עבודה זו נתמכה על ידי מימון לRAW מבין האפשרויות הבאות: מענקי NIH K01 DK083512, DP2 OD008470, וR01 DK100237; מצעד הפרוטות בזיל אוקונור Starter Scholar פרס # 5-FY12-75; להתחיל את הכספים מאוניברסיטת נוטר דאם המכללה למדעים והמחלקה למדעי ביולוגיה; ומתנה נדיבה לאוניברסיטת הנוטר דאם מאליזבת ומייקל גלאגר מטעם משפחת גלאגר לטפח מחקר בתאי גזע. היו הממנים שום תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם, או הכנה של כתב היד. אנו מודים לצוותות של המחלקה למדעי ביולוגיה על תמיכתם, והמרכז לחקר דג הזברה בנוטרה דאם על המסירות יוצאת דופן שלהם בטיפול וברווחה של המושבה דג הזברה שלנו. אנו מודים GF גרלך ללקיחת התמונות הניתנות באיור 4. לבסוף, אנו מודים לכל החברים של מעבדת המחקר שלנו להערות, הדיונים וinsigHTS על עבודה זו.

הערה: הנהלים לעבודה עם עוברי דג הזברה שתוארו בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת נוטרדאם. הערה: אף על פי הפרוטוקול הבא מספק הדגמה של בידוד זרע שכרוך בהמתת חסד של זכרים, זרע ניתן לאסוף מנקבובי באיברי המין של הרדים חיים דג הזברה זכר באמצעות לחץ בטן עדין וmicrocapillary לאיסוף זרע 17,18. סחיטה של זכרים חיים דורשת כמה גברים כדי לשמש על מנת לאסוף כמות שווה הערך של זרע שניתן להשיג מאחד 17,18 זכר מורדמים. עם זאת, גברים שעברו סחיטה להישאר בריאים למדי ויכולים לשמש להזדווגויות טבעיות או נהלים שבלאחר מכן מבחנה 17. במידת האפשר, נהלים שנבחרו צריכים למזער הקרבת דגים מיותרת. 1. הכנת הפתרונות ולשכות מזווגים דג הזברה &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות המניות של האנק (# 1, 2, 4, 6) וPremix הפתרון של האנק (ראה טבלת חומרים) 19, ולאחר מכן חיטוי ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את המספר הרצוי של נקבה בוגרת דג הזברה (ים) לאוסף מצמד הפלואידים. הערה: בהתבסס על ניסיון, באמצעות F1 mutagenized המורכב מדג זברת מתח טובינגן טהור, כ 50% מנקבות לבגרות מינית היו &#39;סחיטים&#39; בממוצע לאחר תחול אותם על ידי הצבת אותם בכלוב הזדווגות לילה עם גבר - כלומר מצמד הושג באמצעות ההליך הסחיט - ורוב הציפורניים אלה (הנעים בין 70-90%) המיוצר על haploids קיימא. עם שני חוקרי ביצוע ההכנה הפלואידים, דג הזברה F1 הנשי כ 80 מבוגר יכול להתמצות בבוקר אחד. כדי לחשב את חומרים כימיים נחוצים לניסוי, הגורם הפלואידים בשני השיעור לסחוט של דור F1 ומספר החוקרים הזמינים לבצע את experiment. זכור כי מספר הנקבות שיפיקו ציפורניים הפלואידים באיכות גבוהה מאוד משתנה, עם הבדלים שנצפו בין נקבות דג הזברה של זנים שונים, גילים, ודיאטה מזון 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כלובי הזדווגות על ידי הצבת כל נקבת דג הזברה מבוגר עם דג הזברה זכר בוגר בתא של מים במערכת, כך שהם מופרדים על ידי חוצץ בין לילה. הערה: נקבות צריכה להיות חשופות ללילה זכר לראש, או להכין אותם, להשרצה באמצעות סחיטה. </li></ol> 2. Dissection של אשכים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך טרי # 6 מלאי הפתרון של האנק ידי הוספת 0.35 גרם של סודיום ביקרבונט ל10 מיליליטר של מים מזוקקים. מערבבים היטב לפזר אבקת הסודה לשתייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב הבא בצינור על קרח על מנת להפוך את הפתרון עובד הסופי של האנק שנאגרו לזרע: 9.9 מיליליטר של הנקס Premix אני עם של פתרון מניות 100 μl # 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב, ולאחר מכן aliquot 500 μl של האנקפתרון של גמר עבודה לתוך צינור microcentrifuge ומניחים על קרח; 7. הערה: כל aliquot μl 500 ישמש כדי להכין את הזרע מהאשכים של 4-5 דג הזברה ממין זכר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בין 4-5 דג הזברה זכר לכל קציר זרע. הערה: זה למסוק מספיק זרע שנאסף, מעובד ומאוחסן בצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge אחד, אשר יכול להיות מנוצל כדי להפרות כ 15 ציפורניים הפלואידים. בחר מחזורים נוספים של זכרים על מנת להכין את צינורות נוספים תלוי בהיקף של הניסוי. אם דג הזברה הזכר שנבחר הוא קטנים או נתיחת האשכים אינן שלמה, בדרך כלל 5 זכרים יהיו צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים כל זכר באמצעות רשת להעביר בעדינות את הדגים לצלחת המכילה tricaine 0.2% למשך כ 5-6 דקות בטמפרטורת חדר. הערה: היזהר, כדי להבטיח שהזכר כבר מורדמים כראוי לפני תחילת הניתוח. בדרך כלל, להמתין מספר דקות (2-3) אחרי הזימים של מפסיק לנוע דגים והדגיםכבר לא מגיב למגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחור את הגברי בעדינות עם כפית פלסטיק ולמחוק את הזכר היבש של נוזל בזהירות. בשלב בא, להסיר את ראשו של הגבר עם זוג מספריים חד ולאחר מכן לחתוך חתך לאורך קו האמצע הגחון. הערה: להסרת של כל הנוזל העודף מהדגים היא חיונית כדי למנוע מפעילה הפעלה של הזרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הבטן ואיברי הבטן קשורה מחלל הבטן באמצעות מלקחיים ומקום טובים למכל Biohazard לסילוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים בסדר להסיר את האשכים, אשר ממוקמים לאורך קיר גוף הגבי, לרוחב לשלפוחית ​​השחייה, ויש לו מראה לבן אטום, כאשר מתחת לסטראו. הערה: שמירה על האשכים שלמים יכולה לעזור כדי למנוע חשיפה של הזרע לנוזלי גוף על בסיס מים ובכך למנוע הפעלה מוקדמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האשכים לתוך תמיסת הזרע בקרח ולשמור את הצינור על קרח כאשכים אחרים הם גזורים. חזור על שלבים 2.6-2.9 עד שכל מ &#39;Ales כבר גזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הפגרים וכל רקמות בבעלי חיים שנותרו למכל Biohazard להשלכה מוסדית מתאימה. </li></ol> 3. UV זרע איון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize האשכים בעדינות על ידי טחינת צינור microcentrifuge עם העלי microtube סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את supernatant לצלחת פטרי קטן או זכוכית שעון על קרח. הערה: אל תעביר פסולת רקמות יחד עם פתרון supernatant. הפעולה זו תיצור צללים ולהתפשר איון UV של זרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את צינור הזרע עם בין 300-400 μl של הפתרון של האנק נוסף גמר עבודה (מוכן בשלב 2.2 ומאוחסן על קרח), ולהוסיף לשטוף supernatant זה לצלחת פטרי הקטנה או לצפות בזכוכית בשלב 3.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הצלחת לUV ממנורת ספסל (254 ננומטר) עבור סכום כולל של 2 דקות במרחק ממקור המנורה של כ 15 ב( 38.1 סנטימטר). הערה: השתמש בזהירות בעת עבודה עם מנורת UV וללבוש מגן פנים אוציוד אחר עין מגן אישי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את הצלחת לדלי הקרח, ואז להעביר את הזרע המומת UV לצינור microcentrifuge טרי ולאחסן את המדגם על קרח. הערה: בשלב זה לא יהיה כ 800 μl של זרע UV מומת להפריה מצמד הפלואידים. הזרע צריך להיות כל הזמן על קרח לאורך כל משך הזמן המושקע בלוחץ נקבות. זרע בהאנק של קר יכול לשמש לתקופה של עד 6 שעות ללא הפחתה כלשהי בתוצאות הפריה. מעניין לציין, כי חוקרים אחרים דיווחו כי הזרע בהאנק של קר הוא בת קיימא מכמה שעות עד כמה ימים 18. </li></ol> 4. רכש ביצה ממבוגרי דג הזברה נקבה והפריה חוץ גופית של המצמד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אמבטיה tricaine להרדמה על ידי שילוב של 20 מיליליטר של 0.2% מניית tricaine עם 80 מיליליטר של מים במערכת דגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הנקבה לאיסוף ביצים, תוך שימוש ברשת כדי למקם אותה בעדינות בצלחת של TRicaine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה 2-3 דקות עד שהנקבה היא מורדמת וכבר לא מגיב למגע. הערה: אם הפרכוסים או נקבה מעוררות תנועות אחרות, לתת זמן הנוסף להיכנע להרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכפית פלסטיק בעדינות להרים את הנקבה, decanting הפתרון לפני הצבת הנשים על גבי מגבת נייר לפתיל משם את נוזלים עודפים. הערה: היזהר שלא לעזוב את פתרון נוסף על הנקבה, כנוזל יפעיל הפעלת ביצה לפני התוספת של זרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הנקבה בשקופית שלה בצלחת פטרי נקייה ולדמיין את בטנה מתחת לסטראו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלטף את הבטן של הנקבה בעדינות במשך כ 10-20 שניות באמצעות אצבע אחת או שתיים מהיד אחת כדי לסחוט את הביצים מהבטן שלה, בינתיים תמיכה בגב של הנקבה על ידי מיקום אצבע אחת או שתיים מצד השני, ממש מאחורי קיר הגוף הגבי שלה. הערה: לאחר שמלטף את הבטן של הנקבה, את הביצים צריכה לצאת בקלות רבה. אם ביצים לא תצא שנינותשעות להקל זה לא מומלץ ל&#39;לדחוף חזק יותר &#39;וביצים בכוח מהמין הנקבה. זה מצביע על כך הביצים אינן נוכחים ו / או לא מוכנות להפריה, והמשיך לדחוף קשור לסיכון ניכר של פגיעה בנשים (למשל, ניכוי שלפוחית ​​השחייה או גרימת חבלה פנימית קטלנית אחרת). אם נקבה היא לחצה אבל מספקת ביצים אף אחד או כמה, להחזיר את הנקבה למתקן של בעלי החיים. לאחר 1-2 שבועות של מנוחה, זוג הנקבה עם זכר להזדווגות טבעית כדי לנקות את פסולת ביצה שיורית. להפריד נקבות, כי בן הזוג באופן טבעי למכל לעוד 1-2 שבועות של מנוחה לפני שאתה מנסה לסחוט שני. לחלופין, יכולות להיות נחות נקבות במשך 4 שבועות, שבמהלכם ניתן להגדיר להזדווגויות טבעיות 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בדיקה קנס או מרית קטנה כדי לגרוף את ביצים מתחת לנקבה ו / או משטחה בבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רם בעדינות את הנקבה ותחזיר אותה למכל בידוד שכותרתו כראוי מכיל מים מערכת דגים. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של פתרון זרע UV מומת למקבץ ביצים, ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 30 שניות שבמהלך זמן, להדביק תווית מתאימה לצלחת לעקוב אחריו עם המספר שהוקצה להורה הנקבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של E3 לביצים, ודגירה בטמפרטורת חדר למשך דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת פתרון E3 מספיק כדי למלא את הצלחת באמצע הדרך, ולמקם את העוברים ב28 מעלות צלזיוס במשך דגירה לאחר מכן. הערה: התוספת של פניצילין / סטרפטומיצין (1% (v / v) פתרון העט סטרפטוקוקוס המכיל פניצילין 5,000 יחידות ו -5 סטרפטומיצין מ&quot;ג לכל מיליליטר) 19 לE3 יכול לסייע בבריאות כללית של העוברים הפלואידים. </li></ol> 5. תצפית וטיפול בעוברי הפלואידים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 4-8 שעות, להסיר עובר מופרה מהצלחת ולשטוף את העוברים שנותרו על ידי החלפת כלי תקשורת עובר E3 עם פתרון E3 טרי. הערה: עוברים מופרה יציגו מראה לבן, אטום או יכולים להציג שקוףppearance עם תא בודד מעוות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עד נקודת העניין בזמן רצוי, ולאחר מכן לנצל בassay המסך הרצוי או יישום אחר במחקר (ים). </li></ol>

<ol>
	<li>Haffter, P., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+genetics+in+a+small+vertebrate,+the+zebrafish.">Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish.</a> Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+Modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li><li>Haffter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+genes+with+unique+and+essential+functions+in+the+development+of+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 1-26 (1996).</li><li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish.">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-43 (1996).</li><li>Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+make+a+big+splash.">Zebrafish make a big splash.</a> Cell. 87, 969-977 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+insertional+mutagenesis+screen+in+zebrafish.">A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish.</a> Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).</li><li>Bradford, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFIN:+enhancements+and+updates+to+the+zebrafish+model+organism+database.">ZFIN: enhancements and updates to the zebrafish model organism database.</a> Nucleic Acids Res. 39, (2011).</li><li>Bowen, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+mapping+and+cloning+of+mutations+in+zebrafish+by+low-coverage+whole-genome+sequencing.">Efficient mapping and cloning of mutations in zebrafish by low-coverage whole-genome sequencing.</a> Genetics. 190, 1017-1024 (2012).</li><li>Leshchiner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+mapping+and+identification+by+whole-genome+sequencing.">Mutation mapping and identification by whole-genome sequencing.</a> Genome Res. 22, 1541-1548 (2012).</li><li>Obholzer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+positional+cloning+of+zebrafish+mutations+by+linkage+and+homozygosity+mapping+using+whole-genome+sequencing.">Rapid positional cloning of zebrafish mutations by linkage and homozygosity mapping using whole-genome sequencing.</a> Development. 139, 4280-4290 (2012).</li><li>Voz, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+homozygosity+mapping+and+identification+of+a+zebrafish+ENU-induced+mutation+by+whole-genome+sequencing.">Fast homozygosity mapping and identification of a zebrafish ENU-induced mutation by whole-genome sequencing.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Walker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploid+screens+and+gamma+ray+mutagenesis.">Haploid screens and gamma ray mutagenesis.</a> Meth Cell Biol. 60, 43-70 (1999).</li><li>Steisinger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291, 293-296 (1981).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+2,+Embryo+Production+by+in+vitro+fertilization.&#8221;.">Chapter 2, Embryo Production by in vitro fertilization.&#8221;.</a> The Zebrafish Book 4th ed. , (2000).</li><li>Walker, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+gynogenetic+diploid+zebrafish+by+early+pressure.">Making gynogenetic diploid zebrafish by early pressure.</a> (28), (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10:+Recipes.&#8221;.">Chapter 10: Recipes.&#8221;.</a> The Zebrafish Book 4th ed. , (2000).</li><li>Yi, M., Hong, N., Hong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+medaka+fish+haploid+embryonic+stem+cells.">Generation of medaka fish haploid embryonic stem cells.</a> Science. 326, 430-433 (2009).</li><li>Yi, M., Hong, N., Hong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+haploid+embryonic+stem+cell+cultures+in+medaka+fish.">Derivation and characterization of haploid embryonic stem cell cultures in medaka fish.</a> Nat Protoc. 5, 1418-1430 (2010).</li><li>Layton, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Undertaking a successful gynogenetic haploid screen in zebrafish.&#8221; Zebrafish, Methods and Protocols. 1st ed. , (2009).</li><li>Wingert, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros.">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+nephrogenesis+involves+dynamic+spatiotemporal+expression+changes+in+renal+progenitors+and+essential+signals+form+retinoic+acid+and+irx3b.">Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b.</a> Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הקרנת הפלואידים היא טכניקה שימושית כדי לגלות גנים חיוניים הנדרשים לשלבים התפתחות מוקדמים. יתר על כן, culturing של תאים הפלואידים מדגי medaka נעשה שימוש כדי לבודד את שורות תאים כמו ES שיש מחקר יישומים רבים ופוטנציאל, הוכחת כי תאים הפלואידים עשויים לספק מקום בעתיד בעל ערך עבור סוגים אחרים של מחקרים גנטיים חוליות 20,21. פרוטוקול זה מספק הדגמה של השיטות מעורבות עם ביצוע הייצור של עוברי דג הזברה הפלואידים באמצעות הפריה חוץ גופית עם זרע UV מומת. מתודולוגיה זו ניתן להשתמש כדי לבצע מסכי קדימה הפלואידים עם דגי F1 mutagenized, אשר יכול להתבצע באמצעות סוג בר, מהונדס או זנים מוטנטים להקרנה משפר / מדכאת. למרות זמן ההקרנה משתמש באסטרטגית הפלואידים הוא במידה רבה מתקצר בהשוואה להקרנת דיפלואידי, זה בכל זאת לקחת כמה חודשים כדי להשלים. כפי שאנו descriהמיטה בעבר, יש יתרונות רבים שקיימות על ידי ביצוע מסך באמצעות סכימה הפלואידים, כל מה שיכול לסייע בקבלת תרומות חדשניות לידע הנוכחי על כל מספר של אירועים התפתחותיים. המתודולוגיה מסך הפלואידים היא יעילה יותר לזיהוי אללים מוטציה רצסיבית ממסכים מבוססי דיפלואידי בשל ההפחתה של זמן, המרחב, ואת מספר הדגים שיש צורך. עם זאת, ישנם מספר החסרונות למסך הפלואידים. מסך הפלואידים יכול רק לזהות מוטציות בגנים הפועלים בתחומי הימים הראשונים של פיתוח, כעובר יכול לשרוד רק לזמן מוגבל עם הגנום הפלואידים. הגנים שבאים לידי ביטוי מאוחר יותר בפיתוח הייתם צריכים להיות מזוהים על ידי שיטה אחרת, כגון מסך דיפלואידי. כמו כן, כמה איברים לא מתפתחים כראוי באורגניזם הפלואידים. יתכנו מומים אנטומיים, או שעתי עיכוב של פיתוח, שעלול לגרום למוטציה להיות על ידי טכניקת ההקרנה הפלואידים שלא נענתה. אניבנוסף n, כמה זנים של דגים לא מתפתחים, כמו גם במצב הפלואידים 15. ניתן לסווג Haploids על ידי סדרה לדירוג של תכונות עובריים טובות, בינוניות וגרועות, עם עוברים להיות הכי הנורמלי, B לייעד עובר עם מומים בציר אבל ראש צלול וזנב, ו-C / D לייעד עובר עם הכר תכונות (המונים של תאים על גבי כדורי חלמון) 15,17. הפרופורציות של עוברים בתוך קטגוריות אלה משתנות בהתאם לזן דג הזברה, עם מספרים מוגברים של haploids איכות טובה יותר שכיח יותר ברקע גנטי מסוים 15,17. בשל גורמים אלה, יש צורך למצוא את מתח נכון של דג הזברה לבצע mutagenesis וצלבים שלאחר מכן. בניסיון האחרון שלנו, את מתח טובינגן סוג בר הפיק haploids קיימא לסינון (כפי שמוצג באיורים 3 ו 4) אם כי חוקרים היסטורי דג הזברה יש ניצלו את AB או AB * הזנים לexperim הפלואידיםentation 15. בנוסף לאתגרים הנ&quot;ל, לא כל נקבות דג הזברה מבוגר דרוכים תפיק מצמד על ביצוע טכניקת הסחיטה. לדוגמא, בעבודה עם נקבות זן טובינגן mutagenized-ENU, כמחצית מכל הנשים המיוצרת על מצמד לוחץ, ואיזה חלק מהם (בדרך כלל 10-30%) היה באיכות ירודה או עובר לא יכול להיות מופרה. לכן, כדי לבצע מסך הפלואידים אחד חייב לתכנן להעלות דגים לפחות פעמיים לפי צורך להקרין את המספר הרצוי של הגנום (כל נקבה מייצגת גנום אחד הוקרן). ללא קשר לשיקול זה, את היתרונות של שיטת הפלואידים של הקרנה כדי לכסות מספר גדול של גנומים ללא מתקן בעלי חיים מאסיבי הם אכן די משמעותיים אם assay הוא נוח למדינה הפלואידים. עם זאת, זה צריך להיות גם ציין כי המחקר נוסף של המוטציה (ים) שזוהה במצמד הפלואידים הוא סומך באופן מלא על גיוס בהצלחהoutcross n מהנשי המייסד. כמו בכל מסך, &#39;פוגע&#39; בתחילה זוהה במהלך תהליך המיון חייב להיות מחדש שזוהה במצב דיפלואידי. למרות החסרונות של שימוש במסך הפלואידים, זה הוכיח להיות מוצלח מאוד בזיהוי מוטציות, שכבר ניתחו לעומק עם רווחי תובנה התחום המדעי 15. יכולים להיות מיושמים במסכים הפלואידים כדי לחקור תהליכים הבינו היטב אחרים של התפתחות חוליות. שימוש haploids למסכים משפר ומדכאים הוא אחת דרכים להשיג תובנה רבה יותר על הפעילויות ורשת רגולציה של גן של עניין. גם טכניקת הקרנת הפלואידים יכולה לשמש כדי לזהות משפרי ומדכאים של מוטציות שכבר מבודדים על ידי שיטות כגון mutagenesis כימי או insertional או להפוך גנטיקה גישות כמו עיבוד הקרקע או TALENs. בקיצור, המוטציה מבודדת בעבר ניתן mutagenized עם ENU והוקרנה למשפרים או suppressors של פנוטיפ מוטנטי המקורי. המוטציה חייבת להיות מסוגל להגיע לשלבים בוגרים, ולכן יש צורך להיות בעלי חיים הטרוזיגוטיים או דגים מוטנטים הומוזיגוטים חלשים לבצע מסך זה, עם זאת ההתקדמות בtransgenesis אפשרה לחוקרים לעקוף את הבעיה הזו. ללמוד איך לתפעל מסלולים בפיתוח יכול להוביל להרבה אפשרויות מרגשים כולל האפשרות של מסלולים מביכים לטיפול במצבי מחלה.

התהליכים הבסיסיים שלתזמר פיתוח חוליות הם נשמרים באופן כללי 1. דרך רבת עוצמה לזיהוי גנים עם תפקידים חיוניים בפיתוח היא לבודד מוטציות תורשתיות הגורמים לפגמים פנוטיפי בתהליך של עניין. דג הזברה, Danio rerio, הוא בעלי חוליות קטנים של מים מתוקים השייך למשפחת דגי Cyprinidae שהפכה לאורגניזם מודל בשימוש נרחב לגנטיקה התפתחותית חוליות בעשורים האחרונים 2. ביצי דג הזברה הם מופרה חיצוניים, המאפשרים גישה להזיגוטה מהתחלתה של הפריה 3. יתר על כן, העובר המוקדם הוא שקוף אופטי, המאפשר הדמיה של פיתוח עם סטראו פשוט 3. ontogeny דג הזברה הוא מהיר, עם התהליכים של מחשוף, gastrulation, וorganogenesis של מבנים רבים, כגון לב וכליות, השלימו במידה רבה על היום הראשון של פיתוח 3. Tהוא הזמן משלבי זחל לבגרות מינית לוקח 2-3 חודשים, והמבוגרים הם בעלי חוליות קטנות כ 3-4 סנטימטר באורך, יכול להישמר כל כך הרבה דגים בשטח מינימאלי 2. בנוסף, יש לי מבוגרים דג הזברה פוריות גבוהה, עם כל דגים מסוגלים לייצר כמה מאה עוברים בשבוע 2. תכונות אלו הפכו את העקיבות של דג הזברה לקדימה לאחור מסכי גנטיים. דג הזברה יש רמה גבוהה של שימור באנטומיה שלהם, ביולוגיה של תא, ופיזיולוגיה עם יותר מינים של בעלי חוליות מתקדמים כמו יונקים 2,4. למעשה, ניתוח הרצף האחרון הוכיח כי הגנום דג הזברה מכיל homologs לכמעט 70% מהגנים אנושיים 5. שימור זו אפשר לחוקרים להשתמש בדג זברה כמודל למחלות בבני אדם רבים, ובם שתי עובריים ו2,4 תנאים מבוגרים. יחדיו, גורמים אלה הפכו את דג הזברה מערכת מצוינת למסכים שמטרתה זיהוי גנים החיוני לontogeny חוליות נורמלי. מספר המסכים בקנה מידה הגדול שבוצע בדג זברה וזיהה כמה אלף מוטציות בגנים התפתחותיים 6-8. זכר בוגר דג הזברה הוא נוח לmutagenesis, ויכולים להיות שנוצרו שינויים כרומוזומליים בתדירות גבוהה יחסית באמצעות ethylnitrosourea mutagen הכימי (ENU) 6,7 או mutagenesis insertional רטרווירלי 9. נכון להיום, למעלה מ 9,000 מוטציות תורשתיות נוצרו, והם כוללים גנים המשפיעים כמעט על כל ההיבטים של עובר. קהילת דג הזברה הקימה בנק מרכזי של מוטציות אלה במרכז דג הזברה הבינלאומי המשאבים (או Zirc) 10, שנאסף כ -5,000 אללים מוטנטים ומהונדסים מכל רחבי העולם. רבים ממוטציות אלו כבר נותחו ומשובטים, לתת לחוקרים על פני תחומים ביולוגיים מידע בעל ערך שבו נעשה שימוש להקניט בנפרד נומרומסלולי הסלולר והפיסיולוגיים דרך תובנות שמקורן בניסויי דג הזברה. למרות שמסכים קדימה זיהו מספר מרשים של גנים חשובים, הרבה עדיין לא זוכים להערכה על רשתות רגולציה הגנטיות אשר מתווכות מספר עצום של תהליכים. מסכים רבים שנעשה עד כה לא הגיע לרוויה, ולכן קדימה, כמו גם מסכי גנטיים הפוך נשארו אבן פינה לזהות ולנתח את מנגנונים של עובר. אמנם יש תובנות עצומות שניתן לדלות מכל קו מוטציה דג הזברה אחת, גורם מרכזי המגביל בתחום כבר היסטורי מאמץ הזמן רב המעורב בשיבוט positional. מסיבה זו, את זהותו של מוטציות כימית שגרמו רבות נותרה בגדר תעלומה. עם זאת, עם כניסתו האחרונה של גישות רצף הגנום כולו המאפשרות שיבוט מהיר 11-14, זיהוי יעיל מאוד של מוטציות גנטיות הוא עכשיו פהasible. המסך קדימה הטיפוסי בדג הזברה הוא מסך דיפלואידי שיכול לזהות מוטציות רצסיבי בתוך שלושה דורות 6,7 (איור 1, עזב את הטור). טכניקה זו כרוכה מוטציות יצירה בתאי הנבט של זכר ההורים (P), ולאחר מכן הזדווגות הזכר הזה עם נקבה מסוג בר. כל אחד מצאצאי הדור הראשון (F1) מהזדווגות זו תהיה נמל מוטציות ייחודיות אחד או יותר בשל תרומות כרומוזומליות של הגנום האבהי שעבר מוטציה. צאצאי F1 גדלים וoutcrossed עם סוגים פראיים ליצור משפחות F2. במשפחת F2, אחים יהיו גם סוג בר או נשאים הטרוזיגוטיים, והם incrossed באופן אקראי כדי ליצור ציפורני F3 שהם ניתחו לפנוטיפ (ים) של עניין. ציפורני F3 של נשאים הטרוזיגוטיים תכיל 25% סוג בר, הטרוזיגוטיים 50%, ו25% דגים מוטנטים הומוזיגוטים. סכימת הקרנה רבת דורית זו היא יעילה, עם זאת חסרון עיקרי אחד לזהpproach כולל את הזמן הדרוש כדי להתכונן למסך: לפחות 1 שנה של גידול דגים לבד מעורבת, שכן כל דור ודור דורש כ 3 חודשים כדי להגיע לבגרות מינית. מגבלות אחרות של סוג זה של מסך דיפלואידי הן העבודה, מרחב, ועלות דיור דורות הבאים. מסך הפלואידים הוא חלופה אחת שיכול לשמש לזיהוי ולאחר מכן לבודד מוטציות רצסיביות באמצעות אסטרטגיות mutagenesis דומות 15 (איור 1, עמודה ימנית). הייצור של עוברי דג הזברה הפלואידים תואר לראשונה לפני למעלה משנתי 30 16, ואת יכולתו של דג הזברה בדרך כלל דיפלואידי לפתח במשך כמה ימים עם ploidy כרומוזומליות הפלואידים נוצלה עבור מחקרים גנטיים רבים שכן זה זמן. היתרון העיקרי של מסך הפלואידים הוא ששיטה זו אינה כרוכה בגיוס משפחות F2 כדי למסך עבור אללים מוטציה רצסיבית. במקום זאת, נקבות דור F1 מוערכות עבורheterozygosity של מוטציות רצסיבית בתהליך של עניין על ידי בחינת צאצאי F2 במצב הפלואידים (איור 1, עמודה ימנית). בסך הכל, הצעדים כדי להשיג עוברי הפלואידים הם יחסית פשוטים (איור 2). לאחר ההכנה של הפתרונות הנחוצים לטיפול בזרע, ביצים מתקבלות מנקבות דור F1 על ידי מניפולציה ידנית כדי extrude (או &quot;לסחוט&quot;) את הביצים מהבטן. ברגע שהביצים מתקבלות, הם מופרה במבחנה על ידי חשיפה לקרינת אולטרה סגולית זרע (UV) מומת. הזרע המומת UV אינו מסוגלים לתרום DNA קיימא לביצה בשל העובדה שUV באורך הגל הקצר Crosslinks DNA האבהי. עם זאת, הזרע עדיין מסוגל לעורר פעילות ביצה ואירועים הקשורים בהתפתחות zygotic. עם ההפעלה מטבולית, הביצה תשלים מיוזה השנייה, ולהמשיך לפתח עם העותק הופקד אימהי רק אחד מכל chromosoשלי. בגלל ploidy 1N זה, העובר הוא בכפוף לתוצאות התפתחותיות של אלל מוטנטי רצסיבי, אם הוא קיים בכרומוזום אימהי. לכן כל מצמד הפלואידים F2 יכיל wildtype 50% ועוברי מוטציה 50% אם האם נשאית הטרוזיגוטיים של אלל רצסיבי penetrant באופן מלא. התפלגות זו של גנוטיפים עובריים מאפשרת בקלות יחסית במונחים של הערכת המצמד לנוכחותו של פנוטיפ מוטנטי (ים) של עניין. אם הפנוטיפ שיאתר כזו, המייסד הנשי דור F1 הוא outcrossed המשך לדג זברת זכר סוג בר ליצור ולגייס יותר נשאים הטרוזיגוטיים. בגלל זה הוא לא הכרחי להעלות מספר דורות כדי לבצע את המסך, החוקר יכול לחסוך זמן ניכר, עבודה, ובמרחב באקווריום, אבל עדיין יש לו את הכוח לסקור מספר משמעותי של הגנום המבוסס על מספר נקבות F1 נבדק. לפיכך, מסכי הפלואידים הם ריאלי במיוחד עבור מעבדות קטנות או פרויקטים שיזמו בabsencדואר של מימון משמעותי. עם זאת, ישנן מספר מגבלות וחסרונות לשימוש בhaploids. ראשית, עוברי דג הזברה הפלואידים חיים רק כמה ימים, ובדרך כלל למות בין 3 ל 5 ימים לאחר הפריה (DPF) 15. ניתן להבחין בין עוברי דג הזברה הפלואידים מdiploids מבוסס על כמה מאפיינים, ובראשם להיות גוף נמוך ומוצק שיש מספר הנורמלי של מגזרי somite 15,17 בכל זאת. כמו פיתוח מתקדם, מיצגי המוח מוגברים מוות של תאים וזרימת הדם לקוי, מזוהים בדרך כלל עם איגום דם על ידי 2-3 DPF ובצקת 15,17. יתר על כן, haploids מצליח לנפח 15,17 שלפוחית ​​השחייה. ללא קשר להבדלים מורפולוגיים אלה, רוב האיברים ורקמות גדולים נוצרים, כולל הלב, עיניים, ו15,17 notochord. תכונה אחת שצוין על ציפורני הפלואידים הוא שהם מכילים מגוון של פנוטיפים במונחים של סוגים שונים של עוברים &amp; # פגומים8212; תכונה שנצפתה על פני זני דג הזברה. לפיכך, יש לוודא אם הרקמה (ים) ונקודת העניין בזמן להראות התפתחות תקינה באופן סביר במתח הפלואידים הסוג בר, ולכן יש לו את הפוטנציאל להיות מוערך על פגמים גנטיים במסך או פרויקט מחקר אחר. למרות אתגרים אלו, מסכי הפלואידים יושמו בהצלחה לזיהוי גנים הנדרשים לתהליכי התפתחות מוקדמים בדג הזברה, ופרוטוקולים הפלואידים כבר מבוססים היטב משאבים בקהילה במשך שנים רבות 15-19. לאחרונה, התהליך של יצירת עוברי דגים הפלואידים נוצל בעבר על ידי חוקרים כדי ליצור גזע עוברי הפלואידים (ES) בתרביות תאים מדגי medaka 20,21. לאחר הייצור של עוברי הפלואידים medaka חוץ גופייה, העוברים המשמשים לחישוב תרביות תאים ראשוניים שpassaged ל-15 שבועות ואחריו עוד 5-8 שבועות כדי ליצור שיבוטים טהורים של תאים הפלואידים עםמאפייני תא ES 15-19. הדור של שורות תאי דגים הפלואידים ES טומן בחובו הבטחת עתיד רחבה לניתוח פנוטיפים רצסיבי בשושלות תאים בעלי חוליות, ומייצג גישה חדשה לניתוח גנטי בשנים הקרובות. כך, הדור של עוברי דגים הפלואידים יש גובר יישומים בקהילת המחקר ביו. מאמר וידאו זה מספק הדגמה ויזואלית של השלבים כרוכים ביצירת עוברי דג הזברה הפלואידים במבחנה באמצעות זרע מומת UV המבוסס על פרוטוקולים הוקמו 15-19,22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="797">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:99px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:364px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Hank&#39;s Stock Solution #1</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;">Hank&#39;s Stock Solution #2</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Hank&#39;s Stock Solution #4</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Hank&#39;s Stock Solution #5</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">1.23 g MgSO4-7H2O in 50 ml ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="88">
			<td height="88" style="height:88px;">Hank&#39;s Premix</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">Combine in the following order: (1) 10.0 ml HS#1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Store all HS Solutions and Premix at 4 degrees Celcius.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;">Hank&#39;s Stock Solution #6</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">0.35 g NaHCO3 in 10.0 mls ddH2O; make fresh on day of use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Hank&#39;s Final working solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">Combine 9.9 ml of Hank&#39;s Premix with 0.1 ml HS Stock #6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XX-Series UV Bench lamp</td>
			<td style="width:99px;">UVP</td>
			<td style="width:119px;">95-0042-05</td>
			<td style="width:364px;">Model XX-15S Bench Lamp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">XX Bench Stand (Adjustable)</td>
			<td style="width:99px;">UVP</td>
			<td style="width:119px;">18-0062-01</td>
			<td style="width:364px;">Model XX-15 Stand</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Embryo incubation dish</td>
			<td style="width:99px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">35-1005</td>
			<td style="width:364px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">50 X E3</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 X E3</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">Dilute 50 X E3 in distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645; SMZ1000</td>
			<td style="width:364px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization

דג הזברה הפכה מודל חוליות הזרם המרכזי שהוא רלוונטי לתחומים רבים של מחקר מדעי. דג הזברה מתאים במיוחד גם לניתוח גנטי קדימה של תהליכים התפתחותיים עקב ההפריה שלהם החיצונית, גודל עוברי, ontogeny המהיר, ובהירות אופטית - מערך של תכונות המאפשרות תצפית הישירה של אירועים החל gastrulation לorganogenesis עם סטראו בסיסי. יתר על כן, עוברי דג הזברה יכולים לשרוד במשך כמה ימים במדינה הפלואידים. הייצור של עוברי הפלואידים במבחנה הוא כלי רב עוצמה לניתוח מוטאציות, כפי שהיא מאפשרת זיהוי של אללים מוטציה רצסיבית הנמצא בדור הראשון (F1) נושאות נשיות הבאות mutagenesis בדור ההורים (P). גישה זו מבטלת את הצורך להעלות את מספר דורות (F2, F3 וכו &#39;) הכולל רבייה של משפחות שעברו מוטציה, ובכך לחסוך הזמן חוקר יחד עם הפחתההצרכים למרחב דג הזברה מושבה, עבודה ועלויות גידול. למרות שהדג זברה שימשה לנהל קדימה מסכי בעשורים האחרונים, חלה הרחבה מתמדת של כלים לעריכה מהונדסים וגנום. כלים אלה עכשיו מציעים שפע של דרכים ליצירת מבחני ניואנסים למסכי דור הבאים שיכול לשמש כדי לנתח עוד יותר את רשתות הרגולציה גנים המניעים את חוליות ontogeny. כאן, אנו מתארים כיצד להכין עוברי דג הזברה הפלואידים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם למסכי רומן עתיד הפלואידים, כמו במסכים משפר ומדכאים, כדי לטפל במנגנונים של פיתוח למספר רחב של תהליכים ורקמות היוצרים בשלבים עובריים מוקדמים.

הייצור של עוברי הפלואידים ניתן ליישם כדי לזהות מוטציות רצסיבי בדור F2 כאשר haploids מתקבלים מנקבות דג הזברה בוגרות, כי הם הצאצאים של הורי mutagenized (איור 1). זה חוסך זמן ומרחב בהשוואה למסך דיפלואידי המסורתי, שבו חוקרים צריכים להעלות משפחות F2 שדיפלואידי צאצאים לאחר מכן העריכו לפנוטיפים של עניין (איור 1). השלבים העיקריים בפרוטוקול מתואר בשלבי 1-5 לעיל לקבלת עוברי הפלואידים דג הזברה באמצעות הפריה חוץ גופית הם schematized כתרשים זרימה (איור 2). צעדים אלו, כרוכים בהכנה של פתרונות ויחולו נשים על ידי חשיפה להורמונים זכריים בטנקי הזדווגות (יום 1), ואחריו זרע וביצית ורכש בהפריה חוץ גופית (יום 2), ולבסוף גידול של haploids (ימי 3-5) (איור 2). כאשר combined עם מסך גנטי, הליך mutagenesis נפוץ בדג הזברה כולל חשיפה קודמת של המבוגרים סוג בר דג הזברה הזכר לmutagen (למשל, לmutagen כימי כמו ENU, למרות שהליכים אחרים, כגון mutagenesis רטרווירלי מבוסס יכולים להיות מיושמים שגם להקל על שיבוט של פגם כרומוזומלי), ואחרי רבייה עם נקבות סוג בר ליצור דור F1 mutagenized. היערכות כזו דורשת מספר חודשים של עבודה (כ 6 חודשים) המבוססת על זמני הדור נזקקו לסוגים האחוריים פראיים, לבצע mutagenesis, ומאחור F1 15,17,22 mutagenized שלאחר מכן. נקודה חשובה נוספת לשיקול בהעסקת haploids למסך היא הבחירה של זן דג הזברה. זן AB * (כוכבית א.ב.) הפך ידוע להפקת עוברים הפלואידים עם מאפיינים טובים יותר כולל ובריאות יותר מאשר זנים אחרים 15. עם זאת, בזן טובינגן נגזר גידל בlaboraטורים, יש לנו לאחרונה נצפו תכונות עובריות שאפשרו מסכי מוצלחים עבור חריגות התפתחותית של מערכת הכליות (ג&#39;גרלך ור &#39;Wingert, לא פורסם). זכרים מתח למבוגרים דג הזברה טובינגן היו mutagenized על ידי סדרה של שלושה טיפולי ENU, ולאחר מכן עברו לנקבות טובינגן סוג בר לייצר דור F1 להקרנה. נקבות F1 נדחקו כדי להשיג ביצים וביצי F2 אלה הופרו בזרע UV מומת. בהשוואה לציפורני דיפלואידי מתקבלות על ידי הזדווגויות טבעיות של הורים מסוג בר טובינגן (איור 3 א), עובר בציפורני מתח אלה הפלואידים טובינגן מוצג אופייני קצר יותר, מוצק תא מטען של המדינה הפלואידים (3B דמויות, C). יתר על כן, ציפורניים הפלואידים בדרך כלל מורכבת של אחים עובר המציגים מגוון רחב של פגמים, שבו צפה, כמו גם (3B דמויות, C), אשר ידוע להשתנות בתוך זנים, כפי שנדון בהמשך 15,17. </p&gt; מחקרים קודמים קבעו שורה לדירוג הקנונים, המקביל לכיתות א &#39;עד ד&#39;, לסווג את מגוון רחב של פגמים פנוטיפ הפלואידים 15,17, ובנוסף haploids יש גם מכונה במונחים של התארים באיכות טובה, בינונית וגרועה 22. haploids כיתה, המקביל ל haploids באיכות גבוהה, הם הכי נורמלי במראה, עם גוף קצר ומוצק אבל בסך הכל מראה מראה מורפולוגיים דומה לdiploids 15,17,22 (השווה אחים דיפלואידי (ד) לכיתה הפלואידים (שכותרתו א) אחים, איור 3 ב). עוברי כיתה הפלואידים גם לפתח בצקת קרום הלב צנועה, אשר היא תכונה אופיינית של פיתוח דג הזברה הפלואידים 15,17,22 (איור 3 ב). בהשוואה לhaploids כיתה, עוברי הפלואידים כיתה ב &#39;ביניים או מה שנקרא (ב שכותרתו, דמויות 3B, C) ​​נבדל ביניהם בפיתוח של עוד קיצר או מפותל / twisתא מטען טד, אם כי תכונות של ראש וזנב הם באופן ברור 15,17,22 להבחין. לבסוף, haploids C כיתה או באיכות ירודה (גם מופיע בכמה הפניות כמו C / D) 15,17,22 מאוד פגומים ולהציג המוני מאורגנת של תאים בהתאחדות עם חלמון כדור (C שכותרת, איור 3 ג). גם בקרב אותו הזן, מצמדים הפלואידים להשתנות בחלוקת פנוטיפים A, B, ו-C שאחד לא רואה. למשל, המצמד הפלואידים מנקבה אחת טובינגן מוצג התפתחות טובה יותר בסך הכל, עם בעיקר וצאצאים הפלואידים רמת B (איור 3 ב) בהשוואה לhaploids מתקבל מנשי טובינגן שנייה, המצמד שכן היה מורכב מצאצאים הפלואידים C כיתה רבים ופנוטיפים B הפלואידים (איור 3 ג). השתנות זן דומות של ציוני עובר הפלואידים כבר נצפו בעבר בדגי זן AB ו AB * כמו גם 15. למרות מור אלההבדלי phological, organogenesis של מבנים רבים ממשיך יחסית בדרך כלל בעובר הפלואידים. אמנם יש להם תא מטען, פיתוח גוף קצר יותר של איברים כמו העיניים ולב הוא יחסית דומה לזה של עוברי דיפלואידי סוג בר, והוא יכול גם להעריך סוגי תאים כמו תאי פיגמנט (melanophores וxanthophores) 15. בנוסף, יש לנו תיעדנו לאחרונה כי הכליה ראשית, או בכליות עוברית, שפותחה על ידי ביום 1 לאחר הפריה בהפלואידים הסוג בר, בדומה לdiploids סוג בר. כראיה לכך, דפוסים סוג תא כליה ראשית מציג את הדפוס הטיפוסי של מגזרים (איור 4). יתר על כן, את הפנוטיפ של מוטציות רצסיבי שמשנות את התפתחות כליה ראשית, כמו המוטציה lib שמפחיתה את ייצור חומצה רטינואית, הראה דפוס דומה במדינה הפלואידים בהשוואה למצב דיפלואידי (איור 4) 23,24. תצפית זו עולה בקנה אחד עם זה של reces האחרsive מוטציות המובילות לפנוטיפים דומים בשני תנאי הפלואידים ודיפלואידי, אם כי זה לא תמיד מקרה עם כל המוטציות וצריך לזכור אם הערכת סוג זה של אסטרטגית מסך 15. מספר הרקמות והאיברים הם בדרך כלל לא נורמלים בhaploids. לדוגמא, haploids להציג פגמים במחזור, בדרך כלל מציגים איגום דם, מה שעשוי להפוך את היכולת שלהם ללמוד כמה היבטים של vasculogenesis מוגבלת 15. בנוסף, זה כבר ציין כי haploids יכול להיות אי סדרים בהתפתחות אוזן, כזה שהם יכולים להיות מוערכים על מוטציות המונעות היווצרות שלפוחית ​​otic לגמרי, אבל לא למוטציות המשפיעות על תהליכים עדינים מעורבים עם המורפוגנזה של מבנה זה 15. כדוגמא נוספת לזה, המורפוגנזה המוח היא חריגה בhaploids, ולכן מסכים הפלואידים לזהות מסלולי התפתחות המוח הנדרשים מוגבל 15. למרות מגבלות אלה, שלנוnalysis של התפתחות כליה במדינה הפלואידים (איור 4) מוסיף איבר זה לרשימה של מבנים עובריים &#39;screenable&#39;. ממצא זה מדגיש כי המתודולוגיה מסך הפלואידים יכולה לשמש גם כדי לנתח את המרכיבים הגנטיים של דפוסים אב כליות ומוסיפה דגש לסנטימנט שגישות מסך גאוני יכולות לעקוף את המגבלות של ontogeny עובר הפלואידים לחשוף דגמי מוטציה חדשים יקרים ללמוד פיתוח חוליות 15. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51708/51708fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. סכמטי של אסטרטגיות מסך דיפלואידי והפלואידים במודל דג הזברה. בעקבות mutagenesis של דור ההורים, דור F1 יכול להיות מורם ומשמש גם ליצירת משפחות המוטציה F2 המשמשים מסך דור F3 במצב דיפלואידי (משמאל ) או ישירות מסךאד באסטרטגיה הפלואידים (מימין). במסך הפלואידים, נקבות דור F1 לבגרות מינית הם משמשים לאיסוף ציפורני F2 הפלואידים לניתוח גנטי. נשאים הטרוזיגוטיים נקבה מזוהים אם כמחצית מhaploids F2 להציג פנוטיפ מוטנטי (עוברים אדומים) בהשוואה לאחי הסוג בר הפלואידים (עוברים צהובים). <img alt="איור 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51708/51708fig2highres.jpg" width="400" /> תרשים זרימת איור 2. הפלואידים עובר ייצור. השלבים העיקריים של הפריה במבחנה כדי לייצר עוברי הפלואידים הם schematized כמשימות שבוצעו ביום 1 (תיבות הוורודות) כדי להכין פתרונות זרע ומבוגר ראש נקבות, משימות שבוצעו על דג הזברה 2 (קופסות כתומות היום ) לאסוף וזרע להשבית UV, לאסוף ביצים, כדי להפרות את הביצים עם זרע UV מומת ליצור haploids, ולאחר מכן להחיות את הנקבה האם, וfinallמשימות y בוצעו בימים שלאחר מכן 3-5 (תיבה צהובה) כאשר הציפורניים מודגרת לנקודה הרצויה בזמן (ות) עבור התבוננות וניתוח. <img alt="איור 3" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51708/51708fig3highres.jpg" width="300" /> איור 3. השוואה של עוברי דג הזברה זן דיפלואידי והפלואידים טובינגן. א) עובר סוג בר דיפלואידי יוצרו על ידי השרצה טבעית ולאחר מכן הודגרו עד כ 30 hpf. B, עובר סוג בר C) הפלואידים יוצרו על ידי הפריה חוץ גופית של ציפורניים המתקבלות מנקבות mutagenized דור F1 עם זרע מומת UV, וטופחו עד כ 30 hpf. Haploids הציג מגוון רחב של הפרעות בהתפתחות בהשוואה לעוברי דיפלואידי סוג בר (ראשי חץ שחורים, ד כדי לציין דיפלואידי). היה לי haploids הנורמלי יחסית קיצרתי, הגוף של המניה יותר דומה לתכנית לדירוג של15 הפלואידים (ראשי חץ אדומים, שכותרתו), ואילו haploids עם מומים גולמי הציג ציר קשה קטוע גוף (ראשי חץ סגולים, ב &#39;שכותרתו) מקביל לכיתה של ב&#39;, ולבסוף C כיתה (ראשי חץ כחולים, C שכותרתו) המבוסס על תיאורים שפורסמו 15. כל העוברים צולמו בשידור חי בהגדלת 2.5x. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51708/51708fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4. דפוסים התפתחותית של סוגי תאים המרכיבים את האיברים כליות עובריים הכליה ראשית בדג זברת מתח טובינגן הפלואידים. סוגים הפלואידים פראיים מוצג דפוס נורמלי של סוגי תאים במבנה העוברי הכליות (שורה העליונה). הכליה העוברית מורכבת של זוג יחידות תפקודיות מפולחות הידועה בשם nephrons. הדפוס המפולח של סוגי תאים בדידים הווה בnephrons ניתן דמיינו מבוסס על ההר השלם <eמ&gt; בדפוס ביטוי הכלאה באתרו של תעתיקי גנים שהנם ייחודיים לסוגי תאי נפרון מבודלים, הכוללים podocytes (P) בסימן wt1b וnephrin, אבובית הפרוקסימלי המפותלת (PCT) בסימן slc20a1a, אבובית ישר פרוקסימלי (PST ) מסומן על ידי trpm7, דיסטלי מוקדם (DE) בסימן slc12a1, ואבובית סוף דיסטלי (DL) בסימן slc12a3. עוברי lib הפלואידים מוטציה (podocytes תצוגה בשורה התחתונה) מופחת, PCT וPST נעדר, יחד עם DE מורחב וקטע DL, בדומה לעוברי lib דיפלואידי 18. עוברים צולמו בתצוגת הגבי, עם קדמי בצד השמאל, בהגדלת 10X.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization at JoVE.com

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

ייצור של הפלואידים עוברי דג הזברה על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; הפריה

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

24.4K Views.  University of Notre Dame. The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Video: Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג&#39;ין

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

יצירת עוברים דג הזברה chimeric על ידי השתלה

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

שיטת תפוקה גבוהה עבור cryopreservation זרע דג הזברה במבחנה הפריה

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

הדמיה Glycans בעוברים דג הזברה על ידי תיוג מטבולית וכימיה לחץ Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

ניתוח פרופיל המטבולי של עוברי דג זברה

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

ניתוח של אפופטוזיס בעוברי דג הזברה על ידי כל הר Immunofluorescence לזיהוי caspase הופעל 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

ניתוח של סטרס חמצוני בעוברי דג הזברה

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...