המחקר מומן בחלקו על ידי סטארט כספים טקסס A &amp; M University

הכנה לפני הניתוח כלים כירורגיים: לעקר כל מספריים לנתיחה ו מלקחיים על ידי החיטוי Coverslip ניקוי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את כל coverslips (15mm בקוטר של צלחת 24 היטב) בכוס 1L הדשא HCl 33% לפחות במשך 24 שעות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מים זורמים במשך 10 דקות עם לנער מדי פעם כדי להסיר את כל שיירי HCl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מים Millipore </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את המים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים coverslips באתנול 95-98% </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslips העברה רקמות נקייה על צלחת שטוחה אוויר יבש coverslips </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת coverslips אל כוס זכוכית, מכסים ברדיד אלומיניום החיטוי הערה: Coverslips יכול להיות מאוחסן בשלב זה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום coverslip הפרט לתוך צלחות תרבות. מוכן לציפוי </li></ol> Coverslip ציפוי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל x 100 מניות של פולי-D-ליזין (PDL, 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בסרום שור 0.5% אלבומין PBS, מאוחסנים aliquots ב -20 ° C) עם PBS ולסנן-לעקר (0.22 מיקרומטר) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל coverslips עם פתרון 1 PDL x (~ 0.15 מ&quot;ל / ס&quot;מ 2) עבור 2 שעות על 37 מעלות צלזיוס באינקובטור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון PDL ולשטוף 3 פעמים עם סטרילי DDH 2 O ו coverslips להתייבש לחלוטין </li></ol> הערה: סמל מספיק coverslips / צלחות עבור כל לנתיחה. PDL מצופה coverslips יכול להיות מאוחסן במשך כמה שבועות ב 4 ° C. מדיה ופתרונות בינוני Dissection (DM): השתמש תמיסת מלח סטרילית מאוזן קרים של האנק (w / o Ca 2 +, Mg 2 +) (HBSS, Invitrogen 14,175) בתוספת 10 HEPES מ&quot;מ (Invitrogen 15,630). תרבות התקשורת צבירה: בינוני DMEM/NBB27 מכיל DMEM / Neurobasal (1:1 כרך: כרך א), 2% B27, 1 x סאטו, נתרן pyruvate 0.5 מ&quot;מ, 0.75mM GlutaMAX, 60μg/ml N-acetylcysteine, 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל אינסולין, 10nm d-ביוטין ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין. כדי להפוך את 100 מ&quot;ל של המדיום תרבות צבירה, לערבב 50 מ&quot;ל DMEM (w / o pyruvate / גלוטמין, Invitrogen 11,960), 50 מ&quot;ל Neurobasal בינוני (Invitrogen 211,034), 375 GlutaMax μl (100 x, Invitrogen 35,050), 5.5 מ&quot;ג נתרן pyruvate (סיגמה P2256), 2 מ&quot;ל B27 (Invitrogen 17,504), 6.3 מ&quot;ג N-acetylcysteine ​​(Sigma A8199), 1 מ&quot;ל של סאטו המניה (המניה x 100, ראה להלן), 25 μl של d-ביוטין מניות (4000 x המניות, 40 מיקרומטר PBS מאוחסנים aliquots ב -20 ° C. Sigma B4639), 100 μl של אינסולין (1000 x המניות, 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​HCl 0.01N מאוחסנים aliquots ב -20 ° C, Sigma 16,634), ו - 1 מ&quot;ל פניצילין / סטרפטומיצין (100 x המניות, Invitrogen 15,140), מסנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C. סאטו 100 x פתרון המניות: כדי להפוך 40 מ&quot;ל של המניה: לערבב 40 מ&quot;ל Neurobasal עם 400 מ&quot;ג apo-transferrin (Sigma T2252), 400 מ&quot;ג BSA (Sigma A9647), 10 μl של פרוגסטרון (25 מ&quot;ג / מ&quot;ל אתנול, המאוחסנים aliquots ב -20 ° C. סיגמה P8783), 64 מ&quot;ג putrescine (סיגמה P7505), וכן 40 μl של נתרן סלניום (30 מיקרומטר PBS, מאוחסנים aliquots ב -20 ° C, Sigma S5261). סנן לעקר את הפתרון מניות סאטו, ולאחסן כמו aliquots ב -20 ° C. Neuron בינוני ציפוי (PM): בינוני Neurobasal, 2% B27, 2mm גלוטמין (מניות 100x, aliquots המאוחסן ב -20 ° C, Invitrogen 25,030), 25μM חומצה גלוטמית (100 המניות, aliquots המאוחסן ב -20 ° C) 1% פניצילין / סטרפטומיצין. Neuron בינוני בתרבות (CM): בינוני Neurobasal, 2% B27, 2mm גלוטמין (מניות 100x, aliquots המאוחסן ב -20 ° C) 1% פניצילין / סטרפטומיצין. 5-FdU מניות: מניות 100x, 1mm 5-fluoro-2&#39;-deoxyuridine (Sigma F0503) and1mM uridine (Sigma U3003) במדיום Neurobasal. סנן מעוקרים מאוחסנים aliquots ב -20 ° C. Papain פתרון העיכול (להפוך טרי לפני דיסקציה): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 3.2 מ&quot;ג L-ציסטאין (Sigma C-7352) ב 4ml DM </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם ל-pH בסביבות 7.4 עם 1N NaOH (מבחן על מקלוני הבדיקה pH) ומקום באמבט מים ב 37 ° C הערה: בצע את הצעד הבא ממש לפני עיכול רקמות (ראה להלן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף papain לריכוז סופי של יחידה 20 / ml </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן לעקר (0.22mm), ואת המקום באמבט מים ב 37 ° C </li></ol> טריפסין פתרון מעכבי (לעשות טרי לפני דיסקציה): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיס 0.2 גרם מעכב טריפסין (Sigma T7295) ב DM 20ml </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק pH ולהתאים את ה-pH ל ~ 7.4 עם 1 N NaOH </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן לעקר, ומקום באמבט מים ב 37 ° C </li></ol> המוח Dissection ההתקנה: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים מעוקרות ומספריים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 70% אתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממחטת נייר diap נקיאה כרית על הספסל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 ס&quot;מ צלחות פטרי עם קרים כקרח DM עבור הרחם ואת העובר על הספסל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרח על פלטפורמת מיקרוסקופ לנתיחה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2-3 מנות 6cm עם DM על הקרח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PM חמה אמבטיה 37 מעלות צלזיוס המים </li></ul><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים הרה Sprague-Dawley חולדה (E16) על פי נוהל שאושר על ידי טיפול בבעלי חיים קשר מוסדי שלך הוועדה (IACUC) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את חולדה על כרית חיתול ואלכוהול לעקר על אזור הבטן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פינצטה כדי להחזיק את עור הבטן מספריים לעשות חתך בצורת V חיתוך רק את העור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מפושקות את העור ולהשתמש אחר פינצטה ומספריים מעוקרים לחתוך דרך שכבת השריר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את שרשרת של שקי העובר ולהעביר אותם לתוך צלחת 10 ס&quot;מ המכיל קר כקרח DM </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים microdissection, להסיר בזהירות כל העובר מן השק והמוח מעובר אחד, והמקום משוחררים המוח לתוך צלחת 10 ס&quot;מ נקי עם DM על פלטפורמת קרח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף למינרית תחת מיקרוסקופ לנתיחה, להסיר המוח התיכון / למוח האחורי מקטעים להשתמש במלקחיים בסדר להסיר קרומי המוח, הקורטקס ולהעביר ניקה / ההיפוקמפוס לצלחת 6cm חדש עם DM על חבילת קרח הערה: בשלב זה, הרקמה מוכן לעיכול האנזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את papain פתרון מעכב טריפסין ולסנן לעקר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת עודפי DM של קליפת המוח / hippocampi </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4ml של הפתרון papain מוכן לעיכול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת כל תוכן הצינור 50 מ&quot;ל ובמקום הצינור פלקון באמבט מים ב 37 ° C 5 דקות בדיוק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון papain עם פיפטה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל מעכב טריפסין פתרון, מערבולת הצינור, ומקום באמבט המים 37 מעלות צלזיוס למשך 2-3 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מעכבי טריפסין פתרון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 13 ו 14 שלוש פעמים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף PM חמים 20ml </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Triturate עד גושים כל נעלמו (~ 20-30 פעמים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 100xg עבור 7min </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור ב 10 מ&quot;ל PM ולשטוף פעמיים על ידי צנטריפוגה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור ב 10 מ&quot;ל PM עבור תרבויות נוירון רגיל או NBB27/DMEM עבור תרבויות המצרפי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את התאים באמצעות הנפות תא 70μm </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים חיים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך תרבויות במצטבר כמפורט להלן או צלחת התאים על תרבויות נוירון קבוע הערה: בשלב זה, מועשר תרבויות נוירון יכולה להיות מושגת על ידי ציפוי התאים ניתק על PDL ציפוי צלחות בצפיפות של התא 200-640 / 2 מ&quot;מ בהתאם לצורך ניסויים. אחרי התאים המצורפת (~ 2-4H), להחליף בינוני עם ראש חמים. אם culturing במשך פרקי זמן ארוכים, ביום 4, להחליף מחצית בינונית עם CM חם. עבור מטוהרים מאוד תרבויות העצבית, מעכב mitotic 5-FdU (הריכוז הסופי 10 מיקרומטר) ניתן להוסיף את DIV2 לעכב שאינם התפשטות תאים עצביים (כלומר, במהלך DIV2-3). לאחר התאוששות CM עבור 2 ימים, תאים שטופלו שוב דופק עוד 2 ימים (DIV 6-7) ואחריו שינוי בינוני מלא עם 5-FdU. לאחר מכן, להחליף מחצית בינונית עם, CM טרי חם מדי 3-4 ימים. נוירונים הם קיימא עבור עד 4 שבועות. </li></ol> מצרפי הכנת ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות תאים ניתק במדיום NBB27/DMEM המכיל 1x סאטו, 10ng/ml CNTF ו 10μM forskolin בצפיפות של 2x10 6 תאים / מ&quot;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 2ml ההשעיה תא לבאר כל צלחת 6-גם ללא ציפוי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות עבור 3 לילות. כל יום, בעדינות resuspend התאים פעם באמצעות Pipetman P1000 הערה: תאים להתחיל ליצור אגרגטים (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום שלפני ציפוי צבירה, מעיל צלחת / coverslips עם Matrigel: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל מניות Matrigel (גורם גדילה מופחת, BD Biosciences 354230) 01:20 מקור DMEM על הקרח הערה: aliquots Matrigel צריכים להיות מוכנים לכל פרוטוקול היצרן. כל הטיפים, צינורות Eppendorf פתרונות להכנת aliquots של המניה אמור להיות קר, כדי למנוע פילמור Matrigel. Aliquots של Matrigel נשמרים ב -80 ° C ו מופשר ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל בעבר PDL מצופה coverslips עם 300μl/well הפתרון Matrigel בדילול לילה 37 ° C חממה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם PBS חמים, ואז לשטוף צלחת עם חם סטרילי DDH 2 O ולהשאיר את הצלחות בחממה. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 ימים לאחר היווצרות צבירה, בעדינות resuspend תאים שוב מסננת את ההשעיה דרך רשת 200μm לתוך צינור פלקון 50 מ&quot;ל. אפשר אגרגטים ליישב לתחתית הצינור על ידי כוח הכבידה (~ 3-5min) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות supernatant </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני, בעדינות resuspend המצרפים ולתת להם להתיישב שוב. חזור על תהליך זה מספר פעמים על מנת להסיר תאים מתים, תאים בודדים ופסולת. השתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק אם supernatant עדיין מכילים שאינם מצטברים התאים debris </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות resuspend המצרפים במדיום NBB27/DMEM אותו (איור 1) ולספור אגרגטים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את צפיפות של אגרגטים כדי aggreggats/50ul סביב 25-30 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת aliquots (500 1000μl) של ההשעיה במצטבר לצינורות 2ml Eppendorf עבור ציפוי הערה: מאחר המצרפים נוטים להתיישב אל החלק התחתון של הצינורות, חשוב להפוך את צינורות מרובים של ההשעיה במצטבר עבור ציפוי. בעדינות resuspend המצרפים לעתים קרובות לפני זריעה אותם על coverslips מצופה או צלחות תרבות על מנת להבטיח מספר דומה של אגרגטים מצופה על כל coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו את הצלחת תרבות המכילה Matrigel מצופה coverslips מן החממה. הסר פתרון מבאר כל, לשטוף את coverslips עם PBS חם DDH 2 O, ולאחר מכן לזמן קצר ויבש. עכשיו הם מוכנים זריעת המצרפי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היפוך צינור המכיל ההשעיה במצטבר כדי לאפשר להם להיות מופץ באופן שווה לפני זריעה. טען 50μl ההשעיה במצטבר למרכז coverslip כל, בעדינות לשים את הצלחת בחזרה חממה ללא הפרעה נוספת כדי לאפשר אגרגטים לצרף באופן שווה על coverslip הערה: צפיפות של אגרגטים הוא קריטי. אם מצרפים הם זורעים קרוב מדי זה לזה, או אם צפיפות זריעה היא גבוהה, הם נוטים להתמזג יחד ככל שהם גדלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף DMEM/NBB27medium נוספים (500 μl) ל 4-6 שעות כל טוב מאוחר או מוקדם בבוקר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמר את התרבות המצרפי, חצי שנה את בינונית כל 3-4 ימים. כאשר השינוי בינוני, להיזהר שלא לשבש את אגרגטים זה נעשה על ידי הוספת בעדינות בינוני לאורך הקיר בצד של הבאר. הערה: שעות ספורות לאחר אגרגטים המצורפת צלחת, תולדה של אגרגטים neurite ניתן לצפות. האקסונים לגדול במהירות בשבועיים הראשונים וליצור קשרים בין שפע אגרגטים (איור 2). אבות גליה להעביר רדיאלית מתוך אגרגטים להבדיל לאורך זמן לתוך האסטרוציטים ו oligodendrocytes בוגרת. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1304/1304fig1.jpg" alt="דמות 1" /> באיור 1. בניגוד שלב תמונות של תאים ויוצרים אגרגטים בכל יום אגרגטים שונים לאחר כביסה. <img src="/files/ftp_upload/1304/1304fig2.jpg" alt="דמות 2" /> איור 2. בניגוד שלב תמונות של תרבות המצרפי 2 ו - 12 ימים לאחר seeded על Matrigel מצופה coverslips.

<ol>
	<li>Matthieu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+in+rat+brain+aggregating+cell+cultures.">Myelination in rat brain aggregating cell cultures.</a> Neuroscience. 3, 565-56 (1978).</li><li>Chen, Y. i. n. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells.">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat. Protocols. 2, 1044-10 (2007).</li><li>Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+stages+of+myelination+regulated+by+gamma-secretase+and+astrocytes+in+a+rapidly+myelinating+CNS+coculture+system.">Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system.</a> Neuron. 60, 555-55 (2008).</li><li>Svenningsen, A. F., Shan, W. e. i. -. S. o. n. g., Colman, D. a. v. i. d. R., Pedraza, L. i. l. i. a. n. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+method+for+culturing+embryonic+neuron-glial+cell+cocultures.">Rapid method for culturing embryonic neuron-glial cell cocultures.</a> Journal of Neuroscience Research. 72, 565-56 (2003).</li></ol>

מחקרים מוקדמים דיווחו על היווצרות של הסינפסות המיאלין בוגרת ברוטציה בתיווך תרבויות חינם המצרפי צף 1. CNS תרבות המצרפי המערכת המתוארת כאן משלבת סרום ללא צמיחה של ובתאים multipotent בשלושה אגרגטים ממדי עם הנוחות של תרבויות מסורתיות 2D כדי להקל על ניתוח של התפתחות הנדידה...

preparation of rat brain aggregate cultures for neuron and glia development studies

במערכת במבחנה כי משחזר את התפתחות והתמיינות של אבות לתוך נוירונים בוגרים ו גליה במערכת העצבים המרכזית (CNS) תספק פלטפורמה חזקה עבור מדעני מוח כדי לחקור axo-גליה אינטראקציות, תכונות והבחנה של אבות multipotent, והתקדמות של oligodendroglial שושלת התאים ברמה תאית ומולקולרית. אנו מתארים כאן CNS תרבות המצרפי המערכת forebrains עוברי חולדה, אשר יכול להישמר בכל מדיום בסרום חופשי עד 3-4 שבועות, והוא משמש במעבדה שלנו כמודל ללמוד נוירון, גליה אינטראקציה myelination CNS. זה סרטון תדגים כיצד לבודד ולגדל אלה CNS תרבויות המצרפי מהמוח E16 חולדה. יתר על כן, מן לנתיחה אותו מוח, מועשר תרבויות קבוע העצבית ניתק ניתן להשיג בקלות המשמש במחקרים שונים על נוירונים במערכת העצבים המרכזית או המשמש שיתוף תרבויות עם תאים אחרים.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies at JoVE.com

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

פרוטוקולים עבור מערכת עובריים במוח חולדה המצרפי תרבות מתואר. אבות multipotent ב אגרגטים יכול לפתח להתמיין נוירונים, האסטרוציטים ו oligodendrocytes.

הכנת המוח עכברוש תרבויות מצטבר עבור Neuron ופיתוח מחקרים גליה

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

preparation-rat-brain-aggregate-cultures-for-neuron-glia-development

Research

JoVE Journal

Biology

12.3K Views.  Texas A&M University (TAMU). פרוטוקולים עבור מערכת עובריים במוח חולדה המצרפי תרבות מתואר. אבות multipotent ב אגרגטים יכול לפתח להתמיין נוירונים, האסטרוציטים ו oligodendrocytes.

Video: Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

תרבויות עצבית ראשונית של המוח של Late Stage תסיסנית גלמים

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

הכנת תרבויות העצבית מ Midgastrula עוברים שלב תסיסנית

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

ALS - Motor Neuron Disease: Mechanism and Development of New Therapies

Jeffrey D. Rothstein speaks about the pathology and mechanisms underlying amyotrophic lateral sclerosis or ALS, advances in ALS research, and current strategies towards the development of therapies.

ALS - מחלת Motor Neuron: מנגנון ולפיתוח טיפולים חדשים

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

המצאה של המכשיר microfluidic עבור מידור של Neuron סומה האקסונים

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

הכנת ניתק תרבויות עכבר קליפתיים Neuron

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

הכנת 2-dGuo שטופלו תרבויות איברים קורנית

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons. The neurons are large (up to 1 mm in diameter) and identifiable, with distinct sizes, shapes, positions and pigmentations, and the cell bodies are externally exposed in five paired ganglia distributed throughout the body of the animal. These properties have allowed investigators to delineate the circuitry underlying specific behaviors in the animal1. The monosynaptic connection between sensory and motor neurons is a central component of the gill-withdrawal reflex in the animal, a simple defensive reflex in which the animal withdraws its gill in response to tactile stimulation of the siphon. This reflex undergoes forms of non-associative and associative learning, including sensitization, habituation and classical conditioning. Of particular benefit to the study of synaptic plasticity, the sensory-motor synapse can be reconstituted in culture, where well-characterized stimuli elicit forms of plasticity that have direct correlates in the behavior of the animal2,3. Specifically, application of serotonin produces a synaptic strengthening that, depending on the application protocol, lasts for minutes (short-term facilitation), hours (intermediate-term facilitation) or days (long-term facilitation). In contrast, application of the peptide transmitter FMRFamide produces a synaptic weakening or depression that, depending on the application protocol, can last from minutes to days (long-term depression). The large size of the neurons allows for repeated sharp electrode recording of synaptic strength over periods of days together with microinjection of expression vectors, siRNAs and other compounds to target specific signaling cascades and molecules and thereby identify the molecular and cell biological steps that underlie the changes in synaptic efficacy.
An additional advantage of the Aplysia culture system comes from the fact that the neurons demonstrate synapse-specificity in culture4,5. Thus, sensory neurons do not form synapses with themselves (autapses) or with other sensory neurons, nor do they form synapses with non-target identified motor neurons in culture. The varicosities, sites of synaptic contact between sensory and motor neurons, are large enough (2-7 microns in diameter) to allow synapse formation (as well as changes in synaptic morphology) with target motor neurons to be studied at the light microscopic level.
In this video, we demonstrate each step of preparing sensory-motor neuron cultures, including anesthetizing adult and juvenile Aplysia, dissecting their ganglia, protease digestion of the ganglia, removal of the connective tissue by microdissection, identification of both sensory and motor neurons and removal of each cell type by microdissection, plating of the motor neuron, addition of the sensory neuron and manipulation of the sensory neurite to form contact with the cultured motor neuron.

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Primary cultures of Aplysia sensory-motor neurons provide a model preparation for studying synapse formation and synaptic plasticity in vitro. This video demonstrates the identification and microdissection of sensory and motor neurons from Aplysia ganglia as well as the methods for establishing and maintaining sensory-motor neurons in culture.

הכנת Aplysia חושי, מנוע תא תרבויות העצבית

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to six independent experiments in parallel for higher-throughput. We developed a new fabrication method to create microfluidic devices having both micro and macro scale structures within the same device through a single soft-lithography process, enabling mass fabrication with good repeatability.
The multi-compartment microfluidic co-culture platform is composed of one soma compartment for neurons and six axon/glia compartments for oligodendrocytes (OLs). The soma compartment and axon/glia compartments are connected by arrays of axon-guiding microchannels that function as physical barriers to confine neuronal soma in the soma compartment, while allowing axons to grow into axon/glia compartments. OLs loaded into axon/glia compartments can interact only with axons but not with neuronal soma or dendrites, enabling localized axon-glia interaction studies. The microchannels also enabled fluidic isolation between compartments, allowing six independent experiments to be conducted on a single device for higher throughput.
Soft-lithography using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) is a commonly used technique in biomedical microdevices. Reservoirs on these devices are commonly defined by manual punching. Although simple, poor alignment and time consuming nature of the process makes this process not suitable when large numbers of reservoirs have to be repeatedly created. The newly developed method did not require manual punching of reservoirs, overcoming such limitations. First, seven reservoirs (depth: 3.5 mm) were made on a poly(methyl methacrylate) (PMMA) block using a micro-milling machine. Then, arrays of ridge microstructures, fabricated on a glass substrate, were hot-embossed against the PMMA block to define microchannels that connect the soma and axon/glia compartments. This process resulted in macro-scale reservoirs (3.5 mm) and micro-scale channels (2.5 &mu;m) to coincide within a single PMMA master. A PDMS replica that served as a mold master was obtained using soft-lithography and the final PDMS device was replicated from this master.
Primary neurons from E16-18 rats were loaded to the soma compartment and cultured for two weeks. After one week of cell culture, axons crossed microchannels and formed axonal only network layer inside axon/glia compartments. Axons grew uniformly throughout six axon/glia compartments and OLs from P1-2 rats were added to axon/glia compartments at 14 days in vitro for co-culture.

We developed a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research. The platform is capable of conducting up to six independent experiments in parallel and was fabricated using a newly developed macro/micro hybrid fabrication method.

תא Multi-CNS-Neuron גליה שותף תרבות Microfluidic רציף

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

רעלן אינדוקציה ואת מיצוי חלבון מן Fusarium Spp. תרבויות ללימודי proteomic

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working with those tissues is challenging because they are very fragile, and until now there was no rigorously detailed protocol for their isolation.
Faced with these challenges, we have developed methods and instruments to facilitate manipulation of RTTs and control tissue viability, sterility and integrity. This article describes the experimental procedures used to prepare RTTs for biomechanical and mechanobiological studies. Our work is divided into four main steps: extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.
At each step, all procedures, materials and manipulations are presented in detail so that they can be easily reproduced. Moreover, the specific instruments developed are presented: a manipulation plate used to segregate RTTs, an optic micrometer to position the tissue during the cross-sectional area measurement and an anchoring system to attach the RTTs onto a bioreactor.
Finally, we describe the results obtained after multiple tests to validate our methods. The viability, sterility and integrity evaluations demonstrate that our procedures are sufficiently rigorous for manipulations of fragile tissues such as rat tail tendons.

This article describes the experimental procedures used to prepare rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies. Several features of the main steps in preparation are demonstrated, beginning with extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.

הכנת הגידים זנב עכברוש ללימודי biomechanical ו Mechanobiological

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...