluorescent+protein+tagging.">A synergy of technologies: Combining laser microsurgery with green fluorescent protein tagging.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (4), 311-317 (1997).</li><li>Pavin, N., Tolic, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+the+mitotic+spindle.">Mechanobiology of the mitotic spindle.</a> Developmental Cell. 56 (2), 192-201 (2021).</li><li>Khodjakov, A., Cole, R. W., Oakley, B. R., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome-independent+mitotic+spindle+formation+in+vertebrates.">Centrosome-independent mitotic spindle formation in vertebrates.</a> Current Biology. 10 (2), 59-67 (2000).</li><li>Aist, J. R., Liang, H., Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astral+and+spindle+forces+in+PtK2+cells+during+anaphase+B:+a+laser+microbeam+study.">Astral and spindle forces in PtK2 cells during anaphase B: a laser microbeam study.</a> Journal of Cell Science. 104, 1207-1216 (1993).</li><li>Bennabi, I., Manil-Segalen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Ablation+of+microtubule-chromosome+attachment+in+mouse+oocytes.">Laser Ablation of microtubule-chromosome attachment in mouse oocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1818, 153-161 (2018).</li><li>Milas, A., Jagric, M., Martincic, J., Tolic, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+reversible+knocksideways,+laser+ablation,+and+photoactivation+on+the+mitotic+spindle+in+human+cells.">Optogenetic reversible knocksideways, laser ablation, and photoactivation on the mitotic spindle in human cells.</a> Methods in Cell Biology. 145, 191-215 (2018).</li><li>Warzych, E., Lipinska, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+follicular+environment+during+oocyte+growth+and+maturation.">Energy metabolism of follicular environment during oocyte growth and maturation.</a> Journal of Reproduction and Development. 66 (1), 1-7 (2020).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

קיימות שיטות שונות להפרעה למבנים הקשורים לשלד הציטוסקלטון בתוך תאים22,23,24,25. עם זאת, מציאת טכניקות יעילות כדי לשבש באופן סלקטיבי את המבנה הממוקד מבלי לפגוע בכדאיות התא היא מאתגרת. שיטת האבלציה בלייזר רב-פוטונים המוצגת כאן היא אסטרטגיה יעילה להשראת הפרעה מכנית סלקטיבית ל-mcMTOCs בתוך הביצית מבלי לשנות את כדאיות הביציות.
נעשה שימוש נרחב באבלציה בלייזר כדי להבין את המנגנונים המולקולריים השולטים בהפרדת כרומוזומים במהלך מיטוזהומיוזה 22,23,26,27. בשל גודלם הגדול יחסית (קוטר >80 מ"מ) של ביציות יונקים בהשוואה לתאים סומטיים28, האבלציה של המבנים התוך-תאיים שלהם מהווה אתגר. יתר על כן, נפח mcMTOC הממוצע בביציות metaphase I הוא ~ 20 μm15, המייצג אתגר נוסף. יש לאמץ שיטה יעילה המציעה חדירה עמוקה יותר לרקמות כדי להתגבר על אתגרים אלה. היתרון העיקרי של שימוש בלייזר מרובה פוטונים לאבלציה הוא יכולתו להגיע עמוק יותר לתוך התא תוך מזעור ההשפעות מחוץ למטרה29.
כדי לוודא את היעילות והיעילות של שיטת האבלציה בלייזר כדי לרוקן את המבנה הממוקד, מומלץ להשתמש בחלבון המסומן בפלואורסצנטיות כדי לזהות את המבנה הממוקד לאורך זמן (לפני ואחרי אבלציה)23. חשוב לשים לב שאבלציה בלייזר מדלדלת את כל ה-mcMTOC כמבנה, ולמרות ש-mcMTOCs קטנים יותר דורשים חשיפה אחת בלבד ללייזר כדי להתרוקן, מק-MTOCs גדולים יותר עשויים לדרוש יותר מחשיפה אחת ללייזר במישורי מוקד שונים. מומלץ גם לתקן ולתייג תת-קבוצה של ביציות בקרה ו- mcMTOC-ablated עם סמן MTOC (כגון γ-טובולין, פריצנטרי או Cep192) כדי לאשר את היעילות של אבלציה mcMTOC עוד יותר. בביציות בקרה, אזורים בציטופלסמה הסמוכים ל-mcMTOCs אך אינם חופפים אליהם ייחשפו ללייזר.
ניסוי זה דורש מספר אבלציות של mcMTOC תוך כדי תנועה בין מישורי מוקד שונים בתוך הביציות. לכן, מומלץ מאוד לתרגל טכניקה זו מספר פעמים לפני ביצוע הניסוי כדי למזער את זמן הניסוי, ובכך להגדיל את הכדאיות של הביציות. יתר על כן, חשוב להשתמש בכוח הלייזר המינימלי שמספיק כדי לרוקן את mcMTOCs מבלי להשפיע על כדאיות הביציות.
טכניקה זו יש כמה מגבלות. ראשית, מיקרוסקופים קונפוקליים מרובי פוטונים יקרים יחסית למיקרוסקופים קונפוקליים רגילים. שנית, הפרעה לכל ה-mcMTOCs במישורי מוקד שונים גוזלת זמן רב יותר מאשר הפרעות כימיות או גנטיות. שלישית, פרוטוקול זה דורש מיומנויות טכניות כדי לבטל את כל mcMTOCs בזמן הקצר ביותר האפשרי. עם זאת, לאחר השליטה, השימוש בלייזר מרובה פוטונים מספק אסטרטגיה מצוינת לשבש כמה מבנים תוך תאיים בביציות עכבר, כולל mcMTOCs, תורם להבנת המנגנונים המולקולריים המווסתים את מיקום הציר ואת נדידתו בזמן בביציות יונקים.

גמטות הפלואידים (זרע וביצית) מיוצרות באמצעות מיוזה, הכוללת סיבוב אחד של שכפול DNA ואחריו שתי חלוקות רצופות הנחוצות להפחתת מספר הכרומוזומים לפני ההפריה. ביונקים, במהלך חיי העובר המוקדמים, הביצית עוברת מעצר ממושך (עד גיל ההתבגרות) בשלב הדיפלוטן של פרופאזה I של החלוקה המיוטית הראשונה, שלב הנקרא שלפוחית הנבטית (GV). לאחר חידוש מיוטי, הביצית GV עוברת פירוק מעטפת גרעינית (NEBD), והציר מורכב בעיקר במרכז הביציות 1,2,3. מאוחר יותר, מונע על ידי F-actin, הציר נודד בזמן ממרכז הביציות אל קליפת המוח כדי להבטיח חלוקה אסימטרית מאוד, וכתוצאה מכך ביצה עם גוף קוטבי זעיר (PB)4,5,6.
בתאים מיטוטיים, הצנטרוזומים מורכבים מזוג צנטריולים המוקפים ברכיבי חומר פרי-צנטריולאריים (PMC), כגון פריצנטרי, γ-טובולין, Cep152 ו-Cep1927. צנטרוזומים אלה, המכילים צנטריול, תורמים לנאמנות של היווצרות ציר דו-קוטבי8. עם זאת, צנטריולים הולכים לאיבוד במהלך האוגנזה המוקדמת במינים שונים, כולל מכרסמים9. לכן, ביציות עכבר מאמצות מסלול הרכבה של ציר שאינו תלוי בצנטריול באמצעות מספר רב של מרכזי ארגון מיקרוטובולים (MT) (MTOCs)9,10. עם חידוש המיוט, ה- MTOCs הפרי-גרעיניים עוברים שלושה שלבים נפרדים של עיבוי, מתיחה ופיצול למספר רב של MTOCsקטנים יותר 11,12. לאחר מכן, ה-MTOCs המקוטעים מקובצים באשכולות וממוינים כדי לארגן ציר דו-קוטבי10,13,14. מאגר נוסף של MTOCs ממוקם בציטופלסמה במהלך NEBD. חלק מה-MTOCs הציטופלסמיים האלה נודדים ויוצרים קטבי ציר (MTOCs קוטביים, pMTOCs)10,11. לאחרונה התגלתה תת-קבוצה נוספת של MTOCs ציטופלסמיים, המכונים MTOCs ציטופלסמיים מטאפאזיים (mcMTOCs), שאינם תורמים להיווצרות מוט ציר אך נשארים בציטופלסמה של הביצית במהלך מטאפאזה I (Met I)15. דלדול mcMTOCs על ידי אבלציה לייזר מרובת פוטונים או הגדלה חריגה של מספרם על ידי עיכוב אוטופגיה טורפים מיקום ציר ונדידה ומגדילה את שכיחות האנאופלואידיה בביציות מטאפאזה II15.
באופן מעניין, mcMTOCs שונים מ- pMTOCs בהיבטים רבים15. לדוגמה, בניגוד ל-pMTOCs, שמקורם בעיקר ב-MTOCs פרי-גרעיניים, mMTOCs מקורם בקליפת הביצית. כאשר הציר עדיין במרכז הביצית, ה- mcMTOCs ממוקמים באופן אסימטרי הפוך לצד שאליו הציר נודד עבור שחול PB15. MTs דמויי אסטרל אינם יכולים להגיע לקליפת המוח בתא הביצית הגדול יחסית. לכן, ה-mcMTOCs האלה מנוקאלים MTs כדי לעגן את הציר (באמצעות MTOCs דמויי אסטרל) לקליפת המוח. ממצאים אלה מציעים מודל שבו כוח ה-MT בעל גרעין ה-mcMTOC מנטרל את הכוח המתווך F-actin שמניע את נדידת הציר לכיוון קליפת המוח. האיזון בין שני הכוחות המנוגדים הללו חיוני כדי לווסת את מיקום הציר המרכזי ואת נדידת הצירבזמן 15.
נכון להיום, כל חלבוני ה-PMC שנבדקו (פריצנטריים, g-טובולין, Cep192 ו-Aurora kinase A) מתמקמים בשני מאגרי ה-MTOC: mcMTOCs ו-pMTOCs15. לכן, אין גישה כימית או גנטית להפרעות סלקטיביות של mcMTOCs מבלי להפריע ל-pMTOCs. ניתן לעקוף מגבלות אלה על ידי התמקדות סלקטיבית ב- mcMTOCs עם אבלציה בלייזר. בין הטכנולוגיות מבוססות הלייזר שפותחו עבור מיקרואבלציה, לייזרים פמטו-שניות רב-פוטונים פועמים מראים פוטנציאל רב בשל פגיעתם המדויקת המוגבלת למישור המוקד, עומק החדירה הגבוה של אור אינפרה-אדום קרוב, והפחתת הפוטוטוקסיות והנזק התרמי לתא16,17,18. עבודה זו מתארת גישה סלקטיבית לביטול mcMTOCs בביציות עכבר באמצעות לייזר רב-פוטוני המוצמד למיקרוסקופ הפוך.

<table><tbody><tr><td>4 IN thinwall GL 1.0 OD/.75 ID</td><td>World precision instrument&amp;nbsp;</td><td>TW100F-4</td><td>Injection needles&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Borosilicate glass&amp;nbsp;</td><td>Fisherbrand&amp;nbsp;</td><td>Cat# 13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillarities&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instrument&amp;nbsp;</td><td>Cat# TW100-6</td><td>Holding needles&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bovine serum albumine&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# A4503</td><td></td></tr><tr><td>Cage incubator for Leica DMI6000 B microscope</td><td>Life Imaging Services GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium chlrode dihydrate</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# C7902</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; controller&amp;nbsp;</td><td>Pecon</td><td># 0506.000</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Cover HP</td><td>Pecon</td><td># 0506.020</td><td></td></tr><tr><td>DL-Lactic acid&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# L7900</td><td></td></tr><tr><td>DMi8</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>Microscope&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# E5134</td><td></td></tr><tr><td>Femtojet 4i</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>Microinjector&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Femtotips Microloader</td><td>Fisher scientific&amp;nbsp;</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# G1272</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# 1272</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom dish&amp;nbsp;</td><td>Mat Tek Corporation</td><td>Cat# P35G-1.0-20-C&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hepes&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# H3784</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Sodium Salt</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat # H3784</td><td></td></tr><tr><td>Hera Cell vios 160i</td><td>Thermo&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Leica TCP SP8 spectral laser scanning confocal micorscope with inverted stand DMI6000 B</td><td>Leica Microsystems, Inc</td><td>N/A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat#G8540</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate dihydrate</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# M7774</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai DeepSee Ti-Sapphire femtosecond laser</td><td>Spectra-Physics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>mCH-Cep192 cRNA</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Medium Essential Medium Eagle - MEM</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat #M0258</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat# M4659</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat# M5310</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential medium eagle (MEM)</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# M0268 - 1L</td><td></td></tr><tr><td>Mouse: Cep192-eGFP reporter CF-1</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (100 mm)</td><td>Fisherbrand&amp;nbsp;</td><td>Cat# FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (35 mm)</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>Cat# 430165</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (60 mm)</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>Cat# 351007</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P5530</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrolidone</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat# P2307</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrolidone (PVP)</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P2307</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P5405</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P5655</td><td></td></tr><tr><td>Pregnant mare&amp;acute;s serum gonadotropin&amp;nbsp;</td><td>Lee BioSolutions</td><td>Cat# 493-10-10&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic acid&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P4562</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic acid&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P4562</td><td></td></tr><tr><td>Sewing needles&amp;nbsp;</td><td>D.M.C</td><td>N/A</td><td>N&amp;deg; 5 * 16 Needles&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# S5761</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# S5886</td><td></td></tr><tr><td>Stage-top heating insert P</td><td>Pecon</td><td># 0426.300</td><td></td></tr><tr><td>Sterezoom S9i</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>Stereomicroscope&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Syringe 1 mL</td><td>BD company&amp;nbsp;</td><td>Cat# 309597</td><td></td></tr><tr><td>Taurine&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# T0625</td><td></td></tr><tr><td>Temperature controller Tempcontrol 37-2 &lt;em&gt;digital&lt;/em&gt;</td><td>Pecon</td><td># 0503.000</td><td></td></tr><tr><td>The Cube temperature controller for the cage incubator</td><td>Life Imaging Services GmbH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

multi-photon laser ablation of cytoplasmic microtubule organizing centers in mouse oocytes

הנאמנות של מיוזה של ביצית היא קריטית ליצירת ביציות אופלואידיות מוכשרות מבחינה התפתחותית. ביונקים, הביצית עוברת מעצר ממושך בפרופאזה I של החטיבה המיוטית הראשונה. לאחר גיל ההתבגרות ועם חידוש המיוט, קרום הגרעין מתפרק (פירוק מעטפת הגרעין), והציר מורכב בעיקר במרכז הביצית. מיקום ציר מרכזי ראשוני חיוני להגנה מפני חיבורים חריגים של קינטוצ'ור-מיקרוטובול (MT) ואנופלואידיה. הציר הממוקם במיקום מרכזי נודד באופן רגיש לזמן לכיוון קליפת המוח, וזהו תהליך הכרחי כדי לבלוט גוף קוטבי זעיר. בתאים מיטוטיים, מיקום הציר מסתמך על האינטראקציה בין MTs אסטרליים בתיווך צנטרוזום לבין קליפת התא. להיפך, ביציות עכבר חסרות צנטרוזומים קלאסיים, ובמקום זאת, מכילות מרכזי ארגון MT אצנטריולאריים רבים (MTOCs). בשלב המטאפאזה I, לביציות עכבר יש שתי קבוצות שונות של MTOCs: (1) MTOCs המקובצים באשכולות וממוינים להרכבת קטבי ציר (MTOCs קוטביים), ו-(2) MTOCs ציטופלסמיים מטאפאזיים (mcMTOCs) שנשארים בציטופלסמה ואינם תורמים ישירות להיווצרות צירים אך ממלאים תפקיד מכריע בוויסות מיקום הציר ונדידת הציר בזמן. כאן מתוארת שיטת אבלציה בלייזר מרובת פוטונים כדי לרוקן באופן סלקטיבי mcMTOCs המסומנים באופן אנדוגני בביציות שנאספו מעכברים מדווחים Cep192-eGfp . שיטה זו תורמת להבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס מיקום ציר ונדידתם בביציות של יונקים.

אבלציה בלייזר מרובה פוטונים מספקת שיטה יעילה לפירוק סלקטיבי של מבנים תוך-תאיים. המחקר הנוכחי השתמש באבלציה של לייזר רב-פוטוני כדי לרוקן mcMTOCs בביציות עכבר באופן סלקטיבי. אבלציה בלייזר דלדלה את ה-mcMTOCs ביעילות, כפי שמראה ההפחתה בפלואורסצנציה האנדוגנית של GFP ב-mcMTOCs הממוקדים לרמה דומה לרקע. mCh-Cep192 אקסוגני ב-mcMTOCs הממוקדים בוטל גם הוא בעקבות אבלציה בלייזר. אבלציה בלייזר של mcMTOCs צריכה להתבצע במישורי מוקד שונים בתוך הביצית (היכן ש-mcMTOCs ממוקמים, איור 2) כדי להבטיח שכל ה-mcMTOCs בתוך הביצית יתרוקנו (איור 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig01.jpg"> איור 1: מיקרו-הזרקת ביציות. מיקרו-הזרקה של ביצית עכבר שנעצרה על ידי Prophase I עם mCh-Cep192 cRNA. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig02.jpg"> איור 2: דלדול של mcMTOCs בביציות עכבר. תמונות מייצגות של מישורי מוקד בודדים. הריבועים הלבנים מציינים mcMTOC לפני ואחרי אבלציה בלייזר מרובה פוטונים. סרגל קנה מידה: 40 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig03.jpg"> איור 3: דלדול של mcMTOCs במישורי מוקד שונים בביצית עכבר. תמונות הקרנה מקסימליות מייצגות של ביצית עכבר אבלציה של mcMTOC. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
קובץ משלים 1: הרכבים של צ'אטו, זיומק ובאביסטר (CZB) ומדיום חיוני מינימלי ללא ביקרבונט (MEM/PVP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439_Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes at JoVE.com

Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

מוצג פרוטוקול אופטימלי המאפשר דלדול של מרכזי ארגון מיקרוטובולים ציטופלסמיים בביציות עכבר במהלך מטאפאזה I באמצעות לייזר פמטו-שניות כמעט אינפרה-אדום.

אבלציה בלייזר רב-פוטונים של מרכזי ארגון מיקרוטובולים ציטופלסמיים בביציות עכבר

The fidelity of oocyte meiosis is critical for generating developmentally competent euploid eggs. In mammals, the oocyte undergoes a lengthy arrest at ...

multi-photon-laser-ablation-cytoplasmic-microtubule-organizing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

1.6K Views.  University of Missouri. מוצג פרוטוקול אופטימלי המאפשר דלדול של מרכזי ארגון מיקרוטובולים ציטופלסמיים בביציות עכבר במהלך מטאפאזה I באמצעות לייזר פמטו-שניות כמעט אינפרה-אדום. 

Video: Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

בידוד ואפיון של עכבר Antral ביציות בהתבסס על ארגון הכרומטין nucleolar

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

באמצעות העכבר Oocytes כדי להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Genetics

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that take place in the cytoplasm in preparation for fertilization and acquisition of totipotency. During oocyte maturation, changes in gene expression depend exclusively on the translation and degradation of maternal messenger RNAs (mRNAs) rather than on transcription. Execution of the translational program, therefore, plays a key role in establishing oocyte developmental competence to sustain embryo development. This paper is part of a focus on defining the program of maternal mRNA translation that takes place during meiotic maturation and at the oocyte-to-zygote transition. In this method paper, a strategy is presented to study the regulation of translation of target mRNAs during in vitro oocyte maturation. Here, a Ypet reporter is fused to the 3&#39; untranslated region (UTR) of the gene of interest and then micro-injected into oocytes together with polyadenylated mRNA encoding for mCherry to control for injected volume. By using time-lapse microscopy to measure reporter accumulation, translation rates are calculated at different transitions during oocyte meiotic maturation. Here, the protocols for oocyte isolation and injection, time-lapse recording, and data analysis have been described, using the Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3&#39; UTR reporter as an example.

This protocol describes a reporter assay to study the regulation of mRNA translation in single oocytes during in vitro maturation.

הגדרת התוכנית של תרגום mRNA אימהי במהלך התבגרות במבחנה באמצעות בדיקה של כתב ביצית יחיד

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells entering meiotic prophase I are eliminated during Fetal Oocyte Attrition (FOA) and the first week of postnatal life. Three major mechanisms regulate the number of oocytes that survive during development and establish the ovarian reserve in females entering puberty. In the first wave of oocyte loss, 30-50% of the oocytes are eliminated during early FOA, a phenomenon that is attributed to high Long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) expression. The second wave of oocyte loss is the elimination of oocytes with meiotic defects by a meiotic quality checkpoint. The third wave of oocyte loss occurs perinatally during primordial follicle formation when some oocytes fail to form follicles. It remains unclear what regulates each of these three waves of oocyte loss and how they shape the ovarian reserve in either mice or humans.
Immunofluorescence and 3D visualization have opened a new avenue to image and analyze oocyte development in the context of the whole ovary rather than in less informative 2D sections. This article provides a comprehensive protocol for whole ovary immunostaining and optical clearing, yielding preparations for imaging using multiphoton microscopy and 3D modeling using commercially available software. It shows how this method can be used to show the dynamics of oocyte attrition during ovarian development in C57BL/6J mice and quantify oocyte loss during the three waves of oocyte elimination. This protocol can be applied to prenatal and early postnatal ovaries for oocyte visualization and quantification, as well as other quantitative approaches. Importantly, the protocol was strategically developed to accommodate high-throughput, reliable, and repeatable processing that can meet the needs in toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Here, we present an optimized protocol for imaging entire ovaries for quantitative and qualitative analyses using whole-mount immunostaining, multiphoton microscopy, and 3D visualization and analysis. This protocol accommodates high-throughput, reliable, and repeatable processing that is applicable for toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

אימונופלואורסצנציה של השחלה כולה, ניקוי ומיקרוסקופיה מרובת פוטון לניתוח תלת-ממדי כמותי של עתודת השחלות המתפתחות בעכבר

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. Traditional pharmacological disruption of the ubiquitous microtubule network using, for instance, nocodazole can have devastating consequences for any cell. Reversibly photoswitchable microtubule inhibitors have the potential to overcome the limitations by enabling drug effects to be implemented in a spatiotemporally-controlled manner. One such family of drugs is the azobenzene-based photostatins (PSTs). These compounds are inactive in dark conditions, and upon illumination with UV light, they bind to the colchicine-binding site of &#946;-tubulin and block microtubule polymerization and dynamic turnover. Here, the application of PSTs in the 3-dimensional (3D) live preimplantation mouse embryo is set out to disrupt the microtubule network on a subcellular level. This protocol provides instructions for the experimental setup, as well as light activation and deactivation parameters for PSTs using live-cell confocal microscopy. This ensures reproducibility and enables others to apply this procedure to their research questions. Innovative photoswitches like PSTs may evolve as powerful tools to advance the understanding of the dynamic intracellular microtubule network and to non-invasively manipulate the cytoskeleton in real-time. Furthermore, PSTs may prove useful in other 3D structures such as organoids, blastoids, or embryos of other species.

Typical microtubule inhibitors, used widely in basic and applied research, have far-reaching effects on cells. Recently, photostatins emerged as a class of photoswitchable microtubule inhibitors, capable of instantaneous, reversible, spatiotemporally precise manipulation of microtubules. This step-by-step protocol details the application of photostatins in a 3D live preimplantation mouse embryo.

מניפולציה תת-תאית של מיקרוטובול ציטוספקלטון בעובר עכבר קדם-ההשתלה החי באמצעות פוטוסטטינים

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. ...

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

הערכת שלמות מחסום הרכבת הציר בביציות עכבר

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

זיהוי נזק לדנ"א בביציות של עכברים שנעצרו בשלב

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

מחבר זרקור: הבנת תגובת נזק לדנ"א בביציות יונקים ובעוברים טרום השרשה 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

איתור שברים דו-גדיליים בדנ"א בביציות עכבר

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

הביצית Microinjection עכבר, הבשלה ו Ploidy הערכה

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

אבלציה בלייזר רב-פוטונים של מרכזי ארגון מיקרוטובולים ציטופלסמיים בביציות עכבר

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בידוד ואפיון של עכבר Antral ביציות בהתבסס על ארגון הכרומטין nucleolar

באמצעות העכבר Oocytes כדי להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני

הגדרת התוכנית של תרגום mRNA אימהי במהלך התבגרות במבחנה באמצעות בדיקה של כתב ביצית יחיד

אימונופלואורסצנציה של השחלה כולה, ניקוי ומיקרוסקופיה מרובת פוטון לניתוח תלת-ממדי כמותי של עתודת השחלות המתפתחות בעכבר

מניפולציה תת-תאית של מיקרוטובול ציטוספקלטון בעובר עכבר קדם-ההשתלה החי באמצעות פוטוסטטינים

הערכת שלמות מחסום הרכבת הציר בביציות עכבר

איתור שברים דו-גדיליים בדנ"א בביציות עכבר

איתור שברים דו-גדיליים בדנ"א בביציות עכבר

איתור שברים דו-גדיליים בדנ"א בביציות עכבר

הביצית Microinjection עכבר, הבשלה ו Ploidy הערכה